Miễn dịch tổng hợp và bảo vệ ở chuột bằng cách đồng miễn dịch với vắc xin DNA mã hóa protein tăng đột biến và các protein cấu trúc khác của SARS-CoV-2

Trừu tượng:Sự xuất hiện của các biến thể mới của hội chứng hô hấp cấp tính nặng do vi-rút Corona 2 (SARS CoV-2) đã tạo ra các đợt bùng phát nhiễm trùng định kỳ trên toàn thế giới. Những biến thể đột biến cao này làm giảm hiệu quả của vắc xin ngừa bệnh vi-rút corona 2019 (Covid-19) hiện tại, vốn được thiết kế để chỉ nhắm mục tiêu vào protein tăng đột biến (S) của vi-rút ban đầu. Ngoại trừ S của SARS-CoV-2, khả năng bảo vệ miễn dịch của các protein cấu trúc khác (nucleocapsid, N; vỏ, E; màng, M) làm kháng nguyên mục tiêu của vắc xin vẫn chưa rõ ràng và đáng để nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, vắc xin DNA tổng hợp mã hóa bốn protein cấu trúc SARS-CoV-2 (pS, pN, pE và pM) đã được phát triển và chuột được tiêm ba liều thông qua tiêm bắp và điện di. Đáng chú ý là việc đồng chủng ngừa với hai loại vắc xin DNA biểu hiện protein S và N đã tạo ra kháng thể trung hòa cao hơn và có hiệu quả hơn trong việc giảm tải lượng vi rút SARS-CoV{10}} so với chỉ dùng protein S ở chuột. Ngoài ra, việc đồng chủng ngừa pS với pN hoặc pE + pM tạo ra khả năng miễn dịch tế bào đặc hiệu với protein S cao hơn sau ba lần chủng ngừa và gây ra những thay đổi mô bệnh học nhẹ hơn so với chỉ dùng pS sau thử thách. Vai trò của các protein cấu trúc được bảo tồn của SARS-CoV{16}}, bao gồm cả protein N/E/M, cần được nghiên cứu sâu hơn để ứng dụng chúng trong thiết kế vắc xin, chẳng hạn như vắc xin mRNA.

cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch

Từ khóa: COVID-19; SARS-CoV-2}}; đồng miễn dịch; vắc xin DNA; protein tăng đột biến; protein cấu trúc

1. Giới thiệu

Hội chứng hô hấp cấp tính nặng do vi-rút Corona 2 (SARS-CoV-2) là nguyên nhân gây ra bệnh vi-rút Corona 2019 (Covid-19), đã gây ra hàng triệu ca nhiễm trùng và tử vong trên toàn thế giới, đồng thời gây nguy hiểm cho sức khỏe con người và nền kinh tế toàn cầu . Mặc dù các phương pháp điều trị hiệu quả vẫn chưa có nhưng chúng đã tiến bộ nhanh chóng, bao gồm cả việc áp dụng liệu pháp tế bào CAR-T và công nghệ nano [1,2]. Tiêm chủng là một cách hiệu quả để kiểm soát đại dịch và một số loại vắc xin đã được các cơ quan quản lý y tế khác nhau chấp thuận sử dụng [3,4]. Bộ gen của coronavirus mã hóa bốn protein cấu trúc chính, đó là protein tăng đột biến (S), nucleocapsid (N), màng (M) và vỏ (E), chịu trách nhiệm tập hợp virion và ngăn chặn phản ứng miễn dịch của vật chủ [5 ]. Protein S bao gồm 1273 gốc axit amin chứa hai tiểu đơn vị là S1 và S2. Nó làm trung gian cho sự xâm nhập của virus và là mục tiêu chính để phát triển vắc-xin coronavirus [6–11]. Tuy nhiên, protein S của SARS-CoV-2 có tần số đột biến cao. Không có gì ngạc nhiên khi ở SARS-CoV-2, một loại virus RNA, sự đột biến diễn ra liên tục và không thể tránh khỏi. Đã có 5 biến thể đáng lo ngại (VOC) của SARS-CoV{21}} xuất hiện kể từ tháng 9 năm 2020, bao gồm B.1.1.7 (Anh, Alpha), B.1.351 (Nam Phi, Beta), P.1 (Brazil, Gamma), B.1.617.2 (Ấn Độ, Delta) và B.1.1.529 (Nam Phi, Omicron) (Andreano và Rappuoli, 2021; Gupta, 2021). Tất cả chúng đều có một số đột biến ở protein tăng đột biến [12]. Những biến thể này đe dọa đến tính hiệu quả của các loại vắc xin COVID-19 hiện tại, vốn được thiết kế để chỉ nhắm mục tiêu vào protein tăng đột biến.

Protein N của SARS-CoV-2 liên kết với RNA của virus thông qua 140-miền liên kết RNA dài axit amin trong lõi của chúng theo cách "chuỗi hạt". Nó có tính bảo tồn cao trong số các loại virus Corona, có chung trình tự nhận dạng ~ 90% với SARS-CoV và nó cũng là protein cấu trúc duy nhất bên trong virion [13]. Ngoài ra, nó đóng một vai trò quan trọng trong việc đóng gói RNA virus vào phức hợp ribonucleo Capsid và cần thiết cho quá trình sao chép RNA virus, lắp ráp virion và giải phóng khỏi tế bào chủ [14]. Dựa trên tính tương tự trình tự cao của protein N trong virus Corona, nó có thể được đề xuất làm mục tiêu vắc xin bảo vệ chéo. Trước đây, chúng tôi đã phát hiện ra rằng việc đồng chủng ngừa với hai loại vắc xin DNA biểu hiện protein E và M mang lại sự bảo vệ một phần chống lại SARS-CoV{13}} và phương pháp này nên được xem xét trong quá trình phát triển vắc xin [15]. Tùy thuộc vào tài liệu tổng quan của WHO, thường có bảy chiến lược dành cho vắc xin ngừa SARS-CoV-2. Các chiến lược này có thể được chia thành ba loại: thứ nhất là vắc xin dựa trên protein, bao gồm vắc xin vi rút bất hoạt, vắc xin giống vi rút. vắc xin dạng hạt và tiểu đơn vị protein; thứ hai, vắc xin dựa trên gen, bao gồm vắc xin truyền vi rút, vắc xin DNA và vắc xin mRNA; thứ ba, sự kết hợp của cả phương pháp tiếp cận dựa trên protein và dựa trên gen, chẳng hạn như vắc xin vi rút sống giảm độc lực. Công nghệ DNA, như các chiến lược vắc xin dựa trên gen mới, có thể nhanh chóng so sánh nhiều chiến lược và ứng cử viên vắc xin trong quá trình thử nghiệm tiền lâm sàng [16,17]. Về mặt lý thuyết, hầu hết tất cả các protein của virus đều là các chất tạo miễn dịch và mục tiêu vắc xin tiềm năng. Tuy nhiên, theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, khả năng sinh miễn dịch và khả năng bảo vệ của vắc xin DNA tổng hợp trong việc mã hóa protein S của SARS-CoV-2 và các protein cấu trúc khác vẫn chưa được báo cáo một cách có hệ thống. Bốn loại vắc xin DNA biểu hiện protein SARS-CoV-2 S, N, E và M l đã được đánh giá về khả năng sinh miễn dịch và hiệu quả bảo vệ ở chuột để khám phá tác dụng miễn dịch của S khi kết hợp với các protein cấu trúc khác.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Tế bào

