Nhân bản gen, Nhận dạng chức năng, Phân tích cấu trúc và biểu hiện của Sucrose Synthase từ Cistanche Tubulosa Ⅲ

4 Phân tích biểu hiện của CtSus ở các phần khác nhau của Cistanche tubulosa và hệ thống nuôi cấy tế bào dưới áp lực hạn hán

4.1 Phân tích biểu hiện của CtSus ở các phần khác nhau của Cistanche tubulosa

Trong ống nghiệm, các thí nghiệm biến đổi toàn bộ tế bào và thí nghiệm phản ứng xúc tác enzyme đã xác nhận rằng protein được mã hóa bởi gen CtSus có thể xúc tác cho quá trình tổng hợp UDP-glucose. Để khám phá sâu hơn về mối tương quan giữa gen này và quá trình sinh tổng hợp các hợp chất glycoside ở Cistanche tubulosa, mức độ biểu hiện của gen này ở các phần khác nhau của Cistanche tubulosa đã được phân tích.

THẢO DƯỢC CISTANCHE CHẤT LƯỢNG CAO VỚI 10-98% ECHINACOSIDE

Echinacoside is the most representative glycoside compound in Cistanche tubulosa, and its content can reach more than 30% of the dry weight of Cistanche tubulosa plants [23]. The research group previously measured the content of echinacoside in different parts of Cistanche tubulosa plants. Specifically, the content of echinacoside in different tissues is as follows: haustoria>underground part>>phần trên không; trong đó hàm lượng echinacoside ở haustoria là cao nhất.

PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực được thực hiện bằng cách sử dụng cDNA từ các phần khác nhau của Cistanche tubulosa làm mẫu và kết quả được phân tích bằng phương pháp 2–ΔΔCT và phân tích vi phân đã được thực hiện. Các kết quả được thể hiện trong Hình 4A. Mức độ biểu hiện của gen CtSus ở haustoria là cao nhất, gấp 1,5 lần so với phần trên không và mức độ biểu hiện ở phần dưới lòng đất cao hơn đáng kể so với phần trên không, phù hợp với mô hình tích lũy phenylethanoid glycoside được đại diện bởi echinacoside ở các phần khác nhau của Cistanche tubulosa.

Hình 4 Mức độ biểu hiện tương đối của CtSus trong các phần khác nhau của C. tubulosa và tế bào huyền phù được xử lý bằng PEG6000. A: Mức độ biểu hiện tương đối của CtSus ở các phần khác nhau của C. tubulosa; B: Mức độ biểu hiện tương đối của CtSus trong tế bào huyền phù C. tubulosa được xử lý bằng PEG6000 ở các thời điểm khác nhau. n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0,05,***P ＜ 0,001

