Nghiên cứu về chức năng miễn dịch thần kinh nội tiết của Cistanche Deserticola và các sản phẩm hấp rượu gạo của nó trong mô hình chuột gây ra bởi Glucocorticoid-Ⅰ

1. Giới thiệu

Cistanche Deserticola, được gọi là "nhân sâm sa mạc", là một loại thuốc truyền thống của Trung Quốc đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ như một loại thảo dược bổ dương chotiếp thêm sinh lực thận và tăng cường dương[1]. Tám loài và một biến thể củaCistanche Herba đã được ghi nhận ở Trung Quốc và chỉCistanche DeserticolaYC Mã vàCistanche tubulosa(Schenk) Wight được ghi trong Dược điển Trung Quốc [2]. Các nghiên cứu dược lý đã chứng minh rằngCistanches Herbacó tác dụng bảo vệ thần kinh [3], điều hòa miễn dịch [4], bảo vệ tim mạch [5], chống mệt mỏi [6], chống viêm [7], bảo vệ gan [8], chống oxy hóa [9], kháng khuẩn [10], nhuận tràng [11] và chống ung thư tác dụng [12]. rộng rãiphổ hoạt động sinh học được báo cáo của chi này được cho là do thành phần hóa học thực vật phức tạp và đa dạng của nó.Cistanche Deserticolachứa phenyletanol glycoside, iridoids, polysacarit [13], v.v. Hàm lượng phenylethanoid glycoside cao nhất trong các dược liệu gốc [14].

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ TĂNG CƯỜNG THẬN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Chế biến dược liệu Trung Quốc (CMM) là một kỹ thuật dược phẩm truyền thống nhằm đáp ứng các yêu cầu khác nhau về điều trị, phân phối và pha chế theo lý thuyết y học cổ truyền Trung Quốc. Những sản phẩm chế biến đó được gọi là thuốc sắc, được sử dụng trong các phòng khám. Việc chế biến nhằm mục đích nâng cao hiệu quả làm giảm độc tính của thuốc thô. Dược điển Trung Quốc năm 2015 ghi nhận Cistanche lát dày (CD) và Cistanche hấp rượu gạo (WCD) có thể dùng làm thuốc sắc trong phòng khám. Nhóm nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tác dụng nhuận tràng đã giảm bớt, đồng thời tác dụng chống lão hóa và tăng cường sinh lực thận dương được tăng cường sau khi Cistanche được hấp với rượu gạo [15].

Chức năng của trục vùng dưới đồi-tuyến yên-tuyến thượng thận-tuyến ức (HPAT) bị rối loạn trong hội chứng suy thận-dương [16]. Bệnh nhân thận dương suy cũng bị rối loạn miễn dịch trên diện rộng. Rối loạn chức năng trục HPA có liên quan chặt chẽ đến tình trạng suy giảm miễn dịch. Lý thuyết mạng lưới thần kinh-miễn dịch thần kinh (NEI) cho thấy hệ thống miễn dịch và thần kinh nội tiết có chung nhiều phối tử và thụ thể [17], và vùng dưới đồi được coi là trục để liên kết thần kinh nội tiết với hệ thống miễn dịch.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tái tạo tình trạng thiếu thận dương ở chuột mô hình bằng cách tiêm corticosteroid ngoại sinh và khám phá cơ chế gây ra tình trạng thiếu thận dương để đáp ứng với các sản phẩm chế biến khác nhau của Cistanche Deserticola từ góc độ chức năng miễn dịch nội tiết.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Vật liệu và thuốc thử

Cistanche Deserticola được thu thập từ Alashan Neimenggu vào năm 2019.5 và được Giáo sư Yanjun Zhai (Trường Dược, Đại học Y học Cổ truyền Trung Quốc Liêu Ninh, Trung Quốc) xác định là thân thịt khô của Cistanche Deserticola YC Ma. Mẫu chứng từ được bảo quản tại Trung tâm Công nghệ Kỹ thuật Chế biến Liêu Ninh.