Tế bào Huh7.5 và tế bào 293T của thận phôi người được nuôi cấy ở nhiệt độ 37 ◦C trong môi trường ẩm ở mức 5% CO2 trong suốt nghiên cứu. Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM (HyClone, Logan, UT, USA), được bổ sung 10% FBS (GEMINI Co., Thượng Hải, Trung Quốc) và 1% penicillin-streptomycin (Gibco, New York, NY, USA). Tất cả các dòng tế bào được xác nhận là âm tính với ô nhiễm mycoplasma.

2.2. Xây dựng mã hóa vắc xin DNA SARS-CoV-2 S/N/E/M

Gen mã hóa protein S/N của SARS-CoV-2, chứa trình tự Kozak đầu N (GCCACC), theo sau là codon khởi đầu (ATG), được tổng hợp bằng cách sử dụng codon được tối ưu hóa cho động vật có vú (GenScript Co., Nanjing , Trung Quốc). Sau đó, nó được nhân bản vào vectơ biểu hiện pcDNA3.1 (+) thông qua quá trình tiêu hóa EcoRI và XbaI và được đặt tên là pS/pN (vắc xin DNA) (Hình 1A). Protein pE/PM được xây dựng và xác định như mô tả trước đây [15]. Vắc xin được điều chế bằng cách sử dụng bộ dụng cụ Maxiprep không chứa nội độc tố (Qiagen, Bắc Kinh, Trung Quốc) và trình tự đã được xác nhận bằng cách sử dụng trình tự DNA Sanger. Sự biểu hiện của protein S/N đã được xác nhận bằng cách sử dụng phương pháp làm mờ phương Tây và kháng thể kháng S (Sino Bio, Bắc Kinh, Trung Quốc)/kháng thể N được pha loãng ở tỷ lệ 1:1000. Những thí nghiệm này được tiến hành như mô tả trước đây [15,18].

Hình 1. Thiết kế và biểu hiện cấu trúc vắc xin protein S/N SARS-CoV-2 dựa trên DNA tái tổ hợp. (A) Sơ đồ của vắc xin dựa trên DNA tái tổ hợp mã hóa các protein tăng đột biến SARS-CoV-2 (PS), nucleocapsid (pN), vỏ (pE) và/hoặc màng (PM). (B) Sự biểu hiện protein mục tiêu trong vắc xin DNA đã được xác nhận thông qua phân tích Western blot của các tế bào 293T được thay thế bằng các plasmid pS/pN/pE/pM.

2.3. Tiêm chủng và thách thức

Chuột BALB/c cái (Phòng thí nghiệm Charles River, Pháp) lúc 6 tuần tuổi được nuôi tại Viện Sức khỏe Nghề nghiệp và Kiểm soát Chất độc Quốc gia trong môi trường được kiểm soát độ ẩm và nhiệt độ 21 ◦C với chu kỳ sáng/tối 12 giờ. Trong khi đó, thức ăn và nước uống được cung cấp tự do và tất cả các thí nghiệm trên động vật đều được Ủy ban Đạo đức Thí nghiệm Động vật của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Trung Quốc (CDC Trung Quốc) phê duyệt. Nghiên cứu tuân thủ các quy định đạo đức có liên quan.

Chuột được chia ngẫu nhiên thành năm nhóm và được chủng ngừa riêng pS/pN hoặc được chủng ngừa đồng thời với pS + pN hoặc pS + pE + PM vào các ngày 0, 21 và 42 thông qua tiêm bắp cộng với điện di (35 mg/50 mL) (Hình 2) [19,20]. Tóm lại, vắc xin DNA đã được tiêm vào cơ chày trước (TA) và ngay lập tức phát xung điện bằng cách sử dụng điện cực mảng hai kim cách nhau 5 mm (ECM830; BTX) bằng kim. Huyết thanh từ chuột được thu thập để phân tích phản ứng miễn dịch dịch thể và lá lách của chuột được xử lý để đo phản ứng miễn dịch tế bào (Hình 2).

Hình 2. Sơ đồ tiêm chủng và thử thách SARS-CoV-2. Thời gian tiêm chủng, thử thách và lấy mẫu máu/mô. Chuột BALB/C được chia ngẫu nhiên thành các nhóm.

Các thử nghiệm thử thách SARS-CoV-2 đã được tiến hành như mô tả trước đây [15,21]. Tóm lại, chuột được gây mê và sau đó được truyền qua đường mũi với 2,5 × 108 PFU của Ad5-hACE2 với tổng thể tích là 45 µL. Năm ngày sau khi tải nạp, chuột được gây mê và sau đó thử thách qua mũi với 1 × 105 TCID50 của SARS-CoV-2 (Vũ Hán/IVDC HB-02/2019) trong tổng thể tích 50 µL nước muối đệm. Tất cả công việc với SARS-CoV-2 sống trên mô hình chuột đều được thực hiện trong phòng thí nghiệm An toàn sinh học động vật cấp 3 (ABSL{22}}).

2.4. Xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết với enzyme

Các xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA) đã được tiến hành như mô tả trước đây [15]. Tóm lại, protein S (được mua từ Sino Biology)/N protein (quà tặng từ Song) được pha loãng trong dung dịch đệm cacbonat (0.1 M, pH 9,6) được phủ lên các tấm EIA/RIA giếng 96-(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) qua đêm ở nhiệt độ 4 ◦C. Các đĩa được chặn bằng 200 µL huyết thanh dê 10% trong PBS ở nhiệt độ 37 ◦C trong 2 giờ, sau đó rửa năm lần bằng PBST. Sau đó, các mẫu huyết thanh được pha loãng huyết thanh trong huyết thanh dê 2% trong PBS được thêm vào và ủ trong 2 giờ ở 37 ◦C, sau đó rửa năm lần bằng PBST. IgG Ab kháng chuột kết hợp với HRP (1:5000) được thêm vào ở 37 ◦C trong 1 giờ. Tổng cộng 100 µL chất nền TMB được thêm vào mỗi giếng và được làm nguội bằng 50 µL H2SO4 2M. Độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 450 nm bằng SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, Hồng Kông, Trung Quốc).