4.2 Phân tích biểu hiện của CtSus trong tế bào huyền phù Cistanche Deserticola trong điều kiện hạn hán

Nghiên cứu sơ bộ của dự án cho thấy căng thẳng hạn hán do PEG6000 gây ra có thể làm tăng đáng kể sự tích tụ phenylanol glycoside trong tế bào huyền phù Cistanche Deserticola. Từ 3 đến 9 ngày sau khi cảm ứng, hàm lượng echinaceaside tăng lên đáng kể. Từ ngày thứ 12 đến ngày thứ 15, tốc độ tăng trưởng hàm lượng echinacoside chậm lại và đạt giá trị tối đa vào ngày thứ 15. Sau đó, khi thời gian nuôi cấy tăng lên, hàm lượng echinacoside tăng lên đáng kể. Hàm lượng fructoside giảm dần [24]. Dựa trên nghiên cứu này, bài viết này đã sử dụng cDNA của các tế bào huyền phù Cistanche Deserticola chưa được xử lý và các tế bào huyền phù Cistanche Deserticola được tạo ra bởi PEG làm mẫu để tiến hành phát hiện PCR định lượng huỳnh quang theo thời gian thực để kiểm tra gen CtSus trong các tế bào huyền phù Cistanche Deserticola trong điều kiện căng thẳng hạn hán. Thay đổi về mức độ biểu hiện. Kết quả được thể hiện trong Hình 4B. Trong các tế bào huyền phù Cistanche Deserticola được tạo ra bởi PEG6000, biểu hiện của CtSus tăng đáng kể vào ngày thứ 6 sau khi cảm ứng, đạt giá trị cao nhất vào ngày thứ 9 và sau đó giảm trở lại mức tương tự như đối chứng. Các nhóm cùng cấp độ. Các kết quả trên cho thấy stress hạn hán có thể làm tăng đáng kể sự biểu hiện của gen CtSus trong dòng tế bào huyền phù Cistanche Deserticola, phù hợp với mô hình tích lũy echinaceaside khi bị hạn hán. Tuy nhiên, sự biểu hiện đỉnh điểm của gen CtSus xuất hiện sớm hơn đỉnh điểm của hàm lượng echinaceaside, bởi vì chất cho glycosyl hoạt động được tổng hợp bằng xúc tác CtSus là tiền chất quan trọng cần thiết cho phản ứng glycosyl hóa nhiều bước trong quá trình sinh tổng hợp tiếp theo của echinaceaside. , người ta suy đoán rằng sau khi chịu áp lực hạn hán, các sinh vật sẽ ưu tiên huy động các gen liên quan đến trao đổi chất sơ cấp để đạt được sự tích lũy của các nhà tài trợ tích cực, và sau đó đạt được sự tích lũy trao đổi chất thứ cấp quan trọng của các sản phẩm trao đổi chất.

5 Nghiên cứu cấu trúc ba chiều của protein CtSus và phân tích các vị trí hoạt động chính

Dựa trên chức năng của CtSus trong việc xúc tác sản xuất UDP-glucose cho glycosyl, cơ sở cấu trúc của hoạt tính xúc tác CtSus đã được nghiên cứu sâu hơn. Công cụ trực tuyến SOPMA đã được sử dụng để dự đoán cấu trúc thứ cấp của protein. Kết quả cho thấy cấu trúc thứ cấp của CtSus chứa 55,28% xoắn ốc, 25,47% cuộn ngẫu nhiên, 12,80% chuỗi kéo dài và 6,46% xoắn ốc (Hình 5A), cho thấy rằng xoắn ốc là đơn vị cấu trúc thứ cấp quan trọng nhất trong protein CtSus, tiếp theo là các cuộn dây ngẫu nhiên, cũng chiếm tỷ lệ lớn trong protein. Các sợi mở rộng và các vòng xoắn được phân bố khắp protein. Theo các nghiên cứu hiện có, sucrose synthase thường tồn tại ở dạng tetramer, được coi là dạng hoạt động của nó. Do đó, bài báo này tiếp tục sử dụng AlphaFold2 để dự đoán cấu trúc của protein CtSus và thu được cấu trúc ba chiều của các tetramer protein. So sánh cơ sở dữ liệu PDB (Ngân hàng dữ liệu protein) cho thấy độ tương tự trình tự giữa Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 (PDBID 3S28) và CtSus có thể đạt tới 77,93%. Cấu trúc CtSus dự đoán được so sánh với cấu trúc ba chiều AtSus1 và giá trị độ lệch bình phương trung bình gốc (RMSD) sau khi chồng chất protein là 1,11 Å, cho thấy cấu trúc không gian của cả hai có tính nhất quán cao (Hình 5B).