Các hợp chất tiêu chuẩn của ajugol được mua từ Công ty TNHH Thành Đô Pure Chem-Standard (Thành Đô, Trung Quốc); cistanoside F,echinacoside, cistanoside A và isoacteosideđược mua từ Công ty Must (Tứ Xuyên Trung Quốc); Acteoside được mua từ Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Đại Liên, Trung Quốc). Acetonitril và metanol loại MS được mua từ Merck KGaA (Darmstadt, Đức). Axit formic cấp HPLC được mua từ Merck KGaA (Darmstadt, Đức). Rượu gạo được mua từ Công ty TNHH Rượu Thiệu Hưng Tháp Thương hiệu Chiết Giang (Chiết Giang, Trung Quốc).

Corticosterone (CAS: 50-22-6, độ tinh khiết > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), thuốc chinkuei shin chewan (Công ty TNHH Phát triển Công nghệ Tongrentang Bắc Kinh), chuột ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF- , IL-2 và IL-10 bộ dụng cụ phát hiện ELISA được mua từ Công ty TNHH Nanjing Jian Cheng. Bộ dụng cụ ELISA chuột cortisol được cung cấp bởi BOSK Co., kháng thể CD4 chuột, kháng thể CD8a (số 561833 và 559976), lysate RBC (Solarbio, R1010), dung dịch đệm PBS (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM, và mồi xuôi dòng và hạ lưu -actin được cung cấp bởi Bộ phiên mã ngược của Công ty Quảng Châu Invitrogen (số RR037A) và Bộ tổng hợp cDNA (số 10000068167) được cung cấp bởi Công ty TNHH Bole Life Medicine Products (Shanghai). Chloroform, isopropanol, 75% ethanol và urethane Tất cả các dung dịch đều tinh khiết về mặt phân tích và được sản xuất bởi Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Nước siêu tinh khiết được sản xuất bởi hệ thống Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, MA, USA).

2.2. Dụng cụ thí nghiệm

Máy đánh dấu enzyme (Thermo, model 3530911931), máy rửa đĩa tự động (model HBS- 4009), máy đo lực kéo đẩy màn hình kỹ thuật số (model VICTOR- 50N), máy ly tâm đông lạnh tốc độ cao (model Sigma 3k15 ), máy đo quang phổ siêu vi mô (model B-50Q), bộ khuếch đại gen (model L96G), PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực (model StepOne), máy đo dòng chảy tế bào (model AC66051710132), máy cắt vi thể paraffin (model Laika), kính hiển vi (Olympus) , model BS{11}}) và một thiết bị đo nước tinh khiết (model F7JA36507) đã được sử dụng.

2.3. Chuẩn bị mẫu cho các thí nghiệm UPLC-Q-TOF-MS và dược lý

WCD được xử lý từ cùng một lôCistanche Deserticolatrong phòng thí nghiệm của chúng tôi. Để chuẩn bị WCD, các mảnh CD khô (dày 5 mm) (100 g) được ngâm với rượu gạo (30 mL), hấp ở áp suất cao (1,25 kPa) trong 4 giờ, sau đó sấy khô ở 55 độ.

Bột thô của CD và WCD được ngâm trong 10 lần etanol 95% trong 0,5 giờ, chiết hồi lưu 3 lần mỗi lần trong 1 giờ, lọc và gộp dịch lọc 3 lần. Ethanol được thu hồi dưới áp suất giảm và dịch chiết thu được để sử dụng. Dịch chiết (1 mL) được thêm vào 50% metanol, nâng tổng thể tích lên 20 mL và được bảo quản ở 4 độ để phân tích hàm lượng.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. Các điều kiện UPLC-QqQ-MS để phân tích chất chiết xuất CD và WCD

2.4.1. Điều kiện phân tích LCThMS

Hệ thống UPLC-MSThMS với phần mềm MassLynx 4.1 Analyst được sử dụng để thực hiện việc thu thập và xử lý dữ liệu. Cột phân tích là Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) ở nhiệt độ 40 độ C. Pha động là dung dịch nước axit formic 0,1% (A) và axetonitril chứa 0,1% axit formic (B). Độ dốc rửa giải là 0.00–1.00 phút với 3% B, 1,01–2.00 phút với 3%–11,5% B, 2,01–3.{{29 }} phút với 12% B, 3,01–4.00 phút với 15% B, 4,01–5.00 phút với 20% B, 5,01–6.00 phút với 22 % B, 6,01–8.00 phút với 25% B và 8,01–9.00 phút với 10% B. Tốc độ dòng là 0,3 mLTh phút và thể tích tiêm là 1,0 μL.