cistanche thực vật tăng cường hệ thống miễn dịch

Nhấn vào đây để xem các sản phẩm Tăng cường miễn dịch Cistanche

【Hỏi thêm] Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Các thí nghiệm trung hòa và lây nhiễm Pseudovirus

Thử nghiệm trung hòa pseudovirus đã được thực hiện như mô tả trước đây [21,22]. Một plasmid biểu hiện protein S của virus tổ tiên đã được tạo ra trước đây [22]. Gen protein tăng đột biến SARS-CoV-2 biến thể Omicron (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) đã được tổng hợp (một món quà từ Vazyme Biotech Co., Ltd., Nam Kinh, Trung Quốc) sử dụng codon được tối ưu hóa cho động vật có vú và được nhân bản vào vectơ pcDNA3.1, như được mô tả trước đây [22]. Tóm lại, các plasmid biểu hiện chất báo cáo luciferase và các plasmid biểu hiện protein S được đồng chuyển nhiễm vào các tế bào HEK 293T bằng cách sử dụng Thuốc thử chuyển nhiễm DNA X-treme GENE HP. Quá trình nuôi cấy tế bào được làm mới 6 giờ sau khi truyền nhiễm và chất nổi phía trên chứa pseudovirus được thu hoạch sau 48 giờ và được bảo quản ở -70 ◦C. Trong xét nghiệm trung hòa pseudovirus, hỗn hợp huyết thanh-vi rút tương đương sau đó được ủ ở 37 thể tích chất nổi phía trên chứa pseudovirus và sau đó được thêm vào huyết thanh pha loãng. ◦C trong 1 giờ. Sau đó, môi trường nuôi cấy tế bào Huh7.5 được thay thế bằng 100 µL hỗn hợp virus-huyết thanh và được ủ ở 37 ◦C trong 12 giờ. Các tế bào chỉ được nuôi cấy với pseudovirus SARS-CoV{28}} được chạy song song. Sau đó, môi trường được thay thế bằng DMEM (2% FBS) và ủ ở 37 ◦C trong 48 giờ. Sau đó, tín hiệu luciferase được đo bằng bộ luciferase đom đóm Bright-Glo (Promega).

2.6. Xét nghiệm trung hòa SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 (Vũ Hán/IVDC-HB-02/2019) đã được sử dụng trong thí nghiệm này. Tóm lại, huyết thanh được pha loãng gấp đôi so với độ pha loãng ban đầu là 1:10, trộn với một thể tích bằng nhau (10–15 pfu/giếng) của SARS-CoV sống-2 và ủ trong 1 giờ ở 37 ◦C, sau đó chúng được thêm vào các tế bào Vero đã được gieo hạt. Sau khi ủ ở 37 ◦C trong 48 giờ, người ta đã quan sát thấy hiệu ứng bệnh lý tế bào (CPE) và 100 µL chất nổi trên bề mặt nuôi cấy được thu hoạch để chiết xuất axit nucleic và PCR phiên mã ngược huỳnh quang thời gian thực (RT-PCR). Liều trung hòa trung bình (ND50) được tính toán bằng phương pháp Reed–Munch [15].

2.7. Xét nghiệm IFN- ELISpot

Các nhóm peptit bao trùm toàn bộ protein S/N/E/M dưới dạng các sự kết hợp 15-liên tiếp trên lớp phủ của 10 axit amin được tổng hợp bởi Scilight Biotechnology, LLC. Mỗi lọ có khoảng 2,5 mg peptit tinh khiết trong nhóm peptit. Thí nghiệm được tiến hành như mô tả trước đây [18]. Tóm lại, 96-các đĩa giếng (BD ELISPOT Set, USA) được phủ Ab chống bắt IFN và ủ qua đêm ở 4 ◦C. Các đĩa được chặn bằng môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh sau khi rửa ba lần. Tế bào lách được thu hoạch sau khi chuột được tiêu hủy vào ngày thứ 35 và 120. Huyền phù tế bào đơn tươi từ mỗi nhóm được mạ ở mức 5 × 106 mỗi giếng và peptide được thêm vào. Sau đó, các đĩa được ủ ở 37 ◦C trong 5% CO2 trong 22 giờ và được phát hiện bằng máy đọc đĩa ELISpot (Biosys, So. Pasadena, CA, USA). Đơn vị tạo điểm (SFU) đại diện cho IFN- tiết ra tế bào T.

2.8. Thử thách đánh giá khả năng bảo vệ ở chuột sau SARS-CoV-2

Các thí nghiệm được tiến hành như mô tả trước đây [15,21]. Tóm lại, phổi được thu hoạch sau khi những con chuột bị chết. Một nửa số mô được sử dụng để chiết xuất axit nucleic, RT-PCR huỳnh quang thời gian thực và TCID50. Nửa còn lại được gửi đến Trường Cao đẳng Thú y, Đại học Nông nghiệp Trung Quốc để đánh giá bệnh lý.

2.9. Phân tích thống kê

Các thử nghiệm t không ghép đôi, thử nghiệm ANOVA hai chiều và thử nghiệm so sánh nhiều lần của Dunnett được thực hiện bằng cách sử dụng GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software LLC). giá trị p < 0.05 được coi là có ý nghĩa thống kê (* p < 0.05; ** p < 0.01; * ** p < 0,001; **** p < 0,0001).

3. Kết quả

3.1. Đặc tính của vắc xin DNA

Nồng độ protein E và M được phát hiện bằng phương pháp Western blot. Chúng tôi đã đo biểu hiện của protein S/N/E/M được mã hóa của SARS-CoV-2 trong các tế bào T HEK-293được truyền plasmid pS/pN/pE/pM thông qua phân tích Western blot, sử dụng kháng thể kháng virus. -S/kháng thể kháng N và kháng thể kháng-6 x His, trong tế bào bị ly giải. Các dải xấp xỉ trọng lượng phân tử dự đoán của các protein S (140–142 kDa), N (45 kDa), E (10 kDa) và M (22–25 kDa) (Hình 1B).

3.2. Sản xuất IgG kháng S và/hoặc kháng N mạnh mẽ và bền vững được tạo ra bởi DNA pS và/hoặc pN

Huyết thanh Vắc-xin được thu thập từ chuột BALB/c vào lúc 35, 56, 96 và 120 ngày (Hình 2). Nồng độ IgG kháng S/anti-N được phát hiện bằng ELISA. Mức độ đáp ứng IgG đặc hiệu S hoặc N do pS hoặc pN gây ra đã tăng lên trong huyết thanh sau lần tăng cường thứ nhất và thứ hai. Hiệu giá IgG kháng S và kháng N ở nhóm pS + pN cao hơn so với các nhóm khác; tuy nhiên, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (Hình 3A, B). Không phát hiện thấy phản ứng kháng thể đặc hiệu với protein E/M mạnh mẽ nào, điều này phù hợp với kết quả của nghiên cứu trước đó (dữ liệu không được hiển thị) [15].

