Serovar Salmonella Enterica khi không có gen TtrA và PduA tăng cường phản ứng miễn dịch tế bào trong quá trình nhiễm trùng gà con

Salmonella spp. là một trong những mầm bệnh lây truyền qua thực phẩm chính, gây thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi gia cầm và gây hậu quả cho sức khỏe cộng đồng. Cả khả năng sống sót của mầm bệnh trong môi trường đường ruột trong quá trình viêm cũng như mối quan hệ của chúng với hệ thống miễn dịch của vật chủ đều đóng vai trò quan trọng trong quá trình lây nhiễm ở gia cầm. Mục tiêu của nghiên cứu này là định lượng sự hiện diện của các đại thực bào và quần thể tế bào CD4+ /CD8+ bằng cách sử dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch, trong các dòng gà thương mại được gây nhiễm thực nghiệm bởi các chủng Salmonella hoang dại và đột biến. Enteritidis và Salmonella Typhimurium thiếu gen ttrA và pduA. Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA gây ra tỷ lệ phần trăm diện tích bị nhuộm màu cao hơn so với loại hoang dã, ngoại trừ gà mái đẻ nhẹ. Chủng loại hoang dã Salmonella Typhimurium và nhiễm trùng Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA dẫn đến một mô hình tương tự, trong đó, ở mức 1 và 14 dpi, manh tràng và hồi tràng của gia cầm cho thấy vùng nhuộm màu rõ ràng hơn so với 3 và 7 dpi. Trong tất cả các dòng được nghiên cứu, người ta đã quan sát thấy sự xâm nhập rõ rệt của các đại thực bào so với tế bào CD4+ và CD8+. Nhìn chung, động vật bị nhiễm chủng đột biến có vùng nhuộm màu tích cực cao hơn so với chủng hoang dã. Việc xóa cả hai gen ttrA và pduA dẫn đến sự xâm nhập mạnh mẽ hơn của các đại thực bào và tế bào CD4+ và CD8+ ở chim chủ, cho thấy không có sự suy giảm mầm bệnh, ngay cả ở các chủng Salmonella khác nhau.

lợi ích cistanche cho nam giới tăng cường hệ thống miễn dịch

Salmonella enterica là mầm bệnh từ thực phẩm gây thiệt hại cho vật nuôi cũng như tác động trực tiếp đến sức khỏe cộng đồng. Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (Salmonella Enteritidis) và Typhimurium (Salmonella Typhimurium) chủ yếu liên quan đến nhiễm trùng thực phẩm trong nhiều thập kỷ. Từ năm 1995 đến năm 2010, Salmonella Enteritidis được xác định trong 34,2% tổng số mẫu dương tính với Salmonella spp1. Bên cạnh đó, Winter và cộng sự.2 đã công bố một nghiên cứu quan trọng điều tra vai trò của gen mã hóa tetrathionate, chọn kiểu huyết thanh Salmonella Typhimurium nhưng sử dụng chuột làm mô hình thử nghiệm. Nếu tính đến điều này, việc đào sâu kiến ​​thức của chúng ta về tương tác giữa vật chủ và mầm bệnh có thể giúp cải thiện các phép đo kiểm soát và diệt trừ. Một số yếu tố liên quan đến sinh bệnh học của bệnh salmonellosis, chẳng hạn như khả năng mầm bệnh nhân lên trong môi trường nhầy bị viêm, tùy thuộc vào việc hấp thụ chất dinh dưỡng và hô hấp kỵ khí2. Tuy nhiên, lượng chất dinh dưỡng sẵn có không đảm bảo sự sống sót của vi khuẩn trong môi trường cạnh tranh với mật độ dày đặc của các vi sinh vật khác. Do đó, khả năng Salmonella enterica chuyển hóa tetrathionate bằng cách sử dụng tetrathionate reductase để tạo ra 1,2-propanediol làm nguồn năng lượng mang lại lợi thế về thể lực. Enzyme này được cấu thành bởi TtrA, TtrB và TtrC. Tiểu đơn vị đầu tiên được trích dẫn thuộc siêu họ molybdopterin (MPT) và có miền giới hạn FeS có liên quan đến việc khử tetrathionate thành thiosulfate (S2O3 2-)2–4. Te 1,2-propanediol được sử dụng bởi các vi ngăn vi khuẩn (MCP). Cấu trúc này được cấu thành từ bảy loại protein khác nhau, trong đó PduA là thành phần chính của cấu trúc MCP5. Đầu tiên, 1,{18}}propanediol được chuyển đổi thành propionaldehyde, sau đó chất này bị khử thành propanol và propionate nhờ hoạt động của propanediol dehydratase. Quá trình này tạo ra ATP bằng quá trình phosphoryl hóa, một gradient điện tử ({19}}propanol) để tái tạo NAD và một chất trung gian (propionyl-CoA) có thể được sử dụng làm nguồn cacbon và năng lượng trong suốt metyl citrat thông qua, phụ thuộc vào vitamin B12 được tổng hợp theo cách nội sinh6. Trong quá trình nhiễm trùng ở gà, khả năng các huyết thanh Salmonella enterica xâm nhập và tồn tại trong các tế bào biểu mô ruột và đại thực bào dẫn đến sự trốn tránh phản ứng miễn dịch7. Trong bối cảnh đó, nhiễm trùng là một giai đoạn quan trọng phụ thuộc vào sự tương tác giữa vi khuẩn và tế bào vật chủ cũng như khả năng vi khuẩn vượt qua hàng rào biểu mô ruột để đảm bảo sự xâm chiếm và nhân lên của vi khuẩn. Tuy nhiên, nó kích hoạt các phản ứng viêm và miễn dịch8 dẫn đến hiện tượng nhập bào và thực bào bởi các tế bào biểu mô và tế bào trình diện kháng nguyên (APC), tương ứng. Hoạt động kháng khuẩn của các tế bào này kích hoạt phản ứng bẩm sinh thông qua đại thực bào và tổ hợp phản ứng miễn dịch thích nghi phụ thuộc vào hoạt hóa CD4+ và CD8+9. Để làm sáng tỏ mối tương tác giữa vật chủ và mầm bệnh đằng sau tình trạng nhiễm trùng đường ruột do Salmonella ở gà, chúng tôi đánh giá quần thể tế bào của hệ thống miễn dịch trong quá trình xâm chiếm đường ruột và nhiễm trùng toàn thân ở các loài gia cầm thuộc dòng thương mại bị thách thức bởi các chủng đột biến kiểu hoang dã của Salmonella Enteritidis và Salmonella Typhimurium , mang lại sự xóa bỏ các gen liên quan đến quá trình chuyển hóa tetrathionate (ttrA) và 1,2-propanediol (PDU).

cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch

Kết quả

Thí nghiệm 1—Thử thách Salmonella Enteritidis.

Kết quả định lượng sự hiện diện của các tế bào đáp ứng miễn dịch ở amidan manh tràng, manh tràng, hồi tràng và gan của gà thịt, gà đẻ nhẹ và gà đẻ hơi nặng được trình bày trong Bảng 1, 2 và 3. Chúng tôi tìm thấy nhiều CD hơn 4+ và sự xâm nhập của tế bào đại thực bào từ gà thịt bị nhiễm vi khuẩn Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA (SEΔttrAΔpduA) so với từ gà thịt bị nhiễm vi khuẩn Salmonella Enteritidis chủng dại (wt-SE) hoặc gia cầm không bị nhiễm bệnh, trong tất cả các mô được đánh giá. Một ngoại lệ đã được tìm thấy đối với sự thâm nhiễm tế bào CD4+ ở mức 3 dpi ở amidan manh tràng, hồi tràng và gan, cũng như sự xâm nhập của đại thực bào ở mức 3 và 14 dpi trong gan từ gà thịt bị nhiễm SEΔttrAΔpduA. Hơn nữa, số lượng tế bào CD8+ xâm nhập được quan sát thấy với số lượng lớn hơn ở những gia cầm được thử thách với SEΔttrAΔpduA ở mức 1 và 7 dpi ở manh tràng và gan, ở mức 3 dpi ở amidan manh tràng và 14 dpi ở hồi tràng. Ngược lại, những gia cầm bị thách thức wt-SE có mức độ thâm nhiễm cao của các tế bào CD8+ ở hồi tràng và manh tràng ở mức tương ứng là 1 và 7 dpi (Bảng 1; Hình bổ sung S1). Bảng 2 và Hình bổ sung S2 cho thấy CD4+ và CD8+ cũng như sự xâm nhập của đại thực bào được tìm thấy trong các mô của gà đẻ hơi nặng. Nhìn chung, có sự khác biệt lớn giữa các vùng thâm nhiễm tế bào liên quan đến cả chủng vi khuẩn gây bệnh và các mô được nghiên cứu. Những con chim được thử thách với SEΔttrAΔpduA cho thấy các khu vực cao hơn được bao phủ bởi các tế bào CD4+ (ở hồi tràng ở mức 1 và 14 dpi, và gan ở mức 7 dpi) và đại thực bào (ở hồi tràng ở mức 7 dpi và gan ở mức 3, 7 và 14 dpi), so với trong cùng một mô của gia cầm bị thách thức wt-SE. Mặt khác, tế bào CD8+ được tìm thấy với số lượng lớn hơn ở amidan manh tràng (ở mức 1 và 7 dpi) và manh tràng (ở mức 3 dpi) của những gia cầm bị thử thách với chủng wt-SE. Được quan sát khác biệt ở gà thịt và gà con đẻ nặng, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA đã kích hoạt các vùng tế bào phản ứng miễn dịch ít mạnh hơn so với loại gà hoang dã, trong thử thách từ gà mái đẻ nhẹ. Những gà bị thách thức Wt-SE cho thấy vùng thâm nhiễm CD4+ lớn hơn ở amidan manh tràng (ở 1 và 3 dpi), manh tràng (ở 3, 7 và 14 dpi), hồi tràng (ở 1 và 7 dpi) và gan (ở 14 dpi). Tương tự, những thách thức với SEΔttrAΔpduA đã làm giảm diện tích thâm nhiễm của cả CD8+ ở amidan manh tràng (ở 1 dpi) và hồi tràng (ở 7 và 14 dpi), cũng như các đại thực bào ở amidan manh tràng và manh tràng (ở 3 dpi), so với các loài chim bị thách thức wt-SE. Không quan sát thấy sự thay đổi đáng kể về vùng tế bào hệ thống miễn dịch của CD8+ và tế bào đại thực bào ở gan của cả gia cầm bị thử thách SEΔttrAΔpduA và wt-SE. Kết quả chi tiết của thử thách với gà mái đẻ nhẹ được thể hiện trong Bảng 3 (xem Hình bổ sung S3).

Bảng 1. Trình bày sự khác biệt đáng kể liên quan đến sự phân bố số lượng của các tế bào đáp ứng miễn dịch khác nhau trong các cơ quan của gà thịt bị nhiễm các chủng Salmonella Enteritidis hoang dã và đột biến ở những ngày khác nhau sau khi nhiễm bệnh. PPI, số ngày sau nhiễm bệnh; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis hoang dại; ns, không có sự khác biệt đáng kể. Trong mỗi cơ quan và CPI, * biểu thị sự khác biệt theo ANOVA hai chiều, sau đó là thử nghiệm so sánh của Bonferroni giữa các giá trị chủng hoang dã và chủng đột biến (*P Nhỏ hơn hoặc bằng 0.05; **P Ít hơn hơn hoặc bằng 0.01; ***P Nhỏ hơn hoặc bằng 0,001; ****P Nhỏ hơn hoặc bằng 0,0001). Chủng Te được trình bày trong bảng (∆-SE hoặc wt-SE) là có ý nghĩa quan trọng trong cơ quan và PP cho thấy vùng xâm nhập chính đến từng tế bào.

