Nhắm mục tiêu Cathepsin B bằng Cycloastragenol tăng cường khả năng miễn dịch chống ung thư của tế bào T CD8 thông qua ức chế thoái hóa MHC-I Phần 1

TRỪU TƯỢNG

Lý lịchViệc mất đi các kháng nguyên khối u và sự cạn kiệt của các tế bào T CD8 do con đường PD-1/PD-L1 gây ra là những yếu tố quan trọng giúp thoát khỏi khối u miễn dịch. Trong những năm gần đây, ngày càng có nhiều nghiên cứu về y học cổ truyền Trung Quốc trong điều trị khối u. Cycloastragenol (CAG), một phân tử hoạt động hiệu quả trong Astragalus membranaceus, đã được phát hiện là có tác dụng kháng vi-rút, chống lão hóa, chống viêm và các chức năng khác. Tuy nhiên, tác dụng và cơ chế chống ung thư của nó vẫn chưa rõ ràng.

Glycoside của cistanche cũng có thể làm tăng hoạt động của SOD trong các mô tim và gan, đồng thời làm giảm đáng kể hàm lượng lipofuscin và MDA trong mỗi mô, loại bỏ hiệu quả các gốc oxy phản ứng khác nhau (OH-, H₂O₂, v.v.) và bảo vệ chống lại tổn thương DNA gây ra bởi gốc OH. Cistanche phenylethanoid glycoside có khả năng loại bỏ gốc tự do mạnh mẽ, khả năng khử cao hơn vitamin C, cải thiện hoạt động của SOD trong huyền phù tinh trùng, giảm hàm lượng MDA và có tác dụng bảo vệ nhất định đối với chức năng màng tinh trùng. Cistanche polysacarit có thể tăng cường hoạt động của SOD và GSH-Px trong hồng cầu và mô phổi của chuột lão hóa thực nghiệm do D-galactose gây ra, cũng như làm giảm hàm lượng MDA và collagen trong phổi và huyết tương, đồng thời tăng hàm lượng elastin, có tác dụng nhặt rác tốt đối với DPPH, kéo dài thời gian thiếu oxy ở chuột già, cải thiện hoạt động của SOD trong huyết thanh và làm chậm quá trình thoái hóa sinh lý của phổi ở chuột già thực nghiệm. Với sự thoái hóa hình thái tế bào, các thí nghiệm đã chỉ ra rằng Cistanche có khả năng chống oxy hóa tốt và có tiềm năng trở thành dược phẩm ngăn ngừa và điều trị các bệnh lão hóa da. Đồng thời, echinacoside trong Cistanche có khả năng đáng kể trong việc loại bỏ các gốc tự do DPPH và có khả năng loại bỏ các loại oxy phản ứng và ngăn chặn sự thoái hóa collagen do gốc tự do gây ra, đồng thời cũng có tác dụng sửa chữa tốt đối với tổn thương anion gốc tự do của thymine.

Nhấp vào ưu và nhược điểm cistanche

【Để biết thêm thông tin:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

phương phápTác dụng chống khối u của CAG đã được nghiên cứu trong các mô hình khối u được cấy ghép trên chuột MC38 và CT26. Tác dụng chống khối u của CAG đã được phân tích sâu hơn thông qua giải trình tự đa omic đơn bào. Công nghệ định hình khả năng tiếp cận đáp ứng mục tiêu đã được sử dụng để tìm protein mục tiêu của CAG. Sau đó, cơ chế chống khối u của CAG đã được khám phá bằng cách sử dụng kính hiển vi đồng tiêu, kích thích miễn dịch và truyền các plasmid đột biến. Cuối cùng, tác dụng chống ung thư kết hợp của kháng thể CAG và PD-1 ở chuột hoặc các chất hữu cơ đã được nghiên cứu.