Hình 5 Khảo sát cấu trúc của CtSus. A: Cấu trúc thứ cấp được dự đoán của CtSus bằng SOPMA.Blue: chuỗi xoắn; Màu tím: Cuộn ngẫu nhiên; Màu đỏ: Sợi kéo dài; Màu xanh lá cây: tờ. B: Căn chỉnh cấu trúc ba chiều của AtSus1 (màu xanh lam) và CtSus (màu xanh lục). Cả hai đều được hiển thị dưới dạng tetramer.C: Dư lượng chính trong túi liên kết cơ chất của AtSus1 (màu xanh lam) và CtSus (màu xanh lục với dư lượng được dán nhãn); D: Căn chỉnh cấu hình liên kết của UDP và fructose trong AtSus1 (màu xanh lam) và CtSus (màu xanh lục); E: Tương tác giữa UDP và CtSus thể hiện dưới dạng sơ đồ 2D được Discovery Studio Client phân tích

Cấu trúc phức hợp tinh thể phối tử protein được báo cáo của Arabidopsis AtSus1 với UDP và fructose (PDBID3S29) đã được sử dụng làm mẫu [16] để phân tích chế độ liên kết của CtSus với UDP và fructose. Các kết quả lắp ghép phân tử được thể hiện trong Hình 5C. Có thể thấy rằng các túi liên kết cơ chất của AtSus1 và CtSus rất giống nhau về loại axit amin, sự phân bố và cấu hình không gian, đồng thời độ chồng chéo cao, chứng tỏ rằng trình tự sucrose synthase được bảo tồn cao ở thực vật. Cấu hình của hai phối tử, UDP và fructose, trong túi liên kết cơ chất protein, được thể hiện trên Hình 5D. Cấu hình thuận lợi nhất của việc lắp ghép phân tử của UDP và CtSus trùng khớp tốt với cấu hình của UDP trong phức hợp tinh thể UDP AtSus1-, chứng minh tính chính xác của kết quả lắp ghép phân tử. Sự tương tác giữa UDP và các gốc axit amin quan trọng trong túi liên kết cơ chất protein được thể hiện trong Hình 5E. UDP và CtSus chủ yếu liên kết với nhau bằng liên kết hydro và tương tác kỵ nước. Dư lượng axit amin quan trọng trong túi liên kết cơ chất bao gồm Leu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 và Glam681.

Cuộc thảo luận

Biến đổi glycosyl hóa là một trong những biện pháp quan trọng để cải thiện tính chất vật lý và hoạt động sinh học của các sản phẩm tự nhiên hoặc tiền chất thuốc. So với các phương pháp hóa học truyền thống, phương pháp biến đổi glycosyl hóa bằng enzyme có ưu điểm là điều kiện phản ứng nhẹ, tính chọn lọc mạnh và thân thiện với môi trường. Tuy nhiên, phản ứng glycosyl hóa glycosyltransferase đòi hỏi một lượng lớn chất cho đường UDP, rất tốn kém và khó thu được, dẫn đến thực tế là glycosyltransferase không thể được sử dụng rộng rãi trong sản xuất công nghiệp. Sucrose synthase có thể xúc tác cho phản ứng thuận nghịch: sucrose + UDP ⇌ UDP-glucose + fructose và có thể hình thành chu trình UDP-glucose tái tạo thông qua phản ứng ghép đôi với glycosyltransferase. Cistanche tubulosa rất giàu các hợp chất glycoside thuộc các loại cấu trúc khác nhau, được đại diện bởi các hợp chất glycoside phenylanol, cho thấy rằng con đường tổng hợp chất cho glycosyl hoạt động trong cơ thể của nó liên quan đến sucrose synthase có sự trao đổi chất mạnh mẽ, nhưng sucrose synthase có liên quan từ thực vật Cistanche thì không. đã được báo cáo. Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên gen tổng hợp sucrose CtSus được nhân bản từ Cistanche tubulosa. Protein được mã hóa bởi gen này chứa miền bảo tồn của sucrose synthase thực vật. Bằng cách so sánh trình tự tổng hợp sucrose từ các thực vật khác, người ta thấy rằng độ tương tự trình tự axit amin giữa nó và tổng hợp sucrose từ thực vật cùng loại là hơn 90%, cho thấy mức độ bảo tồn trình tự cao của tổng hợp sucrose từ thực vật. Phân tích tiến hóa phân tử cho thấy CtSus thuộc nhánh sucrose synthase thực vật hai lá mầm và có liên quan chặt chẽ nhất với sucrose synthase PrSus từ P. ramosa thuộc họ Orobanchaceae.

