Nhân bản gen, Nhận dạng chức năng, Phân tích cấu trúc và biểu hiện của Sucrose Synthase từ Cistanche Tubulosa Ⅱ

Kết quả và phân tích

1 Khai thác gen sucrose synthase ở Cistanche tubulosa và nhân dòng gen CtSus

Using the amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 as a template[16], the sequence was aligned in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data. They were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>phần trên không.

Cistanche Tubulosa chất lượng cao cho sức khỏe nam giới

Do đó, giá trị FPKM ở mức độ biểu hiện của hai gen tổng hợp sucrose ứng cử viên thu được trong lần sàng lọc ban đầu trong dữ liệu phiên mã của các phần khác nhau của Cistanche tubulosa đã được chuẩn hóa bằng Z-Score và phân tích vi phân được thực hiện (Hình 1A). Kết quả cho thấy gen CtSus có mức độ biểu hiện cao nhất ở phần thân và mức độ biểu hiện ở phần dưới đất cao hơn ở phần trên không, phù hợp với mô hình tích lũy các hợp chất glycoside ở các phần khác nhau của Cistanche tubulosa, trong khi mức độ biểu hiện của gen CtSus1 ở haustorium lại thấp. Vì vậy, dựa trên kết quả trên, gen CtSus đã được chọn để khuếch đại trình tự tiếp theo, biểu hiện ngoại sinh và xác định chức năng. Sử dụng Cistanche tubulosa cDNA làm mẫu, sản phẩm một dải thu được ở mức ~ 2500 bp sau khi khuếch đại PCR (Hình 1B). Sản phẩm PCR được thu hồi từ gel và gắn vào vectơ nhân bản, và vùng mã hóa có độ dài đầy đủ của gen mục tiêu thu được bằng cách giải trình tự. Độ dài của chuỗi CtSus là 2418 bp.

Hình 1 Khám phá gen và nhân bản CtSus từ C. tubulosa và phân tích tin sinh học về protein được mã hóa của nó. A: Mức độ biểu hiện của gen CtSus và CtSus1 ở các phần khác nhau của C. tubulosa được chuẩn hóa thành Điểm Z dựa trên giá trị FPKM của chúng; B: Khuếch đại gen của CtSus; M: điểm đánh dấu DNA; C: Miền bảo thủ của protein CtSus được dự đoán bởi SMART; D: Liên kết nhiều trình tự của CtSus và enzym tổng hợp sucrose được xác định từ các cây khác bao gồm Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum và Albuca bracteata. Miền tổng hợp sucrose và miền chuyển đường tương ứng được thể hiện bằng các hộp màu đỏ và xanh lam; E: Phân tích phát sinh loài của CtSus và sucrosesynthase từ các cây khác; F: Phân tích SDS-PAGE về biểu hiện khác loại của CtSus bằng vectơ pCold™ I trong E. coli. Ngõ 1: Điểm đánh dấu protein; Ngõ 2: Phần nổi phía trên; Ngõ 3: Phân tách lượng mưa. Mũi tên màu đỏ hiển thị protein CtSus. G: PCR khuẩn lạc của một dòng đơn chứa cả hai plasmid tái tổ hợp. M: điểm đánh dấu DNA; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

Bảng 2. Sự tương đồng về trình tự axit amin giữa CtSus và tổng hợp sucrose được xác định từ thực vật khác

2.3 Phân tích phát sinh loài

Cây phát sinh gen được xây dựng bằng phần mềm MEGA đã được sử dụng để phân tích mối quan hệ phát sinh gen giữa CtSus tổng hợp sucrose từ Cistanche tubulosa và các tổng hợp sucrose có nguồn gốc từ thực vật khác. Các kết quả được thể hiện trong Hình 1E. Các enzyme tổng hợp sucrose có nguồn gốc từ thực vật cho thấy các nhánh tiến hóa khác biệt ở thực vật hai lá mầm (vùng I và II) và thực vật một lá mầm (vùng III). CtSus nằm trong nhánh hai lá mầm và các trình tự có liên quan chặt chẽ nhất với CtSus đều có nguồn gốc từ thực vật thuộc họ Lamiaceae (Cistanche tubulosa là một loài thực vật thuộc họ Lamiaceae Orobanchaceae), trong khi nhánh còn lại chủ yếu bao gồm các cây Solanales, điều này càng cho thấy khả năng bảo tồn và bảo tồn cao. tương đồng của các gen tổng hợp sucrose có nguồn gốc từ thực vật trong quá trình tiến hóa của thực vật theo cùng một thứ tự. Trong số đó, sucrose synthase PrSus (AEN79500.1) từ Phelipanche ramosa của cây Orobanchaceae có liên quan chặt chẽ nhất với CtSus.