Bảng 2. Sự thể hiện sự khác biệt đáng kể liên quan đến sự phân bố số lượng của các tế bào đáp ứng miễn dịch khác nhau trong các cơ quan của gà mái đẻ nặng bị nhiễm các chủng Salmonella Enteritidis hoang dã và đột biến ở những ngày khác nhau sau khi bị nhiễm bệnh. PPI, số ngày sau nhiễm bệnh; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis hoang dại; ns, không có sự khác biệt đáng kể. Trong mỗi cơ quan và CPI, * biểu thị sự khác biệt theo ANOVA hai chiều, sau đó là thử nghiệm so sánh của Bonferroni giữa các giá trị chủng hoang dã và chủng đột biến (*P Nhỏ hơn hoặc bằng 0.{{10}}5 ; **P Nhỏ hơn hoặc bằng 0,01; ***P Nhỏ hơn hoặc bằng 0,001; ****P Nhỏ hơn hoặc bằng 0,0001). Chủng Te được trình bày trong bảng (∆-SE hoặc wt-SE) là có ý nghĩa quan trọng trong cơ quan và PP cho thấy vùng xâm nhập chính đến từng tế bào.

Bảng 3. Trình bày sự khác biệt đáng kể liên quan đến sự phân bố số lượng của các tế bào đáp ứng miễn dịch khác nhau trong các cơ quan của gà mái đẻ nhẹ bị nhiễm các chủng Salmonella Enteritidis hoang dã và đột biến ở những ngày khác nhau sau khi nhiễm bệnh. PPI, số ngày sau nhiễm bệnh; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis hoang dại; ns, không có sự khác biệt đáng kể. Trong mỗi cơ quan và PP, * có nghĩa là sự khác biệt theo ANOVA hai chiều, sau đó là thử nghiệm so sánh của Bonferroni giữa các giá trị chủng hoang dã và chủng đột biến (*P Nhỏ hơn hoặc bằng 0.{{10}}5 ; **P Nhỏ hơn hoặc bằng 0,01; ***P Nhỏ hơn hoặc bằng 0,001; ****P Nhỏ hơn hoặc bằng 0,0001). Chủng được trình bày trong bảng (∆-SE hoặc wt-SE) có ý nghĩa quan trọng trong cơ quan và PP cho thấy vùng xâm nhập chính đến từng tế bào.

cistanche thực vật tăng cường hệ thống miễn dịch

Nhấn vào đây để xem các sản phẩm Tăng cường miễn dịch Cistanche

【Hỏi thêm] Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Thí nghiệm 2—Thử thách Salmonella Typhimurium.

Kết quả định lượng sự hiện diện của các tế bào đáp ứng miễn dịch ở amidan manh tràng, manh tràng, hồi tràng và gan của gà thịt, gà đẻ nặng vừa và gà đẻ nhẹ được trình bày lần lượt trong Bảng 4, 5 và 6. Nhìn chung, gà thịt bị nhiễm chủng đột biến có diện tích được đánh dấu dương tính cao hơn so với những gà thử thách với chủng loại hoang dã Salmonella Typhimurium (wt-STM), trong cả bốn ngày lấy mẫu. Hơn nữa, không có sự thay đổi nào của các tế bào phản ứng miễn dịch được quan sát thấy ở các nhóm đối chứng không bị nhiễm bệnh. Các vùng tế bào Te CD4+ trong tất cả các mô của gà thịt đã đạt đến sự khác biệt thống kê ở mức 1 dpi, với mức độ xâm nhập lớn hơn đối với thử thách với Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA (STM∆ttrA∆pduA). Có sự khác biệt đáng kể giữa diện tích đáp ứng miễn dịch được định lượng từ các gia cầm bị nhiễm STM∆ttrA∆pduA- và wt-STM, với sự xâm nhập lớn hơn khi thử thách với chủng đột biến ở manh tràng và hồi tràng ở mức 1 dpi, và ở gan. ở mức 14 dpi (CD{13}} ô); ở manh tràng, hồi tràng và gan ở mức 1 và 14 dpi (đại thực bào) (Bảng 4; Hình bổ sung S4). Kết quả Te từ những gia cầm đẻ nhẹ cho thấy không có sự khác biệt thống kê giữa thử thách chủng đột biến và chủng hoang dã đối với tế bào CD4+ ở manh tràng và tế bào CD8+ ở manh tràng manh tràng và hồi tràng trong cả 4 ngày đánh giá sau nhiễm trùng (Bảng 5; Hình bổ sung. S5). Tuy nhiên, khi quan sát thấy một khu vực tập trung đáng kể của các tế bào hệ thống miễn dịch, gà mái đẻ hơi nặng đã bị thách thức bởi STM∆ttrA∆pduA: khu vực xâm nhập của các đại thực bào chính vào tất cả các mô được nghiên cứu (ở mức 1 và 14 dpi); một khu vực xâm nhập chính của tế bào CD 4+ trong manh tràng và gan (ở 1, 7 và 14 dpi) (Bảng 5; Hình bổ sung. S5). Bảng 6 và Hình bổ sung S6 cho thấy sự xâm nhập của CD4+, CD8+ và đại thực bào được tìm thấy trong các mô của gà mái đẻ nhẹ. Những con chim được thử thách với STM∆ttrA∆pduA cho thấy diện tích tế bào hệ thống miễn dịch chính của CD4+ và tế bào đại thực bào ở amidan manh tràng và manh tràng (ở 14 dpi) và hồi tràng (ở 1 và 14 dpi) so với các tế bào phản ứng miễn dịch diện tích của cùng một mô từ những gia cầm bị nhiễm wt-STM. Không có sự khác biệt thống kê về vùng thâm nhiễm CD8+ được tìm thấy ở amidan manh tràng, manh tràng và hồi tràng ở những con gà bị gây nhiễm bệnh. Ngược lại với kết quả thu được ở các mô khác, gan của những gia cầm bị thử thách STM∆ttrA∆pduA có vùng tế bào phản ứng miễn dịch được nhuộm màu biểu cảm hơn đối với các tế bào CD4+ và CD8+ ở cả 4 dpi, và đại thực bào ở mức 1 và 14 dpi.