Để khám phá hoạt tính xúc tác của CtSus, nghiên cứu này đã kết hợp glycosyltransferase UGT71BD1, hoạt tính của nó đã được nhóm nghiên cứu xác minh trước đây, để xây dựng một hệ thống đồng biểu hiện plasmid kép. Thông qua các thí nghiệm xúc tác toàn tế bào, các điều kiện đã đạt được mà không cần bổ sung thêm chất cho đường UDP. Phản ứng glycosyl hóa hợp chất coumarin quế và hợp chất stilbene resveratrol. So với nhóm đối chứng, việc bổ sung CtSus đã làm tăng đáng kể tốc độ chuyển đổi của các phản ứng glycosyl hóa được xúc tác UGT71BD1-. Trên cơ sở đó, nghiên cứu này đã tiếp tục tạo ra plasmid biểu hiện tái tổ hợp CtSus và đạt được biểu hiện hòa tan của protein tái tổ hợp ở E. coli. Trong ống nghiệm, các phản ứng xúc tác enzyme cho thấy rằng với sự có mặt của sucrose và UDP, CtSus có thể xúc tác cho việc tạo ra UDP-glucose và sau khi thẻ ái lực của yếu tố kích hoạt có trong protein tái tổ hợp bị loại bỏ, sản phẩm của CtSus xúc tác cho việc tạo ra UDP - thu được glucozơ. Tỷ lệ đã được cải thiện đáng kể. Các kết quả biến đổi toàn bộ tế bào và phản ứng xúc tác enzyme in vitro đã xác nhận hoạt động của CtSus như một chất cho đường có hoạt tính xúc tác sucrose synthase UDP-glucose. Để tìm hiểu thêm về mối tương quan giữa gen CtSus và quá trình sinh tổng hợp glycoside trong Cistanche tuberosum, sự biểu hiện của CtSus ở các phần khác nhau của Cistanche tuberosum đã được phân tích bằng các thí nghiệm PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực. Kết quả cho thấy gen này được biểu hiện ở haustoria của Cistanche tuberosum. Mức độ biểu hiện cao nhất. Cistanche Deserticola là một loại cây ký sinh và không thể thu được các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển thông qua quá trình quang hợp. Vì vậy, nó cần phải ký sinh trên rễ của cây chủ và dựa vào cây chủ để lấy chất dinh dưỡng để duy trì sự phát triển. Ở thực vật, sucrose chủ yếu cung cấp năng lượng và nguồn carbon [12]. Tuy nhiên, tế bào không thể sử dụng trực tiếp sucrose và cần phải phân hủy thêm. Haustoria là cầu nối giữa Cistanche Deserticola và cây chủ, đồng thời đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng của nó. chủ yếu

[25], do đó mức độ biểu hiện cao của sucrose synthase trong haustoria của Cistanche Deserticola là hợp lý. Sự biểu hiện cao của CtSus trong haustoria cũng phù hợp với mô hình tích lũy lớn của glycoside phenylethanoid trong haustoria. Ngoài ra, thông qua phân tích PCR định lượng huỳnh quang về sự thay đổi mức độ biểu hiện gen CtSus trong tế bào huyền phù Cistanche Deserticola ở các thời điểm khác nhau dưới áp lực hạn hán, người ta nhận thấy rằng căng thẳng hạn hán có thể làm tăng đáng kể sự biểu hiện của gen CtSus trong dòng tế bào huyền phù. phù hợp với echinaceaside. Mô hình tích lũy trong các dòng tế bào huyền phù dưới áp lực hạn hán là nhất quán. Các kết quả trên cho thấy CtSus tham gia vào quá trình sinh tổng hợp phenylethanoid glycoside được đại diện bởi echinacea ở Cistanche tulipis in vivo. Đây là một trong nhiều con đường sinh tổng hợp. Phản ứng glycosyl hóa bước đầu tiên cung cấp UDP-glucose cho glycosyl hoạt động. Tóm lại, nghiên cứu này