Hình 3. Phản ứng của tế bào B với SARS-CoV-2 ở chuột BALB/c. (A) Hiệu giá điểm cuối liên kết IgG trong huyết thanh đối với protein SARS-CoV-2 S (A) và N (B). (C) Hiệu giá trung hòa được xác định dựa trên hệ thống vi rút giả SARS-CoV-2. (D) Hiệu giá trung hòa Anti-SARS-CoV-2 được xác định bằng cách sử dụng vi rút SARS-CoV-2. (E) Xét nghiệm trung hòa dựa trên hệ thống vi rút giả Omicron SARS-CoV-2. Tỷ lệ ức chế đối với huyết thanh từ các nhóm giả (xanh dương), pS (đỏ), pS + pN (xanh lá cây), pS + pE + pM (hồng) và pN (cam) được hiển thị. Các thanh lỗi biểu thị SEM và giá trị p được tính toán bằng cách sử dụng phân tích hậu kiểm ANOVA và Sidak hai chiều, trong đó * p < 0.05

3.3. Mức độ kháng thể trung hòa cao được tạo ra bằng cách đồng chủng ngừa với vắc xin pS và pN

Hiệu giá trung hòa của các mẫu huyết thanh được pha loãng theo từng giai đoạn được xác định bằng cách sử dụng vi rút SARS-CoV-2 giả. Mức kháng thể trung hòa (nAbs) cao nhất được quan sát thấy trong nhóm pS + pN, với hiệu giá trung bình hình học EC50 đối ứng đạt 2988 (vào ngày 35) và 3578 (vào ngày 56) (Hình 3C). Các kết quả tương tự cũng được quan sát bằng cách sử dụng xét nghiệm vi trung hòa virus sống (MN), trong đó mức nAbs trong nhóm pS + pN cao hơn so với nhóm S vào ngày 56 và 96 (p < 0.05; Hình 3D). Hơn nữa, mức nAbs trong nhóm pS + pN vào ngày 56 (lần tăng thứ hai) cao hơn đáng kể so với mức ở ngày 35 (p < 0,05; Hình 3D).

Hoạt tính trung hòa của từng chế độ vắc xin chống lại biến thể Omicron của SARS-CoV-2 được xác định thêm bằng cách sử dụng nền tảng giả và mẫu huyết thanh. Cấu hình trung hòa chống lại vi rút Omicron vào ngày 35 và 56 tương tự như cấu hình chống lại vi rút tổ tiên (Hình 3E), cho thấy rằng phương pháp điều trị bằng PS + pN có hiệu lực trung hòa chéo.

cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch

3.4. Phản ứng của tế bào T được tạo ra bởi vắc xin DNA

Như đã mô tả trước đây, phản ứng của tế bào T chống lại kháng nguyên S/N/E/M của SARS-CoV-2 được ước tính bằng cách sử dụng IFN-ELISpot, như đã mô tả trước đây [15]. Đúng như dự đoán, cả hai chế độ điều trị PS + pN và pS + pE + pM đều tạo ra mức tế bào IFN + T đặc hiệu cho protein S vào ngày 120 cao hơn đáng kể so với ngày 35 (p < 0. 05; Hình 4A). Hơn nữa, số lượng tế bào IFN + T đặc hiệu cho protein N vào ngày thứ 120 (lần tăng thứ hai) cao hơn đáng kể so với ngày thứ 35 ở nhóm pS + pN (p < 0,05; Hình 4B). Cuối cùng, số lượng tế bào IFN + T đặc hiệu cho protein M vào ngày thứ 120 (lần tăng thứ hai) cao hơn đáng kể so với ngày thứ 35 ở cả hai nhóm (p < 0,05; Hình 4D).

Hình 4. Phản ứng của tế bào T với các protein cấu trúc riêng lẻ của SARS-CoV-2 ở chuột BALB/c. (A) Phản ứng của tế bào T được đo bằng IFN-ELISpot trong tế bào lách được kích thích trong 20 giờ với các nhóm peptide chồng chéo trải rộng trên SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, và (D) M protein. Thanh đại diện cho giá trị trung bình ± SD. Các phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng bài kiểm tra hậu kiểm ANOVA và Sidak hai chiều, trong đó * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,01 và **** p < 0,0001.

3.5. Bảo vệ hiệp lực được tạo ra bằng cách đồng chủng ngừa với pS/pN hoặc pS/pE/pM

Sau đó, chúng tôi đã đánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc xin DNA bằng cách sử dụng chuột hACE2 được tiêm chủng sau thử thách với vi rút SARS-CoV-2 tổ tiên. Sau thử thách, những con chuột trong nhóm thử nghiệm có biểu hiện giảm cân dần dần. Ngược lại, những con chuột được tiêm pS hoặc pS+ cho thấy giảm cân nhẹ ngay sau khi bị nhiễm bệnh, sau đó là phục hồi (Hình 5A). Không phát hiện thấy vi-rút sống ở những con chuột được tiêm vắc-xin pS, pS + pN hoặc pS + pE + pM. Hơn nữa, việc tiêm vắc xin pS + pN làm giảm đáng kể số lượng bản sao RNA của virus so với số lượng chỉ tiêm vắc xin pS (p=0.0228; Hình 5B). Hơn nữa, mô bệnh học phổi đã chứng minh rằng chuột ở cả nhóm giả và nhóm pN đều có các mảng viêm khu trú, lõm màng phổi, xẹp phế nang, thâm nhiễm tế bào viêm ở mức độ cao và các vùng xuất huyết. Khi so sánh, những con chuột được điều trị bằng pS + pN hoặc pS + pE + pM biểu hiện những thay đổi mô bệnh học nhẹ hơn và điểm INHAND sau thử thách thấp hơn so với nhóm khác (Hình 5C).

Hình 5. Hiệu quả bảo vệ của việc tiêm chủng sau khi tiếp xúc với vi rút SARS-CoV-2 sống. (A) Chuột được cân hàng ngày (trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (SEM), n=4) trong ba ngày sau thử thách. (B) Hiệu giá SARS-CoV-2 truyền nhiễm trong các chất đồng nhất ở phổi vào ngày thứ ba sau thử thách, được xác định thông qua xét nghiệm TCID5{{10}} và số bản sao RNA. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm được xác định bằng cách sử dụng ANOVA một chiều, sau đó là hiệu chỉnh so sánh nhiều lần của Dunnett (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 và **** p < 0,0001). (C) Phân tích mô bệnh học phổi bằng phương pháp nhuộm H&E.