3 Phân tích biểu hiện và hoạt động ngoại sinh của CtSus

3.1 Biểu hiện ngoại sinh của gen CtSus Các plasmid pET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus và pCold™ I-CtSus được xác minh bằng trình tự đã được chuyển vào biểu hiện có thẩm quyền của E. coli Transetta (DE3), và các dòng vô tính dương tính được sàng lọc bằng phương pháp PCR khuẩn lạc để xác minh trình tự. Các chủng biểu hiện tái tổ hợp thu được được tạo ra bởi nhiệt độ thấp IPTG để biểu hiện protein, vi khuẩn được thu thập bằng cách ly tâm, và dung dịch đệm ly giải được thêm vào để phá vỡ vi khuẩn nhằm thu được chất nổi và kết tủa, đồng thời thực hiện SDS-PAGE để phát hiện. Kết quả cho thấy rằng khi pET-28a và pET{10}}b được sử dụng làm vectơ biểu thức, CtSus không được biểu thị trong E. coli, trong khi khi pCold™ I được sử dụng làm vectơ biểu thức, CtSus rõ ràng dải protein tái tổ hợp đã được phát hiện ở vùng ~ 100 kDa, phù hợp với khối lượng phân tử tương đối được dự đoán về mặt lý thuyết là 92,2 kDa (Hình 1F).

3.2 Biến đổi toàn bộ tế bào

Để xác minh sơ bộ chức năng xúc tác của CtSus, một chủng đồng biểu hiện của CtSus và gen glycosyltransferase UGT71BD1 đã được tạo ra. UGT71BD1 đã được nhân bản và xác định từ Cistanche tubulosa và là một UDP-glucosyltransferase có thể chấp nhận rộng rãi các hợp chất thơm như phenylethanoid glycoside, các loại flavonoid, stilbene và coumarin làm thụ thể và xúc tác cho phản ứng glucosyl hóa của nhóm hydroxyl phenolic cơ chất sử dụng UDP-glucose với tư cách là người cho đường [18]. Về mặt lý thuyết, việc đưa vào CtSus có thể cung cấp đủ UDP-glucose cho glycosyl hơn cho phản ứng glucosyl hóa được xúc tác bởi UGT71BD1, từ đó thúc đẩy trạng thái cân bằng phản ứng hướng tới sự hình thành các sản phẩm glycosyl hóa, từ đó làm tăng sản lượng các sản phẩm glycosyl hóa. Plasmid pCold™ I-CtSus và plasmid pET{12}}a-UGT71BD1 được biến đổi đồng thời thành vi khuẩn E. coli Transetta (DE3) có khả năng biểu hiện. Các dòng đơn lẻ chứa cả hai plasmid tái tổ hợp đã được sàng lọc bằng phương pháp PCR khuẩn lạc và các chủng biểu hiện tái tổ hợp dương tính thu được bằng cách xác minh trình tự (Hình 1G). Sự đồng biểu hiện gen kép được tạo ra trong ống nghiệm và chủng biểu hiện gen đơn pET{19}}aUGT71BD1 được sử dụng làm nhóm đối chứng. Hoạt tính của CtSus trong việc xúc tác tạo ra chất cho UDP-glucose đã được xác nhận sơ bộ bằng quá trình biến nạp toàn bộ tế bào. Kết quả của HPLC và phép đo phổ khối có độ phân giải cao cho thấy khi phản ứng biến đổi toàn bộ tế bào được thực hiện với aconitine 1 và resveratrol 2 làm cơ chất, việc tạo ra các sản phẩm glycosyl hóa rõ ràng đã được phát hiện sau 24 giờ biến đổi, như trong Hình 2.

Hình 2 Sự biến đổi sinh học toàn tế bào của cơ chất 1 hoặc 2 bằng chủng tái tổ hợp chứa UGT71BD1 hoặc chủng tái tổ hợp chứa UGT71BD1 tương ứng với CtSus. A: Sắc ký đồ HPLC của quá trình biến đổi sinh học toàn tế bào của chất nền 1. Bước sóng phát hiện là 360nm; B: HRESI-MS và MS2spectra của sản phẩm 1a; C: Sắc ký đồ HPLC của sự biến đổi sinh học toàn tế bào của cơ chất 2; Bước sóng phát hiện là 330 nm. D: Phổ HRESI-MS của sản phẩm 2a và 2b