Nghiên cứu đã xác định được một gen tổng hợp sucrose mới ở Cistanche Deserticola, gen này cho phép tổng hợp enzyme trong ống nghiệm của các chất cho glycosyl hoạt động và cung cấp các yếu tố di truyền mới để xây dựng vi khuẩn kỹ thuật cho quá trình sinh tổng hợp Cistanche Deserticola glycoside.

Đóng góp của tác giả: Tian Weisheng chịu trách nhiệm phân tích tin sinh học, phân tích biểu hiện, phân tích hoạt động của enzyme và viết bản thảo đầu tiên về gen CtSus; Yan Yaru chịu trách nhiệm sàng lọc và nhân bản gen; Cui Xiaoxue và Huang Wenqian tham gia phân tích tin sinh học và phân tích biểu thức; Wang Yingxia và Zhao Saijing tham gia xây dựng vectơ và phân tích Hoạt động enzyme; Li Jun và Shi Shepo chủ yếu hướng dẫn phân tích hoạt động và phân tích biểu hiện enzyme; Tu Pengfei và Liu Xiao chịu trách nhiệm thiết kế ý tưởng bài báo, hướng dẫn thí nghiệm, viết và sửa bài báo. Tất cả các tác giả đều tham gia sửa đổi bài báo.

Tài liệu tham khảo

[1] Song ZH, Lôi L, Tú PF. Những tiến bộ trong nghiên cứu hoạt động dược lý ở thực vật CistancheHoffing. và Liên kết [J]. Thuốc thảo mộc cổ truyền Chin (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Liu WJ, Liu Y, Song QQ, và những người khác. So sánh hóa học giữa Cistanchetubulosa được trồng và hoang dã bằng phương pháp quang phổ ¹H-NMR [J]. Trung Quốc J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Song Y, Zeng K, Jiang Y, và những người khác. Cistanches Herba, từ một loài có nguy cơ tuyệt chủng trở thành một thương hiệu lớn về y học Trung Quốc [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.[4] Lưu Y, Wang H, Yang M, và cộng sự. Cistanche Deserticola polysaccharides bảo vệ tế bào PC12 chống lại tổn thương do OGD/RP gây ra [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 99: 671-680.

[5] Yin Y, Huang J, Gu X, và những người khác. Sự phát triển của enzyme chuyển đổi nucleotide-đường thực vật [J].PLoS One, 2011, 6: e27995.

[6] Thanh-Peled M, O'Neill MA. Sự hình thành đường nucleotide thực vật, chuyển đổi lẫn nhau và tận dụng bằng cách tái chế đường [J]. Annu Rev Plant Biol, 2011, 62: 127-155.

[7] Quách H, Lý L, Vương PG. Đặc tính sinh hóa của UDP-GlcNAc/Glc4-epimerase từ Escherichia coli O86:B7 [J]. Hóa sinh, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr, và những người khác. Xác định UDP-N-acetylglucosamine4-epimerase liên quan đến quá trình glycosyl hóa protein exosporium ở Bacillus anthracis [J]. J Bacteriol,2009, 191: 7094-7101.

[9] Lý LN, Khổng JQ. Nhận dạng trên toàn bộ phiên mã của các gen tổng hợp sucrose ở Ornithogalumcaudatum [J]. RSC Adv, 2016, 6: 18778-18792.

[10]Schmölzer K, Gutmann A, Diricks M, và cộng sự. Sucrose synthase: một glycosyltransferase duy nhất để phát triển quá trình glycosyl hóa xúc tác sinh học [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.[11]Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. Quá trình sinh tổng hợp sucrose [J]. J Biol Chem, 1955,214: 149-155.