Máy quang phổ khối ba lần Waters (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, USA) được trang bị nguồn ion hóa phun điện tử (ESI) đã được sử dụng ở chế độ ion âm. Khí khử là nitơ có tốc độ dòng 500 LThh ở nhiệt độ 250 độ. Tất cả các hợp chất được phát hiện đều được đo ở chế độ giám sát nhiều phản ứng (MRM); Bảng 1 thể hiện các thông số năng lượng và Bảng 2 thể hiện đường cong hiệu chuẩn cho các thành phần được phân tích.

2.4.2. Chuẩn bị chất đối chiếu

Tubuloside A (3.02 mg), echinacoside (3.00 mg), 2′-acetylacteoside (2,34 mg), Acteoside (2,45 mg), isoacteoside (0,61 mg), cistanoside F ( 2,14 mg), salidroside (3,39 mg), axit geniposidic (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) và catalpol (2,39 mg) được hòa tan trong metanol để chuẩn bị dung dịch gốc. Dung dịch gốc được pha loãng với metanol để thu được nồng độ thích hợp cho dung dịch chuẩn làm việc. Tất cả các dung dịch đã chuẩn bị đều được bảo quản ở nhiệt độ 4 độ trước khi sử dụng.

2.5. Chuẩn bị và phân nhóm các mô hình động vật

Chuột đực SD (180–220 g) được mua từ Công ty Công nghệ sinh học Liaoning Changsheng, số giấy phép động vật: SCXK (Liao) 2015–0001. Tất cả chuột được duy trì quyền tiếp cận miễn phí thức ăn và nước uống ở nhiệt độ 25 độ và độ ẩm tương đối là 30–50%. Các con vật được nuôi trong 7 ngày trước khi thí nghiệm.

Một trăm con chuột được chia ngẫu nhiên thành 10 nhóm: nhóm kiểm soát trống (BC), nhóm kiểm soát mô hình (MC), nhóm kiểm soát dương tính (PC), nhóm kiểm soát rượu gạo (WC), nhóm CD liều cao (CD) -HD), nhóm CD liều trung bình (CD-MD), nhóm CD liều thấp (CD-LD), nhóm WCD liều cao (WCD-HD), nhóm liều trung bình WCD (WCD-MD), và Nhóm WCD liều thấp (WCD-LD). Liều CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD và CD-LDThWCD-LD lần lượt là 5,48 gTh(kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) và 1,37 gTh(kg ∙ d). Liều cho nhóm PC là 1,646 gTh(kg ∙ d) và cho nhóm WC là 1 mLTh100 g trong 40 ngày. Vào ngày thứ 6 sau khi dùng thuốc, chuột được tiêm dưới da hỗn dịch nước corticosterone (corticosterone + 0,1% dimethyl sulfoxide + 0.1% Tween-80 + 0.9% natri clorua) ngoại trừ cho nhóm BC [18]. Nồng độ corticosterone là 5 gThL và liều lượng là 0,1 mLTh100 g. Những con chuột trong nhóm BC được tiêm nước muối thông thường + 0,1% dimethyl sulfoxide + 0,1% Tween- 80 + 0,9% natri clorua bằng cách tiêm với cùng một liều lượng.