Khi 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+, công thức phân tử C9H6O4) được sử dụng làm cơ chất, pic sắc ký của sản phẩm 1a (m/z 341.087 2 [M+H]+, công thức phân tử dự đoán C15H16O9) được phát hiện ở 5,39 phút, phù hợp với tia cực tím hấp thụ của chất nền và sản phẩm đối chứng. Đồng thời, một đỉnh mảnh m/z 179.033 4 [M+H]+ được phát hiện trong phổ MS2 của 1a, được tạo ra do 1a làm mất đi một phân tử glucose (162 Da), cho thấy rằng 1a là sản phẩm của cơ chất 1 được kết nối với phân tử glucose. Tỷ lệ chuyển đổi được tính bằng cách lấy tích phân diện tích pic. Nhận thấy tỷ lệ chuyển hóa toàn bộ tế bào UGT71BD1 xúc tác cơ chất 1 để tạo ra sản phẩm glycosyl hóa 1a là 71,87%, trong khi việc bổ sung CtSus đã làm tăng tỷ lệ chuyển hóa của phản ứng lên 95,84%, gấp 1,3 lần so với nhóm đối chứng. Khi cơ chất là hợp chất 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, công thức phân tử C14H12O3), sắc ký của sản phẩm đạt cực đại 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, phân tử dự đoán công thức C20H22O8) và 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+, công thức phân tử dự đoán C26H32O13) phù hợp với khả năng hấp thụ tia cực tím đặc trưng của cơ chất và sản phẩm đối chứng được phát hiện lần lượt ở 10,32 và 6,52 phút . Đỉnh mảnh được phát hiện ở 3 [MH]-, được tạo ra do mất một phân tử glucose (162 Da), chỉ ra rằng 2a là sản phẩm của cơ chất 2 được kết nối với một phân tử glucose. Bằng cách so sánh với dữ liệu trong tài liệu [18] và thông tin dự đoán khối phổ, người ta xác định rằng sản phẩm 2b là sản phẩm của cơ chất 2 được kết nối với hai phân tử glucose. Tỷ lệ chuyển đổi được tính toán bằng cách sử dụng diện tích pic tích hợp. Nhận thấy rằng việc bổ sung CtSus có thể làm tăng hiệu suất chuyển hóa của phản ứng glycosyl hóa cơ chất 2 từ 64,01% lên 78,51%, trong đó hiệu suất tạo ra sản phẩm monosaccharide 2a tăng từ 45,09% lên 63,58% và hiệu suất tạo ra sản phẩm disacarit 2b. thay đổi từ 18,92% thành 14,93%.

3.3 Tinh chế protein tái tổ hợp CtSus và xác định hoạt tính enzyme in vitro

Kết quả thí nghiệm biến nạp toàn bộ tế bào cho thấy CtSus có hoạt tính xúc tác sản xuất chất cho glucose hoạt động UDP-glucose. Để xác minh trực tiếp hơn nữa hoạt tính xúc tác này thông qua phản ứng xúc tác enzyme trong ống nghiệm, protein tổng hợp của gen CtSus trong hệ thống biểu hiện pCold™ đã được tách ra và tinh chế bằng sắc ký ái lực. Kết quả cho thấy khi pCold™ I được sử dụng làm vectơ biểu hiện, protein tái tổ hợp được biểu hiện với số lượng lớn nhưng chủ yếu ở dạng kết tủa. Khi pCold™ TF được sử dụng làm vectơ biểu hiện, gen CtSus được biểu hiện với số lượng lớn ở E. coli (Hình 3A). Protein tổng hợp được tinh chế bằng sắc ký ái lực HisTrap FF và cho phản ứng xúc tác enzym trong ống nghiệm. Các kết quả được thể hiện trong Hình 3B. Khi sucrose và UDP được sử dụng làm cơ chất, so với nhóm đối chứng âm, đỉnh sản phẩm mới được phát hiện ở thời điểm 10,32 phút. Thời gian lưu và khả năng hấp thụ tia cực tím của nó phù hợp với UDP-glucose. Sản phẩm được chứng minh là UDP-glucose bằng cách so sánh với tiêu chuẩn. Tuy nhiên, do protein tổng hợp được biểu thị bằng vectơ biểu hiện pCold™ TF chứa thẻ hòa tan yếu tố kích hoạt lớn (kích thước protein thẻ là 48 kDa), nên nó sẽ có tác động lớn đến hoạt động xúc tác của protein. Do đó, phần đuôi của protein tổng hợp được cắt thêm bằng enzyme Yếu tố Xa và protein CtSus không có phần đuôi ngoại sinh đã được tinh chế (Hình 3A). Protein được xúc tác enzyme in vitro, kết quả cho thấy hiệu suất UDP-glucose tăng từ 3,53% lên 10,66%.

(Hình 3B). Các kết quả trên đã khẳng định hoạt tính của CtSus trong việc xúc tác quá trình sản xuất UDP-glucose thông qua xúc tác enzyme in vitro, đồng thời cũng cho thấy rằng sự hiện diện của thẻ ái lực lớn có lợi cho sự biểu hiện hòa tan của CtSus, nhưng nó cũng sẽ ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính xúc tác in vitro của enzyme.

Hình 3 Biểu hiện dị loại và nhận dạng chức năng của CtSus. A: Phân tích SDS-PAGE của protein CtSus. Ngõ 1: Điểm đánh dấu protein; Ngõ 2: CtSus tái tổ hợp với yếu tố kích hoạt; Ngõ 3: Phân tách thẻ yếu tố kích hoạt bằng cách sử dụng protease Yếu tố Xa để tạo ra protein CtSus được đánh dấu bằng mũi tên màu đỏ. B: Xét nghiệm enzyme invitro sử dụng protein tổng hợp và protein CtSus không có yếu tố kích hoạt để xúc tác quá trình tổng hợp UDP-glucose với sự có mặt của sucrose và UDP, tương ứng, với UDP-glucose chuẩn tham chiếu. Protein luộc được sử dụng làm nhóm đối chứng trong cùng điều kiện. Bước sóng phát hiện là 260 nm