Bảng 4. Biểu thị sự khác biệt đáng kể liên quan đến sự phân bố số lượng của các tế bào đáp ứng miễn dịch khác nhau trong các cơ quan của gà thịt bị nhiễm các chủng Salmonella Typhimurium hoang dã và đột biến ở những ngày khác nhau sau khi nhiễm bệnh. PPI, số ngày sau nhiễm bệnh; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, loại hoang dã Salmonella Typhimurium; ns, không có sự khác biệt đáng kể. Trong mỗi cơ quan và CPI, * biểu thị sự khác biệt theo ANOVA hai chiều, sau đó là thử nghiệm so sánh của Bonferroni giữa các giá trị chủng hoang dã và chủng đột biến (*P Nhỏ hơn hoặc bằng 0.05; **P Ít hơn hơn hoặc bằng 0.01; ***P Nhỏ hơn hoặc bằng 0,001; ****P Nhỏ hơn hoặc bằng 0,0001). Chủng Te được trình bày trong bảng (∆-STM hoặc wt-STM) là có ý nghĩa quan trọng trong cơ quan và PP cho thấy vùng xâm nhập chính đến từng tế bào.

Bảng 5. Biểu thị sự khác biệt đáng kể liên quan đến sự phân bố số lượng của các tế bào đáp ứng miễn dịch khác nhau trong các cơ quan của gà mái đẻ nặng bị nhiễm các chủng Salmonella Typhimurium hoang dã và đột biến ở những ngày khác nhau sau khi nhiễm bệnh. PPI, số ngày sau nhiễm bệnh; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, loại hoang dã Salmonella Typhimurium; ns, không có sự khác biệt đáng kể. Trong mỗi cơ quan và CPI, * biểu thị sự khác biệt theo ANOVA hai chiều, sau đó là thử nghiệm so sánh của Bonferroni giữa các giá trị chủng hoang dã và chủng đột biến (*P Nhỏ hơn hoặc bằng 0.{{10}}5 ; **P Nhỏ hơn hoặc bằng 0,01; ***P Nhỏ hơn hoặc bằng 0,001; ****P Nhỏ hơn hoặc bằng 0,0001). Chủng Te được trình bày trong bảng (∆-STM hoặc wt-STM) là có ý nghĩa quan trọng trong cơ quan và PP cho thấy vùng xâm nhập chính đến từng tế bào.

Bảng 6. Biểu thị sự khác biệt đáng kể liên quan đến sự phân bố số lượng của các tế bào đáp ứng miễn dịch khác nhau trong các cơ quan của gà mái đẻ nhẹ bị nhiễm các chủng Salmonella Typhimurium hoang dã và đột biến ở những ngày khác nhau sau khi nhiễm bệnh. PPI, số ngày sau nhiễm bệnh; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, loại hoang dã Salmonella Typhimurium; ns, không có sự khác biệt đáng kể. Trong mỗi cơ quan và PP, * có nghĩa là sự khác biệt theo ANOVA hai chiều, sau đó là thử nghiệm so sánh của Bonferroni giữa các giá trị chủng hoang dã và chủng đột biến (*P Nhỏ hơn hoặc bằng 0.{{10}}5 ; **P Nhỏ hơn hoặc bằng 0,01; ***P Nhỏ hơn hoặc bằng 0,001; ****P Nhỏ hơn hoặc bằng 0,0001). Chủng được trình bày trong bảng (∆-STM hoặc wt-STM) có ý nghĩa quan trọng trong cơ quan và PP cho thấy khu vực xâm nhập chính đến từng tế bào.

