Tác dụng chống viêm tổng hợp của chiết xuất Laminaria Japonica Fucoidan và Cistanche Tubulosa

Là một phản ứng miễn dịch chống lại các kháng nguyên lạ, đại thực bào giải phóng các cytokine gây viêm như yếu tố hoại tử khối u- (TNF- ), interleukin-1 (IL- 1 ), IL-6 và các loại khác. Các cytokine như vậy tạo ra một dòng bạch cầu hạt, bạch cầu đơn nhân, tế bào lympho và dưỡng bào đến các mô bị tổn thương nhằm thúc đẩy việc loại bỏ kháng nguyên và phục hồi mô. Tuy nhiên, sự xâm nhập và kích hoạt quá mức của các tế bào sẽ làm tổn thương mô trầm trọng hơn, dẫn đến phù nề (xuất tiết mạch máu) và đau, đây là hiện tượng viêm phổ biến.

TNF- là yếu tố quan trọng để tạo ra sự biểu hiện gen nitric oxit synthase (iNOS) trong một số dòng tế bào. Kích hoạt iNOS dẫn đến sản xuất oxit nitric (NO) không chỉ điều chỉnh một số chức năng sinh lý như diệt khuẩn và giãn mạch mà còn gây viêm. Sau tổn thương mô, sự thoái hóa của phospholipase của phospholipid màng tế bào tạo ra axit arachidonic. Axit arachidonic tiếp tục bị phân hủy bởi cyclooxygenase (COX) thành prostaglandin (PGs). Lượng PGE2 quá mức được hình thành bởi COX-II gây ra một số cytokine gây viêm. Vì cả NO và PGE2 đều đóng vai trò là yếu tố chính gây viêm và gây đau, nên các con đường TNF- –NO và COX-II–PGE2 là dòng chính của quá trình viêm, bị ức chế bởi corticosteroid và thuốc không steroid.thuốc chống viêm(NSAID), tương ứng.

Mặc dù có một số steroid và NSAID có tác dụngđiều trị các bệnh viêm, những loại thuốc này có thể gây ra tác dụng phụ trên hệ thống miễn dịch, đường tiêu hóa, thận, gan, hệ thần kinh trung ương, huyết áp và hệ tim mạch. Vì vậy, cần giảm thiểu tác dụng phụ của các liệu pháp hóa học bằng cách thay thế hoặc sử dụng kết hợp với các sản phẩm tự nhiên.

Fucoidan, một phức hợp polysaccharide sunfat từ rong biển như Laminaria japonica và Cladosiphon okamuranus phân bố rộng rãi ở nhiều nước, đã được sử dụng làm thuốc chữa bệnh trong Đông y từ lâu. Trong các nghiên cứu trước đây, người ta đã chứng minh rằng Fucoidan có tác dụng chống oxy hóa, chống đông máu, chống ung thư vàhoạt động chống viêm. Theo đó, tác dụng có lợi của Fucoidan đối với các bệnh viêm nhiễm, thiếu máu cục bộ, rối loạn chức năng miễn dịch và khối u đang thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu. Mặt khác,Cistanche tubulosa(CT) cũng đã được sử dụng rộng rãi như một loại thuốc truyền thống ở Trung Quốc. Đã có báo cáo rằng chiết xuất CT làm giảm việc sản xuất TNF-á và IL- 4, những yếu tố chính tạo ra NO trong quá trình viêm [19].

Những phát hiện trước đó đã khiến chúng tôi nghiên cứu hiệu quả kết hợp của Fucoidan và chiết xuất CT trên 2 con đường chính gây viêm. Để làm sáng tỏ cơ chế hoạt động, chúng tôi đã phân tích NO và PGE2 trong dịch tiết ra từ tình trạng viêm túi khí do carrageenan gây ra.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ PHÒNG NGỪAHOẠT ĐỘNG VIÊMPHGS75% ECH 30% HÀNH ĐỘNG 12%

Vật liệu và phương pháp

Nguyên vật liệu

Fucoidan bán tinh khiết và chiết xuất nước của CT được lấy từ Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Hàn Quốc). Chiết xuất Fucoidan và CT được giữ ở nhiệt độ 4 độ, hòa tan (1:3) trong nước tinh khiết trước khi sử dụng và dùng qua đường uống với thể tích 5 mL/kg.