Kết quảChúng tôi thấy rằng CAG ức chế hiệu quả sự phát triển của khối u trong cơ thể. Bản đồ đa omic đơn bào của chúng tôi đã chứng minh rằng CAG đã thúc đẩy sự trình diện của các kháng nguyên bề mặt tế bào khối u và được đặc trưng bởi chức năng tiêu diệt tăng cường của CD8 cộng với các tế bào T. Về mặt cơ học, CAG liên kết với protein mục tiêu cathepsin B của nó, protein này sau đó ức chế sự phân hủy lysosomal của phức hợp tương hợp mô chủ yếu I (MHC-I) và thúc đẩy tổng hợp n của MHC-I vào màng tế bào, thúc đẩy giai đoạn tiền trạm của kháng nguyên khối u. . Trong khi đó, sự kết hợp của CAG với kháng thể PD-1 đã tăng cường hiệu quả khả năng tiêu diệt khối u CD8 cùng với tế bào T tiêu diệt khối u ở chuột xenograft và các cơ quan ung thư đại trực tràng. Kết luận Dữ liệu của chúng tôi lần đầu tiên báo cáo rằng quá trình điều hòa giảm cathepsin B tạo ra khả năng miễn dịch chống khối u và làm hết hạn cơ chế chống khối u của sản phẩm CAG tự nhiên.

GIỚI THIỆU

Ung thư đại trực tràng là một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất trên toàn thế giới. Tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong của nó nằm trong số ba loại hàng đầu, đe dọa nghiêm trọng đến tính mạng và sức khỏe của con người.1 Các phương pháp điều trị phổ biến bao gồm hóa trị và xạ trị bằng phẫu thuật, thuốc nhắm mục tiêu và liệu pháp miễn dịch.2–4 Tuy nhiên, các tế bào ung thư thường biểu hiện mất các kháng nguyên bề mặt và biểu hiện mức độ cao của các phân tử ức chế để thoát khỏi sự giám sát của các tế bào miễn dịch. Do đó, để giải quyết vấn đề thoát khỏi khối u miễn dịch, các nhà nghiên cứu đã phát triển các chất ức chế điểm kiểm soát miễn dịch và liệu pháp tân kháng nguyên để ngăn chặn sự che dấu của tế bào ung thư đối với các tế bào miễn dịch.5–8 Mặc dù các chất ức chế điểm kiểm soát miễn dịch có thể khôi phục các tế bào miễn dịch đã cạn kiệt, kháng nguyên bề mặt của ung thư tế bào đã không được im ved đáng kể. Do đó, điều đặc biệt quan trọng là tìm ra các loại thuốc có thể thúc đẩy sự trình diện của các kháng nguyên bề mặt khối u. Việc nhận biết các tế bào ung thư bằng tế bào CD8 cộng với tế bào T gây độc tế bào phụ thuộc vào con đường TCR/CD3/phức hợp tương hợp mô chính (MHC-I). TCR nhận kháng nguyên có trong tế bào đuôi gai/protein màng tế bào ung thư CI và truyền tín hiệu để kết nối chặt chẽ với CD3, sau đó tín hiệu này sẽ mở rộng sâu hơn vào tế bào chất.9 10 Đồng thời, với sự kích hoạt tín hiệu CD28/B7 , tế bào CD8 cộng với T có thể được đồng kích hoạt để nhận biết và tiêu diệt tế bào ung thư.11 Các nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra rằng, trong quá trình phát triển khối u, lysosome dẫn đến giảm tập hợp MHC-I trên bề mặt tế bào ung thư, điều này không hiệu quả trình diện kháng nguyên.12 13 Liu và cộng sự đã báo cáo rằng việc ức chế PCSK9 có thể ngăn chặn sự thoái biến của MHC-I trong lysosome và cho phép MHC-I quay trở lại màng tế bào để trình diện kháng nguyên.12 Do đó, việc khôi phục chức năng trình diện kháng nguyên của MHC-I đặc biệt quan trọng để ngăn chặn sự trốn thoát miễn dịch của khối u.

Ngày càng có nhiều nghiên cứu phát hiện ra rằng việc áp dụng các phân tử hoạt tính trong y học cổ truyền Trung Quốc để can thiệp chống khối u có nhiều triển vọng.14 15 Cycloastragenol (CAG) là một phân tử hoạt tính hiệu quả trong Astragalus membranaceus, có tác dụng kháng vi-rút, kháng khuẩn, chống viêm và các tác dụng dược lý khác, nhưng tác dụng chống ung thư của nó hiếm khi được báo cáo.16–19 Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát hiện ra rằng CAG ức chế sự phát triển của các khối u được chuyển hóa của các khối u ung thư ruột kết. Cơ chế chủ yếu là ức chế sự thoái hóa của MHC-I, qua trung gian là cathepsin B (CTSB), thúc đẩy sự trình diện kháng nguyên của tế bào ung thư, và sau đó tăng cường khả năng tiêu diệt tế bào CD8 cộng với tế bào T.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Kháng thể và thuốc thử