Cuộc thảo luận

Vi khuẩn khi tiếp xúc với điều kiện kỵ khí có thể sử dụng chất nền trao đổi chất tetrathionate và 1,{1}}propanediol để làm nguồn năng lượng và hô hấp10. Vì vậy, Salmonella spp. từ lâu đã là đối tượng của các cuộc điều tra về việc việc xóa các gen được biết là chịu trách nhiệm về những con đường này sẽ ảnh hưởng như thế nào đến sự tồn tại của chúng trong vật chủ. Theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, chỉ có một nghiên cứu nghiên cứu đồng thời vai trò gen mã hóa tetrathionate và propanediol được công bố. Nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã báo cáo tác động của việc loại bỏ này bằng cách đánh giá sự lây nhiễm toàn thân và sự bài tiết qua phân của Salmonella Enteritidis và Salmonella Typhimurium trong các dòng gà con thương mại11. Để tăng cường thảo luận về chủ đề này, các kết quả hiện tại nêu bật tế bào miễn dịch xâm nhập vào các mô khác nhau của dòng gà con được thử thách với cả chủng hoang dã và chủng đột biến mang gen ttrA và pduA bị xóa. Trong 2-tuần thử nghiệm, các vùng được nhuộm màu tích cực của tế bào CD4+ và CD8+ và đại thực bào hầu như có mô hình tương tự, trong đó ở mức 1 và 14 dpi thể hiện số lượng phản ứng miễn dịch cao hơn tế bào. Điều này có thể được giải thích là do sự tiếp xúc chính của hệ thống phòng thủ của vật chủ khi mầm bệnh xâm nhập. Báo cáo trước đây đã chỉ ra rằng ở những con gà bị nhiễm bệnh, ngay cả khi Salmonella không được bài tiết ở mức 12 dpi, sự lây nhiễm có thể trở nên dương tính nhờ tăm bông cloacal từ 13 dpi12, giải thích tại sao các vùng tế bào của hệ thống miễn dịch ở mức 3 và 7 dpi lại thấp hơn nhưng lại tăng lên. . Thoạt nhìn, người ta có thể mong đợi rằng phản ứng được gợi ra của vật chủ sẽ giảm khi cả pduA và ttrA đều bị xóa vì những gen này đóng vai trò quan trọng trong sự sống sót trong quá trình lây nhiễm bởi Salmonella2,4,13–15. Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi so sánh một đột biến kép thiếu cả hai gen cho thấy điều ngược lại, các chủng đột biến của Salmonella Enteritidis và Salmonella Typhimurium đã kích hoạt các tế bào phản ứng miễn dịch cao hơn so với các chủng hoang dã.

Lợi ích của cistanche tubulosa-tăng cường hệ thống miễn dịch

Vùng nhuộm màu ngắn nhất có thể dẫn đến số lượng khuẩn lạc cao trên đường ruột, chứng thực cho một nghiên cứu trước đó, trong đó các chủng Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA và Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA đã được phục hồi với số lượng cao hơn từ các mẫu phết lỗ huyệt so với loại hoang dã tương quan11 . Salmonella có thể hoạt động như một loại vi khuẩn ngoại bào hoặc nội bào, tùy thuộc vào nguồn dinh dưỡng sẵn có và xảy ra như một sự chuyển đổi giữa quá trình xâm chiếm đường ruột và xâm nhập vào tế bào chủ16. Khi vi khuẩn bị đại thực bào tiêu diệt và tiêu diệt, một số đoạn peptide được chuyển lên bề mặt tế bào trình diện kháng nguyên, được mã hóa bởi phức hợp tương hợp mô học chính (MHC), loại II. Sự liên kết peptide–MHC II này kích thích tế bào lympho T CD4+. Tuy nhiên, nếu vi khuẩn quyết định xâm chiếm tế bào chủ, xâm nhập vào tế bào chất của đại thực bào, thì sự kết nối peptide với một loại MHC khác, loại I, sẽ kích thích sản xuất tế bào lympho T CD8+17. Điều thú vị là các tế bào CD{6}} và CD8+ thể hiện cùng một kiểu đại thực bào trong suốt thí nghiệm, thậm chí còn thể hiện các phản ứng miễn dịch khác nhau. Vì tế bào CD4+ và CD8+ chủ yếu đại diện cho tế bào lympho T là một phần của phản ứng miễn dịch thích nghi nên đại thực bào là một phần của phản ứng miễn dịch bẩm sinh9. Ngoài ra, chúng tôi còn quan sát thấy rằng gà thịt có những vùng được đánh dấu dương tính biểu hiện nhiều hơn so với gà mái đẻ, điều này được xác nhận bởi một nghiên cứu trước đây, trong đó gà thịt được thử thách với các chủng đột biến cho thấy, chẳng hạn như sự xâm lấn đường ruột và nhiễm trùng toàn thân nhiều hơn11. Những phát hiện của chúng tôi cho thấy rằng phương pháp hóa mô miễn dịch cung cấp thông tin thú vị về hoạt động của các tế bào phản ứng miễn dịch trên nhiều cơ quan của các dòng thương mại khác nhau trong quá trình lây nhiễm bởi huyết thanh Salmonella enterica. Hơn nữa, nghiên cứu hiện tại chứng minh rằng việc xóa cả hai gen, ngay cả ở các chủng Salmonella khác nhau, đã tạo ra vi khuẩn tạo ra tế bào phản ứng miễn dịch cao hơn ở vật chủ, cho thấy mầm bệnh vẫn chưa bị suy giảm. Chúng ta có thể cho rằng có lẽ Salmonella đã tìm ra một cơ chế sinh tồn khác thậm chí còn gây bệnh nhiều hơn. Trong nghiên cứu trước đây, việc sử dụng các operon ttr và pdu phối hợp với các operon cob và PRP đã được chứng minh là cần thiết cho quá trình hô hấp kỵ khí16, khiến chúng tôi tin rằng không chỉ cần phải xóa nhiều gen hơn khỏi mỗi operon18 mà chúng tôi còn có cân nhắc việc loại bỏ toàn bộ bộ này để tiếp cận các chủng Salmonella enterica ít gây bệnh hơn.

Nguyên liệu và phương pháp

Các thí nghiệm, được thực hiện theo các hướng dẫn và quy định có liên quan, đã được phê duyệt bởi Ủy ban đạo đức về sử dụng động vật của Đại học bang Sao Paulo (CEUA/Unesp Process—006621/18; vào ngày 10 tháng 5 năm 2018), được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bệnh học Gia cầm Phòng thí nghiệm của Khoa Bệnh lý, Sinh học và Một sức khỏe của Trường Khoa học Nông nghiệp và Thú y, Đại học bang Sao Paulo (FCAV/Unesp), Jaboticabal, Brazil.

Các chủng vi khuẩn và cấu trúc đột biến.