Nuôi cấy tế bào và định lượng NO

Dòng tế bào RAW 264.7 của đại thực bào chuột được mua từ American Type Culture Collection (Manassas, USA) và nuôi cấy trong môi trường Eagle's cải tiến của Dulbecco (Sigma, St. Louis, USA) chứa 10% huyết thanh bào thai bò và kháng sinh [100 U/mL penicillin (Sigma) và 100 µg/mL streptomycin (Sigma)]. Các tế bào được ủ trong môi trường có độ ẩm 5% CO2 ở 37 độ.

Để đánh giá tác động của Fucoidan và chiết xuất CT đối với sự bài tiết NO, tế bào RAW 264.7 (1×106 tế bào/mL) được ủ với Fucoidan hoặc chiết xuất CT (1–320 µg/ mL) trong 5 phút , tiếp theo là interferon- (IFN-, 10 U/ mL) và lipopolysaccharide (LPS, 10 µg/mL) trong 24 giờ. Trong các nghiên cứu sơ bộ của chúng tôi, người ta đã xác nhận rằng việc điều trị bằng IFN- cộng với LPS để kích hoạt tế bào RAW 264.7 không ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của tế bào lên đến 24 giờ và rằng chiết xuất Fucoidan và CT không gây độc tế bào lên đến 1 mg/mL. Nồng độ nitrit (NO2 – ), sản phẩm oxy hóa của NO, được đo như một chất chỉ thị NO. Môi trường nuôi cấy được trộn với một thể tích tương đương thuốc thử Griess (1% sulfanilamide, 0,1% naphthyl ethylenediamine trong 2,5% axit photphoric) [21] và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Nồng độ nitrit được phân tích ở bước sóng 540 nm, trong đó NaNO2 được sử dụng để tạo đường chuẩn.

Động vật và cách điều trị

Chuột ICR đực (7 tuần tuổi) được mua từ Daehan Biolink (Eumseong, Hàn Quốc) và được nhốt trong phòng có điều kiện môi trường không đổi (22±2°C; độ ẩm tương đối 40-70%; ánh sáng 12- giờ -chu kỳ tối; 150-300 độ sáng lux). Thức ăn viên và nước tinh khiết có sẵn tùy ý. Tất cả các thí nghiệm trên động vật đã được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thể chế (IACUC) của Đại học Quốc gia Chungbuk (CBNU), Hàn Quốc và được thực hiện theo Quy trình Vận hành Tiêu chuẩn (SOP) của Trung tâm Nghiên cứu Động vật trong Phòng thí nghiệm, CBNU.

Những con chuột (n{0}}/nhóm) được điều trị bằng đường uống bằng Fucoidan (18 hoặc 54 mg/kg), chiết xuất CT (54 hoặc 162 mg/ kg) hoặc hỗn hợp của chúng (18+54, {{6 }} hoặc 90+270 mg/kg) mỗi ngày một lần trong 7 ngày. Fucoidan liều thấp (18 mg/kg) và chiết xuất CT (54 mg/kg) là từ liều ước tính của con người là 100 mg/cơ thể (70 kg) và 300 mg/cơ thể sau khi tính diện tích bề mặt của trọng lượng cơ thể (Km{14) }} cho con người/Km=3 cho chuột), tương ứng. Liều cao Fucoidan và chiết xuất CT được chia thành 3 lần, riêng lẻ hoặc hỗn hợp, và hỗn hợp liều cao nhất được cố định ở 5 lần để đánh giá tác dụng hiệp đồng tối đa.

Vào ngày đầu tiên điều trị bằng Fucoidan và chiết xuất CT, chuột được tiêm dưới da 10 mL không khí vô trùng vào mặt sau để tạo thành một túi [22,23]. Sau 2 và 5 ngày, túi được bơm lại 5 mL không khí. Một giờ sau lần điều trị cuối cùng, 1 mL carrageenan (1% trong nước muối; Sigma) hoặc chất dẫn của nó (nước muối) đã được tiêm vào túi.