2.6. Xác định chức năng trục HPA

2.6.1. Kiểm tra trọng lượng, nhiệt độ và khả năng giữ

Kiểm tra cân nặng được thực hiện 3 ngày một lần và đo nhiệt độ 6 ngày một lần. trong quá trình thí nghiệm. Vào ngày thứ 39, sức mạnh tối đa của chi sau được đo bằng máy đo độ bám. Những con chuột được đặt trên những bệ nhẵn, khiến chi sau của chúng bám vào cột. Theo bản năng, chuột sẽ tóm lấy bất kỳ vật thể nào để không bị lùi lại khi đuôi bị kéo cho đến khi lực kéo vượt quá độ bám. Khi chuột mất khả năng bám, bộ tiền khuếch đại có thể tự động ghi lại lực bám tối đa.

2.6.2. Xác định hàm lượng T, CRH, ACTH, CORT và Cortisol trong huyết thanh

Một giờ sau lần dùng thuốc cuối cùng, chuột được gây mê bằng cách tiêm dung dịch urethane (20 gTh100 mL) vào màng bụng. Sau đó, các mẫu máu được thu thập, ly tâm ở 3500 r trong 15 phút để thu được huyết thanh và bảo quản ở -20 độ. Nồng độ T, CRH, ACTH, CORT và cortisol được đo bằng bộ xét nghiệm ELISA chuột theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.6.3. Quan sát bằng kính hiển vi

Cấu trúc hình thái của mô tuyến thượng thận được quan sát bằng nhuộm HE. Mô tuyến thượng thận được cố định trong 10% paraformaldehyde, khử nước trong ethanol, làm trong suốt bằng dung dịch xylene, nhúng bằng phương pháp thông thường, cắt lát dày tới 4 μm, tẩy sáp bằng dung dịch xylene, ngậm nước bằng gradient ethanol, sau đó nhuộm bằng hematoxylin và eosin dung dịch nhuộm. Sau khi được làm trong suốt bằng xylen, tấm được dán kín bằng keo trung tính và quan sát dưới kính hiển vi.

2.6.4. Nhuộm hóa mô miễn dịch biểu hiện protein Bax, Bcl-2, Caspase-3, Fas và FasL ở tuyến thượng thận

Các phần tuyến thượng thận của chuột được cố định bằng parafin, được cố định bằng parafin đã được khử chất và bù nước sau khi được cắt ở độ dày 4 μm. Để ngăn chặn hoạt động peroxidase nội sinh, các phần được ủ trước trong khối hydrogen peroxide trong 10 phút. Các phần được nhúng vào 0,01 M citrate (pH 6,0) và đun nóng đến sôi. Quá trình được lặp lại sau 5–10 phút. Sau khi làm mát, các phần được rửa bằng PBS (pH 7,2–7,6) 1–2 lần, để ở nhiệt độ phòng trong khoảng 5 phút và rửa bằng PBS (pH 7,2–7,6) 2–3 lần. Dung dịch chặn BSA 5% được thêm vào ở nhiệt độ phòng và chất lỏng dư thừa trên phần này được loại bỏ sau 20 phút. Các kháng thể chính đã pha loãng đặc hiệu với FasTh FasL, Bcl-2ThBax và caspase-3 (pha loãng 1:100 với PBS) đã được thêm vào và ủ ở 37 độ trong 1 giờ hoặc 4 độ qua đêm. Các phần được rửa 2–3 lần bằng PBS (pH 7,2–7,6). Sau đó, IgG kháng chuột được đánh dấu biotin ở dê được thêm vào và các phần được sấy khô ở nhiệt độ 20–37 độ trong 20 phút và rửa bằng PBS (pH 7,2–7,6) 4 lần trong 5 phút. Sau khi rửa kỹ trong PBS, các phần được ủ với hỗn hợp thuốc thử A và B trong 30 phút, ủ với PBS trong 45 phút và cuối cùng được phát triển với chất nền DAB (DAKO) trong 30 phút trước khi được nhuộm màu nhẹ bằng hematoxylin, khử nước, và gắn kết.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ TĂNG CẢM GIÁC TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Xác định chức năng miễn dịch

2.7.1. Tính chỉ số cơ quan miễn dịch

Một giờ sau lần dùng thuốc cuối cùng, chuột được gây mê bằng cách tiêm dung dịch urethane trong màng bụng (20 gTh100 mL), sau đó lá lách và tuyến ức được cắt bỏ và cân ngay lập tức trong tủ hút vô trùng. Các hệ số trọng lượng của lá lách hoặc tuyến ức (%) � trọng lượng lá lách hoặc tuyến ức (mg) Trọng lượng cơ thể (g).