Các chủng vi khuẩn được sử dụng ở đây được bảo quản trong môi trường bảo vệ lạnh được kết hợp bởi môi trường Lysogeny (LB; BD DifcoTM, USA) được bổ sung 30% glycerol (Merck, BR—H30402394 228) và bảo quản trong tủ đông siêu lạnh (- 80 độ ) tại Phòng thí nghiệm bệnh học gia cầm từ FCAV/UNESP. Salmonella Enteritidis P125109 (số gia nhập: AM933172) và Salmonella Typhimurium str. 9819 được tạo ra để kháng axit nalidixic và kháng Spectinomycin (Nalr Spcr ) và chúng cung cấp nền tảng di truyền để tạo ra các chủng đột biến bằng kỹ thuật Lambda-red20 với những sửa đổi nhỏ, được mô tả trong Saraiva et al.11. Vi khuẩn đột biến được tạo ra ở đây được xác định trên văn bản là SEΔttrAΔpduA (Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA) và STMΔttrAΔpduA (Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆due).

Thí nghiệm in vivo.

Thí nghiệm 1—Salmonella Enteritidis. Ba mươi sáu 1-gà con một ngày tuổi thuộc ba dòng dõi khác nhau (gà thịt, gà đẻ nặng vừa và gà mái đẻ nhẹ), tổng cộng là một trăm lẻ tám con, được lấy từ các trại giống thương mại. Khi đến nơi, đáy hộp thẻ vận chuyển đã được kiểm tra để xác nhận tình trạng không có Salmonella của gia cầm21, và gia cầm được nhốt trong lồng kim loại bên trong phòng đã thích nghi và được nhận thức ăn và nước uống không chứa kháng sinh tùy thích. Chương trình ánh sáng 24- giờ được chọn vào ngày đầu tiên để đảm bảo lượng nước và thức ăn tiêu thụ tối ưu, sau đó chương trình ánh sáng 12- giờ được áp dụng trong tuần đầu tiên, giảm xuống còn 8 giờ vào những ngày còn lại. Chất cấy được chuẩn bị theo Berchieri Junior et al.22. Để làm được điều này, môi trường nuôi cấy đông lạnh được cấy vào LB và ủ qua đêm ở nhiệt độ 37 độ dưới 15{15}} vòng/phút. Vào ngày hôm sau, vi khuẩn nuôi cấy được chuyển sang môi trường tươi và ủ trong 18 giờ trong cùng điều kiện như trước đó. Sau đó, 0,2 mL từ môi trường nuôi cấy chứa 108 đơn vị hình thành khuẩn lạc trên mỗi mL (CFU/mL) được tiêm trực tiếp bằng ống kim loại vào chim. Chín nhóm được thành lập (A đến I) và được chia ngẫu nhiên theo các dòng và chủng khác nhau (Bảng 7). Vào một, ba, bảy và 14-ngày sau nhiễm bệnh (dpi), ba con mỗi nhóm mỗi ngày, tính đến buổi sáng, đã được tiêu hủy bằng cách làm trật cổ tử cung để lấy phần giữa của manh tràng, manh tràng, và hồi tràng, và phần xa của thùy gan trái để phân tích hóa mô miễn dịch (IHC) sâu hơn. Để làm điều này, các mẫu được ngâm trong n-Hexane pa (n-Hexano pa, Synth, Brazil) trước đó được làm lạnh trong nitơ lỏng. Ngay sau khi mô đông lạnh, nó được chuyển vào ống lạnh 2 mL (Corning, USA) và được điều hòa trong nitơ lỏng. Sau khi lấy mẫu, các mô được bảo quản ở -80 độ cho đến khi xử lý IHC.

Thí nghiệm 2—Salmonella Typhimurium. Thí nghiệm này được thực hiện theo các đặc điểm tương tự được đề cập ở trên trong Thí nghiệm 1. Ba mươi sáu gà con (1 ngày tuổi) được chia ngẫu nhiên thành chín nhóm (A đến I) dựa trên dòng dõi và dòng của chúng (Bảng 7).

Bảng 7. Các nhóm được thành lập theo các dòng và chủng khác nhau. SE∆ttrA∆pduA, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; STM∆ttrA∆pduA, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis hoang dại; wt-STM, loại hoang dã Salmonella Typhimurium; NC, kiểm soát tiêu cực.

Hóa mô miễn dịch.