Phân tích dịch tiết

Túi khí được rửa bằng 1 mL nước muối lạnh 6 giờ sau khi tiêm carrageenan và thể tích thực của dịch rửa được ghi lại. Tổng số tế bào viêm, bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân và tế bào lympho được xác định bằng cách sử dụng máy đếm coulter. Nồng độ NO và PGE2 được xác định bằng thuốc thử Griess (Sigma) và xét nghiệm miễn dịch enzyme (EIA) bằng cách sử dụng bộ Correlate-EIA (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA), tương ứng.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ CHẶN HÀNH ĐỘNG TRÊN TẾ BÀO VIÊM HÓA HỌC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Kiểm tra mô bệnh học

Mô lót túi được lấy ra và cố định trong dung dịch formalin trung tính. Các phiến mô nhúng parafin được nhuộm bằng hematoxylin-eosin và kiểm tra dưới kính hiển vi ánh sáng để phát hiện các tổn thương viêm.

Phân tích thống kê

Các kết quả được trình bày dưới dạng trung bình ± SE. So sánh nhóm thử nghiệm được thực hiện bằng phân tích phương sai một chiều, sau đó là hiệu chỉnh thử nghiệm Tukey. giá trị AP<0.05 was considered statistically significant.

Kết quả

Trong ống nghiệm, nuôi cấy tế bào RAW 264.7, xử lý IFN- và LPS đã làm tăng đáng kể việc sản xuất NO (Hình 1). Tiền xử lý bằng Fucoidan (1–320 µg/mL) không ảnh hưởng đến việc giải phóng NO từ dòng tế bào đại thực bào (Hình 1A). Để so sánh, chiết xuất CT (32–320 µg/mL) đã ức chế đáng kể việc sản xuất NO, cho thấy hoạt động chống viêm (Hình 1B).

Tiêm carrageenan vào túi khí của chuột làm tăng đáng kể lượng dịch tiết ra trong túi (Hình 2). Sự tiết dịch tăng lên như vậy đã giảm đi khi điều trị bằng Fucoidan (18 mg/kg) và chiết xuất CT (54 và 162 mg/kg). Đáng chú ý, việc điều trị kết hợp Fucoidan và chiết xuất CT làm giảm thêm lượng dịch tiết so với các tác động riêng lẻ, mặc dù sự kết hợp liều cao hơn (54+162 mg/kg và 90+270 mg/kg) không cho thấy hiệu quả bổ sung đến sự kết hợp liều thấp nhất (18+54 mg/kg) (Hình 2A). Hàm lượng N trong túi cũng tăng mạnh sau khi tiêm carrageenan (Hình 2B). So với tác dụng nhẹ của Fucoidan, chiết xuất CT làm giảm đáng kể nồng độ N. Điều trị kết hợp Fucoidan và chiết xuất CT làm giảm thêm mức NO theo cách phụ thuộc vào liều lượng. Tương tự, hàm lượng PGE2 tăng lên đã bị ức chế hiệp lực bằng liệu pháp kết hợp Fucoidan và chiết xuất CT (Hình 2C).

Song song với các chất trung gian gây viêm trong túi, số lượng tế bào viêm tăng mạnh khi tiêm carrageenan: lần lượt là 37,8, 4,8 và 24,1 lần mức kiểm soát đối với bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân và tế bào lympho (Bảng 1). Tuy nhiên, Fucoidan và chiết xuất CT làm giảm đáng kể sự xâm nhập của tế bào viêm, trong đó Fucoidan có phần vượt trội hơn so với chiết xuất CT. Thật bất ngờ, không có tác dụng hiệp đồng nào trong việc thâm nhập tế bào viêm đạt được khi sử dụng đồng thời Fucoidan và chiết xuất CT.