2.7.2. Phát hiện tập hợp tế bào lympho T trong máu ngoại vi

Tế bào lách và tế bào máu được ủ với kháng thể đơn dòng kháng CD4 (PE) và chống CD8 (FITC) trong 30 phút trong bóng tối. 2 mL lysate hồng cầu đã được thêm vào và dung dịch được trộn bằng cách xoáy. Để dung dịch trong bóng tối trong 10 phút và ly tâm trong 5 phút. Chất nổi phía trên được loại bỏ, sau đó dung dịch được rửa 3 lần bằng PBS lạnh như băng và được treo lại trong dung dịch thấm PBS. Ít nhất 10,{11}} tế bào được phân tích bằng phương pháp tế bào học dòng chảy trong vòng 1 giờ sau mỗi lần nhuộm Mab.

2.7.3. Xác định hàm lượng IL-10, IL-6, IL-2, TNF- và IFN-c trong Huyết thanh

Một giờ sau lần dùng thuốc cuối cùng, chuột được gây mê bằng cách tiêm dung dịch urethane (20 gTh100 mL) vào màng bụng và lấy máu từ động mạch chủ bụng. Máu được ly tâm ở 3500 r trong 15 phút để thu được huyết thanh và bảo quản ở -20 độ. Nồng độ IL-10, IL-6, IL-2, TNF- và IFN-c được phát hiện bằng bộ xét nghiệm ELISA chuột theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.8. Biểu hiện của CaM ở vùng dưới đồi và mô vùng dưới đồi

Tổng RNA được chiết xuất từ ​​​​các mô vùng dưới đồi và vùng dưới đồi bằng TRIzol. Phiên mã ngược được thực hiện trên 10 μL tổng số RNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Lượng cDNA tương đương được phân tích thông qua qPCR với sự có mặt của thuốc nhuộm liên kết DSDNA (Promega, Hoa Kỳ) và Hệ thống PCR thời gian thực CFX 96 (Bio-Rad, Hoa Kỳ) để xem xét các gen khác nhau trong điều kiện kích hoạt ban đầu tại 95 độ trong 10 phút, 40 chu kỳ biến tính ở 95 độ trong 15 giây và ủ kéo dài ở 60 độ trong 1 phút.

Các mồi cho CaM và -actin được nêu trong Bảng 1, và -actin được sử dụng làm đối chứng nội bộ. Mỗi mẫu được chuẩn hóa bằng cách sử dụng sự khác biệt về ngưỡng tới hạn (Ct) giữa gen mục tiêu và -actin. Phương trình sau đây được sử dụng để mô tả kết quả: ΔΔCt � (gen mục tiêu Ct − gen Ct -actin) nhóm thử nghiệm − (gen mục tiêu Ct − gen Ct -actin) nhóm kiểm soát. Sau đó, mức mRNA của từng mẫu được so sánh bằng cách sử dụng biểu thức gen mục tiêu 2- ΔΔCt. Kết quả của mỗi nhóm được tính trung bình (Bảng 3).

2.9. Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu được phân tích bằng phần mềm SPSS (phiên bản 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Sự khác biệt giữa các nhóm được phân tích bằng phân tích phương sai lặp lại một chiều (ANOVA). Kết quả được biểu thị bằng trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) bằng phần mềm GraphPad Prism (phiên bản 6.0, San Diego, CA, USA). Những khác biệt có giá trị P nhỏ hơn 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.

3. Kết quả thí nghiệm

3.1. Phân tích UPLC-QqQ-MS

Để đạt được sự phân tách, hình dạng pic tốt nhất và thời gian phân tích ngắn, các điều kiện sắc ký bao gồm chương trình cột, pha động và gradient đã được nghiên cứu trong thí nghiệm sơ bộ của chúng tôi. Sắc ký đồ điển hình với chế độ MRM được trình bày trong Hình 1.