Phần mô. Các mẫu được thu thập được chuyển từ −80 độ sang bộ điều hòa nhiệt độ (Leica CM1860, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Đức) ở −22 độ trong đó bị chặn riêng lẻ trong hợp chất OCT (Tissue-Tek®, Sakura Finetek Europe BV, Hà Lan) mỗi 30 phút trước đến 6 µm sử dụng lưỡi dao dùng một lần có cấu hình thấp (Leica 819, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Đức). Đáng chú ý là các phần được thực hiện ở -22 độ, ngoại trừ các phần gan được thực hiện ở -15 độ. Các slide chứa ba lần lặp lại cách phân chia từng cơ quan trên mỗi phản ứng của tế bào miễn dịch được đánh dấu đã được chuẩn bị, với độ mỏng giữa mỗi lần lặp lại. Sử dụng cọ vẽ, các phần cắt mô được đặt trên các phiến mô học đã được xử lý trước bằng poly-l-lysine (Sigma-Aldrich, Vương quốc Anh, Cat no. P4832) và silane (Sigma-Aldrich, USA. Cat no. 440574). Các phiến kính được bảo quản ở −20 độ sau đó cho đến khi nhuộm IHC. Nhuộm tế bào miễn dịch. Đầu tiên, các phiến kính được ngâm trong 200 mL axeton làm lạnh (Acetone PA—ACS, Synth, Brazil) và ủ ở -20 độ trong 10 phút. Sau đó, các phiến kính được chuyển vào buồng ẩm (EasyPath®, Brazil) ở nhiệt độ phòng trong 5 phút để làm khô mẫu. Sau đó, các phiến kính được rửa bằng PBS và để lại một vũng nước trong 5 phút để tránh mất nước mô. Mười, các mô được ngâm trong 200 mL H2O2 4% mỗi 10 phút ở nơi tối và rửa lại bằng PBS. Khu vực xung quanh các phần mô được làm khô bằng giấy thấm và mẫu được bỏ qua bằng bút kỵ nước (Dako Pen, Dako Đan Mạch A/S, Đan Mạch). Bước rửa để lại vũng nước được lặp lại như trước. Bộ dụng cụ không chứa biotin Phát hiện HRP/DAB IHC dành riêng cho chuột và thỏ—Micropolymer (Abcam©, Hoa Kỳ) đã được sử dụng để nhuộm các tế bào miễn dịch, chọn phương pháp Avidin–Biotin Streptavidin Peroxidase Complex (ABC). Để làm được điều này, vũng nước đã được loại bỏ và các giọt thuốc thử chặn màu nền không đặc hiệu được thêm vào mô. Các phiến kính này được duy trì bên trong buồng ẩm ở nơi tối trong 30 phút, bước rửa được lặp lại và 200 µL kháng thể chính (CD Chống Gà4-UNLB; CD Chống Gà{{34} } UNLB; Bạch cầu đơn nhân chống chuột/Macrophage-UNLB, Công nghệ sinh học miền Nam, Hoa Kỳ) được pha loãng theo tỷ lệ 1:200 (v/v) trong thuốc thử pha loãng kháng thể (Chất pha loãng kháng thể, Abcam©, Hoa Kỳ) sau đó được thêm vào. Các phiến kính được ủ ở 4 độ trong 18 giờ. Vào ngày hôm sau, các phiến kính được rửa sạch như trước. Mười giọt kháng thể thứ cấp (Reveal Complement, Abcam ©, USA) đã được thêm vào sau khi loại bỏ PBS dư thừa và buồng ẩm được đặt trong môi trường tối trong 30 phút. Sau đó, một giọt 3,3′-diaminobenzidine (DAB Chromogen 50×, Abcam©, USA) được pha loãng trong 1 mL chất nền (DAB Substrate, Abcam©, USA), thể tích này đủ cho ba slide và thêm vào các phần mô. Một phút sau, ngâm các phiến kính trong 200 mL dH2O trong 5 phút. Sau đó, chúng được chuyển sang một khối nhựa chứa Harris hematoxylin (Êxodo Científca, Brazil) và để trong 1 phút. Ở phía sau, các phiến kính được rửa trong 10 phút dưới vòi nước chảy ở áp suất thấp. Các slide được đưa vào loạt rượu-xylene (Cồn 70%, Cồn 90%, Cồn 100%, Xylene I và Xylene II). Cuối cùng, các nắp đậy được đặt trên các phiến kính sau khi thêm một giọt môi trường gắn không chứa nước (Entellan®, Merck, Brazil). Hình ảnh từ các phần mô được chụp ngẫu nhiên, chọn năm trường xem ngẫu nhiên, sử dụng kính hiển vi quang học (ống kính 400×) (Coleman®, model N-120) với bộ chuyển đổi máy ảnh kỹ thuật số để phân tích thống kê thêm (Hình 1). ).

Phân tích dữ liệu.

cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch

Tỷ lệ tế bào và đại thực bào CD{{0}} và CD8+ được tính toán bằng Image-Pro Plus v.4.5.0.29 (MediaCybernetics, USA). Chúng được định lượng bằng giá trị phần trăm theo diện tích dương tính/tổng ​​diện tích của dấu hiệu tế bào miễn dịch. Phân tích thống kê và đồ họa được thực hiện bằng phần mềm GraphPad Prism v.8.0.1 dành cho macOS (GraphPad Sofware, La Jolla California, USA) và dữ liệu được gửi đến Phân tích phương sai (ANOVA), sau đó là so sánh nhiều Bonferroni, xem xét mức ý nghĩa thấp hơn 5% (P Nhỏ hơn hoặc bằng 0,05).

Hình 1. Phần manh tràng của gà thịt bị nhiễm Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA cho thấy phản ứng miễn dịch ở đại thực bào, 7 ngày sau khi nhiễm bệnh (×400; Avidin–Biotin Streptavidin Peroxidase, được nhuộm màu tương phản với Hematoxylin).

Người giới thiệu

1. Freitas Neto, OC, Penha Filho, RC & Barrow, PA Nguồn nhiễm khuẩn salmonella không thương hàn ở người: Đánh giá. Braz. J. Poult. Khoa học. 12(1), 1–11. https://doi.org/10.1590/S1516-635X2010000100001 (2010).

2. Mùa đông, SE và cộng sự. Viêm ruột cung cấp chất nhận điện tử hô hấp cho Salmonella. Thiên nhiên 467, 426–429. https://doi.org/ 10.1038/nature09415 (2010).

3. Hinsley, AP & Berks, BC Tính đặc hiệu của đường hô hấp liên quan đến việc khử các hợp chất lưu huỳnh do Salmonella enterica. Vi sinh vật (Đọc) 148, 3631–3638. https://doi.org/10.1099/00221287-148-11-3631 (2002).

4. Tiennimitr, P. và cộng sự. Viêm đường ruột cho phép Salmonella sử dụng ethanolamine để cạnh tranh với hệ vi sinh vật. Proc. Natl. Học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 108, 17480–17485. https://doi.org/10.1073/pnas.1107857108 (2011).