4. Thảo luận

Trong nghiên cứu này, việc đồng chủng ngừa với hai loại vắc xin DNA biểu hiện protein S và N đã tạo ra hàm lượng nAbs cao và có hiệu quả cao trong việc giảm tải lượng vi rút SARS-CoV-2 ở chuột. Vắc-xin DNA biểu hiện protein S làm tăng mức độ miễn dịch tế bào đặc hiệu với protein S sau ba lần chủng ngừa khi chuột được tiêm chủng đồng thời với protein N/E và M và làm giảm bớt những thay đổi mô bệnh học sau thử thách. Theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, đây là báo cáo đầu tiên tiết lộ sự tăng cường tổng hợp khả năng miễn dịch và bảo vệ ở chuột sử dụng vắc xin DNA mã hóa protein S khi chúng được tiêm chủng cùng lúc với vắc xin DNA mã hóa các protein cấu trúc khác của SARS-CoV{{8 }}.

cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch

Các epitope tế bào B chiếm ưu thế miễn dịch ở vùng kháng nguyên N đã được quan sát thấy trong một số nghiên cứu. Vắc xin dựa trên N thường không thể tạo ra nAbs, có thể là do protein N không hiển thị trên bề mặt virus. Đáng chú ý, việc đồng chủng ngừa với protein S và N đã tạo ra mức độ nAbs chống lại vi rút tổ tiên và vi rút Omicron SARS-CoV-2 cao hơn so với các nhóm khác. Phản ứng nAb tăng lên có liên quan đến khả năng thanh thải virus và hiệu quả bảo vệ tốt hơn. Kết quả của chúng tôi đã chứng minh rằng phương pháp điều trị bằng pS + pN hiệu quả hơn phương pháp điều trị bằng pS đơn thuần trong việc giảm tải lượng vi rút SARS-CoV-2 sau thử thách. Một nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng chuột đồng được tiêm vắc-xin cùng biểu hiện protein M và N được bảo vệ khỏi tình trạng giảm cân nghiêm trọng và bệnh lý phổi, đồng thời đã giảm đáng kể nồng độ vi-rút ở hầu họng và phổi sau thử thách sau SARS-CoV{12}}, phù hợp với kết quả của chúng tôi [23]. Thật không may, việc giảm hiệu giá vi rút không thể được quy cho cụ thể là do protein M hoặc N và mức nAb không được đánh giá trong nghiên cứu này. Một nghiên cứu về vắc xin mRNA SARS-CoV-2 đã báo cáo rằng việc đồng miễn dịch S + N đã tạo ra phản ứng tế bào T CD8+ đặc hiệu S tăng cường và vô hiệu hóa hoạt động của kháng thể, giúp bảo vệ phổi tốt hơn chống lại Delta biến thể so với riêng S, phù hợp với kết quả của nghiên cứu này [24]. Một nghiên cứu khác báo cáo rằng protein N của vi rút Corona gây viêm dạ dày ruột lây truyền đã thúc đẩy quá trình tổng hợp kháng thể trung hòa khi tế bào TGEV-IMMUNE của lợn được kích thích bằng sự kết hợp của protein S và N trong ống nghiệm, và tác dụng này có thể được giải thích bằng phản ứng của tế bào lympho T trợ giúp đối với protein N [25].

Các epitop tế bào T CD{0}}/CD8+ chiếm ưu thế miễn dịch ở vùng kháng nguyên N đã được xác định trước đó. Một số nghiên cứu đã báo cáo rằng vắc xin dựa trên protein N của SARS-CoV-2 tạo ra phản ứng miễn dịch tế bào một cách hiệu quả. Nhóm S + N cho thấy mức độ miễn dịch tế bào đặc hiệu với protein S tăng lên sau ba lần chủng ngừa. Một nghiên cứu vắc xin mRNA SARS-CoV-2 đã báo cáo rằng S + N kết hợp tạo ra phản ứng tế bào T CD8+ đặc hiệu S tăng cường so với chỉ dùng S, điều này phù hợp với kết quả của chúng tôi [24]. Một nghiên cứu khác báo cáo rằng phản ứng của tế bào T với kháng nguyên S và N sau khi chỉ tiêm vắc xin cơ bản hAd5 S + N kháng nguyên kép là tương đương với phản ứng của những bệnh nhân đã nhiễm SARS-CoV{20}} trước đó và trong các mô hình dự đoán silico của tế bào T Sự liên kết của epitope HLA cho thấy rằng phản ứng của tế bào T với vắc xin hAd5 S + N sẽ giữ được hiệu quả chống lại biến thể B.1.351. Hơn nữa, huyết tương của những bệnh nhân bị nhiễm SARS-CoV{28}}trước đây cho thấy ái lực gắn kết cao hơn với các tế bào biểu hiện cấu trúc kháng nguyên kép S-Fusion + N-ETSD so với chỉ hAd5 S-Fusion, điều này càng gợi ý thêm rằng khả năng sinh miễn dịch của Vắc-xin kháng nguyên kép S + N tốt hơn vắc-xin kháng nguyên đơn S [26].

Virus sống không được phát hiện trong phổi và tình trạng giảm cân sau thử thách được giảm nhẹ ở các nhóm pS, pS + pN và pS + pE + pM, trong khi phương pháp điều trị pN không làm giảm hiệu quả hiệu giá virus một cách hiệu quả. Những phát hiện này nhấn mạnh tính không thể thiếu và tính hiệu quả của protein S như một mục tiêu của vắc xin. Đáng chú ý, việc đồng chủng ngừa pS và pN có tác dụng tốt hơn pS hoặc pN trong việc thanh thải virus. Nhóm pS + pE + pM cho thấy ít thay đổi mô bệnh học ở phổi hơn, điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đây của chúng tôi [15]. Nhóm S + N có số lượng bản sao RNA virus trong phổi thấp, giảm cân ít hơn và có thời gian phục hồi nhanh sau thử thách sau SARS-CoV{11}} so với nhóm chỉ được tiêm chủng S/N, điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu kết quả của nghiên cứu này. Tuy nhiên, không có nhóm nào phát hiện được hiệu giá kháng thể trung hòa, điều này có thể được giải thích là do sự khác biệt về chủng loại vắc xin và động vật thí nghiệm [26]. Một nghiên cứu về vắc xin vectơ adenovirus SARS-CoV-2 đã báo cáo rằng vắc xin S chỉ mang lại khả năng bảo vệ não cấp tính khi được tiêm đồng thời với vắc xin N [27]. Một nghiên cứu khác đã phát triển các vắc xin Tri: ChAd, Bi: ChAd và Mono: ChAd lần lượt biểu hiện các protein S1/N/RdRp, N/RdRp và S1 và thử nghiệm chúng trên mô hình động vật B.1.351. Bệnh lý tổng thể rộng rãi đã được quan sát thấy ở Mono: ChAdlungs, trong khi phổi Bi: ChAd và Tri: ChAd gần như không có bệnh lý này [28].