Từ Bảng 4, chúng ta có thể thấy hàm lượng phenylethanoid glycoside trong WCD tăng so với CD, đặc biệt là echinacoside và Acteoside, trong khi hàm lượng iridoids giảm trong WCD.

3.2. Quy định về chức năng trục HPA

3.2.1. Kiểm tra trọng lượng, nhiệt độ và khả năng giữ

Chuột của nhóm MC và nhóm thử nghiệm biểu hiện triệu chứng suy thận dương dần dần sau khi được dùng corticosterone. Các triệu chứng như giảm cân, hạ thân nhiệt, mất độ bóng của tóc, tinh thần uể oải, phản ứng chậm và giảm đáng kể lượng nước tiêu thụ cũng như hoạt động, được cải thiện đáng kể ở nhóm CD và WCD. Hình 2(a) cho thấy sự thay đổi trọng lượng. Tỷ trọng của từng nhóm thuốc đều tăng lên, đặc biệt ở nhóm CDHD và WCD-HD. Mức tăng cân ở nhóm MC là thấp nhất. Hình 2(b) cho thấy sự thay đổi nhiệt độ, thấp nhất trong nhóm MC và nhiệt độ tăng ở các nhóm WCD-HD, WCD-MD và WCD-LD.

Hình 2(c) cho thấy khả năng nắm giữ tăng lên đối với nhóm BC và từng nhóm thử nghiệm, và nhóm WCD-MD là cao nhất, điều này chứng tỏ rằng các dấu hiệu suy nhược do thiếu thận dương đã cải thiện sau khi dùng.

3.2.2. Mức độ T, CRH, ACTH, CORT và Cortisol

Hình 3 cho thấy rằng so với nhóm BC, mức T, CRH, ACTH và CORT trong huyết thanh chuột giảm (P < 0.01) và mức cortisol giảm (P < 0.05) trong nhóm MC. So với nhóm MC, mức độ T ở nhóm WCD-HD và WCD-MD tăng (P < 0.01), mức độ CRH trong WCD-LD, Các nhóm WCD-MD và WC được cải thiện (P < 0.01), hàm lượng ACTH tăng lên trong các nhóm CD-HD, WCD-MD và WCD-HD (P < 0,01), mức CORT được nâng cấp trong Các nhóm CD-MD, WCD-MD và WCD-HD (P <0,01) và được tăng cường ở nhóm CDHD và WCD-LD (P <0,05), đồng thời mức độ cortisol tăng lên ở mỗi nhóm thuốc.

3.2.3. Kết quả quan sát bằng kính hiển vi

Mô tuyến thượng thận có thể được chia thành lớp vỏ và lớp tủy. Các lớp vỏ bao gồm các lớp hình cầu, bó và lưới. Các tế bào chứa nhiều lipid hơn và lớp tủy bao gồm chủ yếu là các tế bào u tế bào ưa crom và một lượng nhỏ mô sợi. Như được hiển thị trong Hình 4, chúng tôi thấy rằng tất cả đều bình thường ở nhóm BC, trong khi ở nhóm MC, vỏ thượng thận có sự tăng sản rõ rệt, teo tế bào và tăng mật độ. Dải củ hành dày lên, vùng bó mờ, vùng lưới hẹp và các tế bào nhỏ hơn cho thấy màu sắc không đồng đều và tắc nghẽn mao mạch. Trong nhóm PC, ranh giới vỏ não và tủy có thể nhìn thấy được. Các tế bào dạng dải hình cầu và bó được sắp xếp đồng đều, cấu trúc hình thái đã được phục hồi. Sự phục hồi tốt hơn tương tự cũng được quan sát thấy ở các nhóm WCD và hiệu quả ở nhóm WCD-MD tốt hơn so với nhóm WCD-HD và WCD-LD. Hình thái tuyến thượng thận ở nhóm CD không tốt bằng ở nhóm WCD.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG TÌNH DỤC PHGS75% ECH 30% ACT 12%