5. Staib, L. & Fuchs, TM Quy định về fucose và 1,2-việc sử dụng propanediol của Salmonella enterica serovar Typhimurium. Đằng trước. Vi sinh vật. 6, 1116. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.01116 (2015). 6. Horswill, AR & Escalante-Semerena, JC Quá trình dị hóa Propionate ở Salmonella Typhimurium LT2: Hai đơn vị được phiên mã khác nhau bao gồm locus prp ở 8,5 centisomes, prpR mã hóa một thành viên của họ chất kích hoạt sigma-54 và gen prpBCDE tạo thành một operon. J. Vi khuẩn. 179, 928–940. https://doi.org/10.1128/jb.179.3.928-940.1997 (1997).

7. Soria, MC, Soria, MA, Bueno, DJ & Terzolo, HR So sánh 3 phương pháp nuôi cấy và xét nghiệm PCR để phát hiện Salmonella Gallinarum và Salmonella Pullorum trong thức ăn gia cầm. Gia cầm. Khoa học. 92, 1505–1515. https://doi.org/10.3382/ps.2012-02926 (2013).

8. Van Immerseel, F. và cộng sự. Động lực của sự xâm nhập tế bào miễn dịch vào lớp đệm manh tràng của gà sau khi sơ sinh bị nhiễm chủng Salmonella Enteritidis. Dev. Comp. Miễn dịch. 26, 355–364. https://doi.org/10.1016/s0145-305x(01)00084-2 (2002).

9. Montassier, HJ Fisiopatologia do hệ thống miễn dịch. Trong Doenças das Aves (eds AndreattiFilho, RL và cộng sự) 467–489 (FACTA, 2020).

10. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, TA & Roth, JR Chất nhận điện tử thay thế tetrathionate hỗ trợ sự phát triển yếm khí phụ thuộc B12- của Salmonella enterica serovar Typhimurium trên ethanolamine hoặc 1,{{4} }propandiol. J. Vi khuẩn. 183, 2463–2475. https://doi.org/10.1128/JB.183.8.2463-2475.2001 (2001).

11. Saraiva, M. và cộng sự. Giải mã vai trò của gen ttrA và pduA đối với huyết thanh Salmonella enterica trong mô hình gây nhiễm trùng cho gà. Pathol gia cầm. https://doi.org/10.1080/03079457.2021.1909703 (2021).

12. Beal, RK, Wigley, P., Powers, C., Barrow, PA & Smith, AL Các phản ứng miễn dịch thể dịch và tế bào phản ứng chéo đối với các huyết thanh Salmonella enterica Typhimurium và Enteritidis có liên quan đến việc bảo vệ chống lại thách thức tái nhiễm khác loài. Bác sĩ thú y. Miễn dịch. Thuốc miễn dịch. 114, 84–93. https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2006.07.011 (2006).

13. Winter, SE & Bäumler, AJ Một kỳ tích ngoạn mục: Để cạnh tranh với hệ vi sinh vật đường ruột, Salmonella thúc đẩy vật chủ của nó cung cấp chất nhận điện tử hô hấp. Vi khuẩn đường ruột 2, 58–60. https://doi.org/10.4161/gmic.2.1.14911 (2011).

14. Rivera-Chávez, FI và cộng sự. Salmonella sử dụng taxi năng lượng để hưởng lợi từ tình trạng viêm ruột. PLoS Pathog. 9, e1003267. https:// doi.org/10.1371/journal.ppat.1003267 (2013).

15. Khan, CM Te Tương tác động giữa Salmonella và hệ vi sinh vật, trong phạm vi đầy thách thức của đường tiêu hóa. Int. Sch. Res. Không. 2014, 1–23. https://doi.org/10.1155/2014/846049 (2014).

16. Yoo, W., Kim, D., Yoon, H. & Ryu, S. Enzyme IIANtr điều chỉnh sự xâm nhập của Salmonella thông qua quá trình dị hóa 1,2-propanediol và propionate. Khoa học. Dân biểu 7, 44827. https://doi.org/10.1038/srep44827 (2017).

17. Salyers, AA & Whitt, DD Cơ chế phòng vệ của vật chủ chống lại mầm bệnh vi khuẩn: Phòng vệ của mô và máu. Trong Sinh bệnh học của vi khuẩn: Phương pháp tiếp cận phân tử (eds Salyers, AA & Whitt, DD) 16–29 (ASM Press, 1994).

18. Góes, V. và cộng sự. Salmonella Heidelberg làm mất gen bên cạnh các yêu cầu về hô hấp trong mô hình lây nhiễm ở gà. Vi khuẩn Pathog. 171, 105725. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2022.105725 (2022).

19. Barrow, PA, Hassan, JO & Berchieri, A. Jr. Giảm sự bài tiết qua phân của chủng Salmonella Typhimurium F98 ở gà được tiêm vắc-xin sống và giết chết sinh vật S. Typhimurium. Epidemiol. Lây nhiễm. 104, 413–426. https://doi.org/10.1017/s095026880 0047439 (1990).

20. Datsenko, KA & Wanner, BL Bất hoạt một bước các gen nhiễm sắc thể ở Escherichia coli K-12 bằng cách sử dụng các sản phẩm PCR. Proc. Natl. Học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 97, 6640–6645. https://doi.org/10.1073/pnas.1201632977 (2000).

21. Zancan, FB, Berchieri Junior, A., Fernandes, SA & Gama, NMSQ Salmonella spp. điều tra hộp vận chuyển chim một ngày tuổi. Braz. J. Vi sinh vật. 31, 230–232. https://doi.org/10.1590/S1517-83822000000300016 (2000).

22. Berchieri, A. Jr., Murphy, CK, Marston, K. & Barrow, PA Quan sát về sự tồn tại và lây truyền dọc của Salmonella enterica serovar Pullorum và Gallinarum ở gà: Ảnh hưởng của nền tảng di truyền của vi khuẩn và vật chủ. Pathol gia cầm. 30, 221–231. https://doi.org/10.1080/03079450120054631 (2001).