Như được suy ra từ sự thâm nhiễm tế bào viêm trong dịch tiết, mô dưới da xung quanh túi khí biểu hiện các tổn thương viêm nghiêm trọng (Hình 3). Rất nhiều tế bào trong mô dưới da dày lên tiếp xúc với Carrageenan đã được quan sát (Hình 3B), so với các đặc điểm gần như bình thường ở động vật đối chứng (Hình 3A). Các tổn thương viêm như vậy đã giảm đáng kể khi điều trị bằng Fucoidan (Hình 3C và 3D) hoặc chiết xuất CT (Hình 3E và 3F).

Đáng chú ý là hiệu quả chống viêm cao hơn đạt được bằng liệu pháp kết hợp với chiết xuất Fucoidan và CT (Hình 3G-3I).

Cuộc thảo luận

Sử dụng mô hình viêm túi khí do arrageenan gây ra ở mức độ viv, việc bơm không khí vào lưng của loài gặm nhấm sẽ gây ra sự tăng sinh của các tế bào phân tầng trên bề mặt khoang để tạo thành cấu trúc tương tự như màng hoạt dịch. Trong mô hình này, việc tiêm thâm nhiễm tế bào viêm do carrageenan gây ra làm tăng dịch tiết, điều này cho thấy sự rò rỉ mạch máu. Túi khí đóng vai trò là nơi chứa các tế bào viêm và chất trung gian có thể dễ dàng đo được trong chất lỏng tích tụ cục bộ.

Trong số các chất trung gian gây viêm đa dạng có thể gây ra tính thấm của mạch máu, người ta biết rằng NO và PGE2 là những yếu tố chính liên quan đến sinh bệnh học của nhiều bệnh viêm nhiễm. Chúng còn được gọi là chất trung gian gây cảm ứng và nhận thức đau. iNOS, được biểu hiện và kích hoạt ở nhiều loại tế bào khác nhau bằng cách kích thích TNF- và/hoặc LPS trong quá trình viêm, tạo ra nồng độ NO cao và dai dẳng. NO là một phân tử điều hòa quan trọng trong các chức năng sinh lý đa dạng, chẳng hạn như giãn mạch dẫn đến rò rỉ mạch máu. PGE2, được tạo ra từ axit arachidonic thông qua COX, góp phần phát triển nhiều bệnh viêm nhiễm và việc sản xuất quá mức PGE2 để đáp ứng với các kích thích viêm khác nhau có liên quan đến việc điều chỉnh tăng nồng độ COX-II và tiến triển của tình trạng viêm. Do đó, con đường TNF{6}} NO và COX-II-PGE2 được coi là hai dòng chính của quá trình viêm, bị chặn bởi các chất ức chế iNOS (corticosteroid) và COX (NSAID), tương ứng.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ NGĂN CHẶN BỆNH VIÊM PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Trong nghiên cứu hiện tại, việc sử dụng đồng thời Fucoidan và chiết xuất CT làm giảm thể tích dịch tiết trong túi, cho thấy rằng chúng có hoạt tính ức chế chống rò rỉ mạch máu (Hình 2A). So với tác dụng riêng lẻ của từng chiết xuất Fucoidan và CT, phương pháp điều trị kết hợp còn tăng thêm, ngụ ý rằng mức độ tổng hợp thứ hai có tác dụng hiệp đồng. Tác dụng hiệp đồng như vậy giữa chiết xuất Fucoidan và CT được hỗ trợ bởi hoạt động của chúng đối với nồng độ NO và PGE2 trong dịch tiết (Hình 3B và 2C).