Hơn nữa, động vật chưa được tiêm phòng có lượng virus trong phổi cao, trong khi phương pháp điều trị Tri: ChAd làm giảm đáng kể lượng virus xuống 3,5 log. Để so sánh, cả vắc xin Bi: ChAd và Mono: ChAd chỉ làm giảm tải lượng vi rút ở mức độ vừa phải. Những kết quả này cho thấy hiệu quả bảo vệ của vắc xin kháng nguyên kép S/N chống lại các biến thể có thể tốt hơn so với vắc xin kháng nguyên đơn S, điều này phù hợp với kết quả của chúng tôi [28]. Một số nghiên cứu đã báo cáo rằng những con chuột được tiêm chủng protein N sẽ bị viêm phổi nghiêm trọng sau khi nhiễm SARS-CoV [29–31]. Các nghiên cứu trước đây cũng đã báo cáo rằng việc chủng ngừa bằng vắc xin vectơ adenovirus biểu hiện protein N của Virus viêm gan chuột sẽ bảo vệ chuột chống lại nhiễm trùng gây chết người, điều này chứng tỏ rằng protein N có thể tạo ra tác dụng bảo vệ [32]. Hơn nữa, nhóm được tiêm vắc xin CRT/N DNA có hiệu giá vi rút giảm đáng kể sau thử thách, với vi rút vaccinia biểu hiện protein SARS-CoV N [33].

cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch

Một nghiên cứu về protein S đã chứng minh rằng vắc xin kết hợp DNA/protein tạo ra cả khả năng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào tốt hơn so với vắc xin DNA/protein đơn thuần [8]. Các loại vắc xin chỉ nhắm mục tiêu vào protein S đã cho thấy hiệu quả giảm đi trong việc bảo vệ chống lại COVID ở mức độ nhẹ đến trung bình-19 do các biến thể mới nổi gây ra. Vai trò của các protein cấu trúc SARS-CoV-2 được bảo tồn, bao gồm cả protein N/E/M, rất đáng được chú ý trong thiết kế và ứng dụng vắc xin, vì phản ứng của tế bào T do vắc xin tạo ra đối với các epitop được bảo tồn thường không bị ảnh hưởng bởi đột biến . Một nghiên cứu báo cáo rằng những bệnh nhân đã khỏi bệnh SARS (n=23) vẫn sở hữu các tế bào T trí nhớ lâu dài phản ứng với protein SARS-CoV N 17 năm sau đợt bùng phát năm 2003, cho thấy khả năng phản ứng chéo mạnh mẽ với SARS CoV{ {15}} Protein N, xác nhận thêm việc sử dụng protein N làm mục tiêu vắc xin bảo vệ chéo [34]. Nghiên cứu này đã chứng minh rằng việc đồng chủng ngừa pS/pN có liên quan đến phản ứng nAb cao hơn, khả năng thanh thải virus tốt hơn và phản ứng miễn dịch tế bào được cải thiện, đồng thời có thể mang lại khả năng bảo vệ tốt hơn sau thử thách với SARS-CoV{20}} so với chỉ dùng pS. Hơn nữa, các biến thể SARS-CoV{22}} đã được chứng minh là lây nhiễm cho nhiều loài động vật và việc lây truyền từ người sang động vật đã được quan sát thấy ở một số động vật hoang dã và vật nuôi [7]. Vì vậy, vắc xin SARS-CoV{27}} thú y cần được chú ý nhiều hơn. Ngoài ra, công nghệ nano có thể là một công cụ mạnh mẽ trong việc tối ưu hóa vắc xin và đáng được quan tâm hơn [2].

Kết quả nghiên cứu này có một số hạn chế. Đầu tiên, chúng tôi chỉ quan sát chiến lược vắc xin DNA ở chuột BALB/c và các nghiên cứu trong tương lai sẽ đánh giá tác động miễn dịch của các chế độ vắc xin này trên các mô hình động vật khác. Thứ hai, cần có nghiên cứu bổ sung để hiểu đầy đủ các cơ chế phân tử làm cơ sở cho các phản ứng tế bào T CD8 đặc hiệu nAb và S tăng cường được tạo ra bởi quá trình đồng chủng ngừa bằng cách sử dụng protein S và N, đồng thời khai thác kiến ​​thức này để tối ưu hóa COVID-19 thiết kế vắc xin. Cuối cùng, chức năng của kháng thể đặc hiệu với protein N đáng được nghiên cứu thêm.

cistanche tubulosa-cải thiện hệ thống miễn dịch

Tóm lại, nghiên cứu này đã đánh giá khả năng bảo vệ miễn dịch của việc đồng chủng ngừa với các protein S, N, E và M của SARS-CoV-2. Một số loại vắc xin chỉ nhắm tới protein S có tác dụng bảo vệ giảm đối với các chủng biến thể mới nổi. Kết quả của chúng tôi sẽ đặt nền tảng cho việc phát triển vắc xin COVID-19 phản ứng chéo nhằm kiểm soát các biến thể SARS-CoV-2 hiện tại và mới nổi, đồng thời ngăn chặn các đại dịch -coronavirus tiềm ẩn.

Người giới thiệu

1. Zmievskaya, E.; Valiullina, A.; Ganeeva, tôi.; Petukhov, A.; Rizvanov, A.; Bulatov, E. Ứng dụng liệu pháp tế bào CAR-T ngoài ung thư: Bệnh tự miễn và nhiễm virus. Y sinh học 2021, 9, 59. [CrossRef] [PubMed]

2. Rashidzadeh, H.; Danafar, H.; Rahimi, H.; Mozafari, F.; Salehiabar, M.; Rahmati, MA; Rahamooz-Haghighi, S.; Mousazadeh, N.; Mohammadi, A.; Ertas, YN; et al. Công nghệ nano chống lại vi-rút Corona mới (Hội chứng hô hấp cấp tính nặng do vi-rút Corona 2): Chẩn đoán, điều trị, trị liệu và triển vọng trong tương lai. Y học nano 2021, 16, 497–516. [Tham khảo chéo]

3. Fontanet, A.; Cauchemez, S. COVID-19 miễn dịch bầy đàn: Chúng ta đang ở đâu? Nat. Linh mục Miễn dịch. 2020, 20, 583–584. [CrossRef] [PubMed]