Tuy nhiên, điều thú vị là người ta đã xác nhận rằng Fucoidan không trực tiếp ức chế sự kích hoạt của đại thực bào trong xét nghiệm in vitro (Hình 1A). Tương tự, khả năng ức chế của Fucoidan trong xét nghiệm tích lũy NO và PGE2 trong cơ thể tương đối thấp hơn so với chiết xuất CT (Hình 2B và 2C). Cơ chế hoạt động như vậy của Fucoidan khác với cơ chế vô hiệu hóa trực tiếp tế bào bằng chiết xuất CT (Hình 1B). Bằng cách so sánh, Fucoidan có hiệu quả cao trong việc ức chế sự xâm nhập của tế bào viêm trong túi (Bảng 1). Fucoidan vượt trội hơn so với chiết xuất CT trong việc ngăn chặn sự di chuyển của bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân và tế bào lympho đến các vị trí tổn thương mô do carrageenan gây ra. Điều thú vị là không có tác dụng chống di cư tổng hợp, cho thấy các cơ chế hoạt động khác nhau giữa Fucoidan và chiết xuất CT: tức là Fucoidan ngăn chặn sự xâm nhập của các tế bào viêm, trong khi chiết xuất CT ức chế sự kích hoạt của tế bào.

Các tế bào đa nhân, đặc biệt là bạch cầu trung tính, là thành phần chính của tế bào được tuyển dụng vào các vị trí viêm cấp tính do carrageenan gây ra. Ngoài ra, các tế bào viêm tiếp theo như đại thực bào và tế bào lympho cũng đóng vai trò trung tâm trong quá trình viêm bằng cách tiết ra các cytokine. Khi được xử lý trước bằng chiết xuất Fucoidan hoặc CT, số lượng tế bào bạch cầu di chuyển vào túi khí được tiêm carrageenan đã bị ức chế rõ rệt. Kết quả này phù hợp với tác dụng có thể đạt được của corticosteroid như dexamethasone, chứ không phải bởi NSAID bao gồm indomethacin. Do đó, người ta cho rằng chiết xuất Fucoidan và CT có một phần đặc tính của steroid.

Ngoài tác dụng ngăn chặn sự hóa trị của tế bào viêm, chiết xuất CT còn có tác dụng ngăn chặn sự kích hoạt của đại thực bào. Điều này đã được xác nhận bởi tác dụng ức chế NO in vitro và in vivo, đây là chất trung gian gây viêm chính được tạo ra bởi đại thực bào. Do đó, tác dụng của chiết xuất CT đối với đại thực bào có thể là do ức chế biểu hiện mRNA và/hoặc ức chế trực tiếp hoạt động iNOS trong các tế bào này.

PGE2 cũng là một trong những chất trung gian gây viêm chính. Nó tăng lên song song với tình trạng phù nề mô, bị ức chế bởi NSAID, chất ức chế COX. Carrageenan có thể làm tăng sản xuất PGE2 bằng cách tạo ra protein COX-II mRNA và COX-II trong dịch tiết túi. Trong mô hình này, carrageenan làm tăng đáng kể lượng PGE2 và nó bị ức chế đáng kể bởi chiết xuất CT. Thật thú vị khi lưu ý rằng kết quả này phù hợp với tác dụng có thể đạt được của NSAID indomethacin. Do đó, từ kết quả suy ra rằng chiết xuất CT có các đặc tính bổ sung của NSAID. Kết hợp lại với nhau, người ta tin rằng chiết xuất CT có tác dụng giống cả corticosteroid và NSAID trong mô hình viêm do carrageenan gây ra và Fucoidan đã tăng cường khả năng chống viêm.tác dụng chống viêm của chiết xuất CTbằng cách ngăn chặn sự xâm nhập của tế bào viêm.

Mặc dù việc xác định cơ chế hoạt động chính xác cần phải nghiên cứu thêm, nhưng hỗn hợp Fucoidan và chiết xuất CT làm giảm rõ rệt các dấu hiệu viêm bằng cách ngăn chặn các con đường TNF- –NO và COX-II–PGE2 trong tình trạng viêm túi khí do carrageenan gây ra. Những phát hiện này cung cấp bằng chứng cho thấy việc điều trị kết hợp Fucoidan và chiết xuất CT có thể là một ứng cử viên đầy hứa hẹn trong việc làm giảm các loại viêm khác nhau đáp ứng với corticosteroid hoặc NSAID.

CISTANCHE TUBULOSA TỰ NHIÊN ĐỂ NGĂN CHẶN BỆNH VIÊM PHGS75% ECH 30% ACT 12%