4. Jeyanathan, M.; Afkhami, S.; Smaill, F.; Miller, MS; Lichty, BD; Xing, Z. Những cân nhắc về miễn dịch học đối với chiến lược vắc xin ngừa COVID-19. Nat. Linh mục Miễn dịch. 2020, 20, 615–632. [CrossRef] [PubMed]

5. Vandelli, A.; Monti, M.; Milanetti, E.; Armaos, A.; Rupert, J.; Zacco, E.; Bechara, E.; Delli Ponti, R.; Tartaglia, GG Phân tích cấu trúc của bộ gen SARS-CoV-2 và dự đoán về cơ chế tương tác của con người. Axit nucleic Res. 2020, 48, 11270–11283. [CrossRef] [PubMed]

6. Jackson, CB; Farzan, M.; Chen, B.; Choe, H. Cơ chế xâm nhập của SARS-CoV-2 vào tế bào. Nat. Linh mục Mol. Tế bào sinh học. 2022, 23, 3–20. [Tham khảo chéo]

7. Conforti, A.; Sánchez, E.; Salvatori, E.; Lione, L.; Compagnone, M.; Pinto, E.; Palombo, F.; D'Acunto, E.; Muzi, A.; Roscilli, G.; et al. Một ứng cử viên vắc xin DNA tuyến tính mã hóa Miền liên kết với thụ thể SARS-CoV-2 tạo ra phản ứng miễn dịch mạnh mẽ và kháng thể trung hòa ở mèo nhà. Mol. Đó. Phương pháp lâm sàng. Dev. 2023. [Tham khảo chéo]

8. Borgoykova, MB; Karpenko, LI; Merkulyeva, IA; Shcherbkov, DN; Rudometov, AP; Starostina, EV; Shanshin, DV; Isaeva, AA; Nesmeyanova, VS; Volkova, NV; et al. Khả năng miễn dịch của Vắc xin kết hợp DNA/Protein chống lại COVID-19. Bò đực. Exp. Biol. Med. 2023, 1–4. [Tham khảo chéo]

9. Qu, L.; Yi, Z.; Thần, Y.; Lâm, L.; Chen, F.; Xu, Y.; Ngô, Z.; Tăng, H.; Trương, X.; Thiên, F.; et al. Vắc xin RNA dạng vòng chống lại SARS-CoV-2 và các biến thể mới nổi. Ô 2022, 185, 1728–1744.e16. [Tham khảo chéo]

10. Corbett, KS; Edwards, DK; Leist, SR; Abiona, OM; Boyoglu-Barnum, S.; Gillespie, RA; Himansu, S.; Schäfer, A.; Ziwawo, CT; DiPiazza, AT; et al. Thiết kế vắc xin mRNA SARS-CoV-2 được kích hoạt nhờ khả năng chuẩn bị sẵn mầm bệnh nguyên mẫu. Thiên nhiên 2020, 586, 567–571. [Tham khảo chéo]

11. Thiên, JH; Patel, N.; Haupt, R.; Châu, H.; Weston, S.; Hammond, H.; Logue, J.; Portnoff, A.; Norton, J.; Guebre-Xabier, M.; et al. Ứng cử viên vắc xin glycoprotein tăng đột biến SARS-CoV-2 NVX-CoV2373 ở khỉ đầu chó và khả năng bảo vệ ở chuột. Nat. Cộng đồng. 2021, 12, 372. [CrossRef] [PubMed]

12. Andreano, E.; Paciello, tôi.; Piccini, G.; Manganaro, N.; Pileri, P.; Hyseni, tôi.; Leonardi, M.; Pantano, E.; Abiento, V.; Benincasa, L.; et al. Khả năng miễn dịch lai cải thiện tế bào B và kháng thể chống lại các biến thể SARS-CoV-2. Thiên nhiên 2021, 600, 530–535. [Tham khảo chéo]

13. Naqvi, AAT; Fatima, K.; Mohammad, T.; Fatima, U.; Singh, IK; Singh, A.; Atif, SM; Hariprasad, G.; Hasan, GM; Hassan, MI Hiểu biết sâu sắc về bộ gen, cấu trúc, sự tiến hóa, sinh bệnh học và liệu pháp điều trị của SARS-CoV-2: Phương pháp tiếp cận bộ gen cấu trúc. Biochim. Sinh lý. Acta Mol. Nền tảng. Dis. 2020, 1866, 165878. [CrossRef] [PubMed]

14. Abbasi, J. Vắc xin DNA DNA-19 mới của Ấn Độ dành cho thanh thiếu niên và người lớn là vắc xin đầu tiên. JAMA 2021, 326, 1365. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, J.; Đặng, Y.; Hoàng, B.; Tay.; Vương, W.; Hoàng, M.; Zhai, C.; Triệu, Z.; Dương, R.; Triệu, Y.; et al. Vắc xin DNA biểu hiện protein vỏ và màng cung cấp sự bảo vệ một phần chống lại SARS-CoV-2 ở chuột. Đằng trước. Miễn dịch. 2022, 13, 827605. [Tham khảo chéo]

16. Tebas, P.; Kraynyak, KA; Patel, A.; Maslow, JN; Ngày mai, nghị sĩ; Sylvester, AJ; Knoblock, D.; Gillespie, E.; Amante, D.; Racine, T.; et al. Vắc xin DNA SynCon®Ebola GP trong da có nhiệt độ ổn định và thể hiện an toàn các ưu điểm về khả năng miễn dịch tế bào và dịch thể ở những tình nguyện viên khỏe mạnh. J. Lây nhiễm. Dis. 2019, 220, 400–410. [Tham khảo chéo]

17. Smith, TRF; Patel, A.; Ramos, S.; Elwood, D.; Chu, X.; Yên, J.; Gary, VN; Walker, SN; Schultheis, K.; Purwar, M.; et al. Khả năng miễn dịch của vắc xin DNA ứng cử viên cho COVID-19. Nat. Cộng đồng. 2020, 11, 2601. [Tham khảo chéo]

18. Triệu, Z.; Đặng, Y.; Ngưu, P.; Bài hát, J.; Vương, W.; Du, Y.; Hoàng, B.; Vương, W.; Trương, L.; Triệu, P.; et al. Đồng chủng ngừa bằng vắc xin CHIKV VLP và DNA tạo ra phản ứng hài hước đầy hứa hẹn ở chuột. Miễn dịch phía trước. 2021, 12, 655743. [Tham khảo chéo]

19. Quan, J.; Đặng, Y.; Chen, H.; Âm, X.; Dương, Y.; Tan, W. Sử dụng hai loại vắc xin DNA biểu hiện protein NS3 của virus viêm gan C nhắm mục tiêu vào các tế bào đuôi gai sẽ tạo ra tiềm năng bảo vệ dị loại vượt trội ở chuột. Vòm. Virus. 2015, 160, 2517–2524. [Tham khảo chéo]

20. Chen, H.; Ôn, B.; Đặng, Y.; Vương, W.; Âm, X.; Quan, J.; Nguyễn, L.; Tan, W. Tăng cường hiệu quả của việc miễn dịch DNA cộng với phương pháp điện di in vivo với sự kết hợp giữa các plasmid lõi virus viêm gan B-PreS1 và S-PreS1. Phòng khám. Vắc-xin miễn dịch. 2011, 18, 1789–1795. [Tham khảo chéo]

21. Yang, R.; Đặng, Y.; Hoàng, B.; Hoàng, L.; Lin, A.; Lý, Y.; Vương, W.; Lưu, J.; Lữ, S.; Zhan, Z.; et al. Vắc xin mRNA COVID-19 có cấu trúc vỏ lõi với mô hình phân phối sinh học thuận lợi và khả năng miễn dịch đầy hứa hẹn. Truyền tín hiệu. Mục tiêu ở đó. 2021, 6, 213. [CrossRef] [PubMed]

22. Yang, R.; Hoàng, B.; A, R.; Lý, W.; Vương, W.; Đặng, Y.; Tan, W. Sự phát triển và tính hiệu quả của hệ thống SARS-CoV{2}} giả được xác định bằng thử nghiệm ức chế xâm nhập và hiệu quả trung hòa trong ống nghiệm. Biosaf. Sức khỏe 2020, 2, 226–231. [CrossRef] [PubMed]

23. Giả, Q.; Bielefeldt-Ohmann, H.; Maison, RM; Masleša-Gali'c, S.; Cooper, SK; Bowen, RA; Horwitz, MRA Vắc-xin vectơ vi khuẩn tái tạo biểu hiện các protein màng và Nucleocapsid của SARS-CoV-2 bảo vệ chống lại bệnh nghiêm trọng giống như COVID-19- ở chuột đồng. Vắc xin NPJ 2021, 6, 47. [CrossRef] [PubMed]

24. Hajnik, RL; Plante, JA; Lương, Y.; Alameh, M.-G.; Đường, J.; Chung, C.; Adam, A.; Scharton, D.; Rafael, GH; Lưu, Y.; et al. Tiêm chủng mRNA kết hợp giúp tăng cường khả năng bảo vệ chống lại biến thể delta SARS-CoV-2. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Antón, IM; González, S.; Bullido, MJ; Corsin, M.; Risco, C.; Langeveld, JP; Enjuanes, L. Sự hợp tác giữa các protein cấu trúc của virus viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGEV) trong việc tạo ra các kháng thể đặc hiệu cho virus trong ống nghiệm. Virus Res. 1996, 46, 111–124. [Tham khảo chéo]

26. Deschambault, Y.; Lynch, J.; Warner, B.; Tierney, K.; Huỳnh, Đ.; Vendramelli, R.; Thợ may, N.; Sương giá, K.; Gian hàng, S.; Sajesh, B.; et al. Tiêm chủng một lần bằng vi-rút vaccinia ACAM2000 tái tổ hợp biểu hiện đột biến và các protein nucleocapsid bảo vệ chuột đồng chống lại bệnh lâm sàng do SARS-CoV-2-gây ra. bioRxiv 2021. [CrossRef]

27. Penaloza-MacMaster, P.; Lớp, J.; Đặng, T.; Richner, JM Một loại vắc xin nucleocapsid SARS CoV-2 bảo vệ chống lại sự lây lan của vi rút ở xa. bioRxiv 2021.

28. Afkhami, S.; D'Agostino, MR; Trương, A.; Stacey, HD; Marzok, A.; Kang, A.; Singh, R.; Bavananthasivam, J.; Bạn, G.; Lạc, X.; et al. Việc cung cấp vắc xin COVID-19 thế hệ tiếp theo vào niêm mạc hô hấp mang lại khả năng bảo vệ mạnh mẽ chống lại cả chủng SARS-CoV-2 tổ tiên và biến thể. Ô 2022, 185, 896–915.e19. [Tham khảo chéo]

29. Zheng, N.; Hạ, R.; Dương, C.; Âm, B.; Lý, Y.; Duẩn, C.; Lương, L.; Quách, H.; Xie, Q. Tăng cường biểu hiện protein nucleocapsid của SARS-CoV trong thuốc lá và khả năng miễn dịch của nó ở chuột. Vắc xin 2009, 27, 5001–5007. [Tham khảo chéo]

30. Yasui, F.; Kai, C.; Kitabatake, M.; Inoue, S.; Yoneda, M.; Yokochi, S.; Kase, R.; Sekiguchi, S.; Morita, K.; Hishima, T.; et al. Tiêm chủng trước bằng protein nucleocapsid liên quan đến hội chứng hô hấp cấp tính nặng (SARS) (SARS-CoV) gây viêm phổi nặng ở chuột bị nhiễm SARS-CoV. J. Miễn dịch. 2008, 181, 6337–6348. [Tham khảo chéo]

31. Deming, D.; Sheahan, T.; Heise, M.; Yount, B.; Davis, N.; Sims, A.; Suthar, M.; Harkema, J.; Whitmore, A.; Dưa chua, R.; et al. Hiệu quả của vắc-xin ở những con chuột già bị thử thách với các biến thể đột biến và dịch bệnh mang virus SARS-CoV tái tổ hợp. PLoS Med. 2006, 3, e525. [CrossRef] [PubMed]

32. Wesseling, JG; Godeke, GJ; Schijns, VE; Prevec, L.; Graham, F.; Horzinek, MC; Rottier, PJ Mouse virus viêm gan tăng đột biến và các protein nucleocapsid được biểu hiện bằng các vec tơ adenovirus bảo vệ chuột chống lại nhiễm trùng gây chết người. J. Tướng Virol. 1993, 74, 2061–2069. [CrossRef] [PubMed]

33. Kim, TW; Lee, JH; Hùng, CF; Bành, S.; Roden, R.; Vương, MC; Viscidi, R.; Tsai, YC; Anh, L.; Chen, PJ; et al. Tạo và mô tả đặc tính của vắc xin DNA nhắm vào protein nucleocapsid của vi rút gây hội chứng hô hấp cấp tính nặng. J. Virus. 2004, 78, 4638–4645. [CrossRef] [PubMed]

34. Le Bert, N.; Tân, AT; Kunasegaran, K.; Thẩm, CYL; Hafezi, M.; Chia, A.; Chng, MHY; Lin, M.; Tân, N.; Linster, M.; et al. SARS-CoV-2-miễn dịch tế bào T đặc hiệu trong các trường hợp mắc COVID-19 và SARS cũng như các mẫu chứng không bị nhiễm bệnh. Thiên nhiên 2020, 584, 457–462. [Tham khảo chéo]