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 phần trăm ). Kháng thể của CTSB (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929 ), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID: AB_1557426 ), Actin (Cat#{{ 5}}Ig, PRID: AB_2782959 ), Tubulin (Cat#10094-1-AP, PRID: AB_2210695 ) và Bộ phát hiện hóa mô miễn dịch chống chuột/thỏ (Cat#PK10006) đã được mua từ Proteintech. Kháng thể của H2-Kd (Cat#sc-53852, PRID: AB_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID: AB_626853), và CTSB (Cat#sc-365558, PRID: AB_10842446) đã được mua từ Công nghệ sinh học Santa Cruz. Kháng thể của Ki-67 (Cat#12202, PRID: AB_2620142 ) đã được mua từ Công nghệ Tín hiệu Tế bào. Kháng thể của Na/K ATPase (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) đã được mua từ Abcam. Dòng kháng thể tế bào học của CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB_2833003 ) và CD{ {31}}PerCP (Cat#345774, RRID: AB_2868802 ) đã được mua từ BD Bioscience. Kháng thể tế bào học dòng chảy của Gzmb-FITC (Cat# 515403, RRID: AB_2114575 ) đã được mua từ BioLegend. Dòng kháng thể tế bào học của NK1.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB_469664) và IFN- -PE (Cat#12-7311-81, RRID :AB_466192) đã được mua từ Thermo Fisher Khoa học. Môi trường DMEM (Cat#01-052-1ACS), PenicilinStreptomycin (Cat#15140122) và Huyết thanh bò bào thai (Cat#C04001-500) đã được mua từ Công nghiệp sinh học. Huyết thanh dê (Cat#88RNG001) và Bộ xét nghiệm protein Pierce BCA (Cat#23225) đã được mua từ Thermo Fisher Khoa học. Các kháng thể của PD kháng người-1 (Cat#BE0188, RRID: AB_1095031 8) và PD kháng chuột-1 (Cat#BE0146, RRID: AB_1094905 3) đã được mua từ tế bào Bio X. MACS Tumor Tissue Dissociation Kit (Cat#130-095-929) đã được mua từ Miltenyi Biotec.

Nuôi cấy tế bào

Các dòng tế bào ung thư ruột kết chuột MC38 và CT26 được duy trì trong phòng thí nghiệm của chúng tôi.20 Ung thư ruột kết l dòng HCT-116 ở người được lấy từ Bộ sưu tập Văn hóa Loại của Viện Hàn lâm Khoa học Trung Quốc (Thượng Hải, Trung Quốc). Các tế bào MC38, CT26 và HCT-116 được nuôi cấy trong môi trường DMEM chứa 10% huyết thanh bào thai bò và 1% penicillin/streptomycin ở 37 độ trong tủ ấm 5% CO2.

Thí nghiệm cấy ghép khối u

Chuột cái C57BL/6JGpt sáu tám tuần tuổi, chuột BALB/c và chuột trần BALB/,c được mua từ GemPharmatech (Nam Kinh, Trung Quốc). Các tế bào ung thư MC38 hoặc CT26 (1×106) được cấy dưới da vào từng con chuột. Khi khối u phát triển đến 100 mm3, mic được chia ngẫu nhiên thành nhóm dung dịch muối đệm phốt phát (PBS) (ví dụ: 1 lần/ngày) và nhóm CAG (ví dụ: 50mg/kg 1 lần/ngày). Thể tích khối u được xác định bằng phép đo calip sử dụng công thức V=chiều dài×chiều rộng2 /2. Khi thể tích khối u của chuột nhóm PBS đạt 1000 mm3, khối u của chuột được lấy ra, chụp ảnh và cân.

Phân ly đơn bào từ chuột cho RNA/ATACseq đơn bào

Các khối u rắn từ chuột đã được tiêu hóa bằng cách sử dụng Bộ phân tách khối u để thu được các tế bào đơn lẻ. Đơn celSingle-cell s với nồng độ 1000 tế bào/1000 tế bào được tải trên bộ điều khiển bộ gen crom 10×các tế bào đơn lẻ tuân theo giao thức của nhà sản xuất bộ gen 10×. Thuốc thử phiên mã ngược, hạt gel có mã vạch và dầu phân vùng được trộn với các tế bào gen để tạo ra hạt gel trong nhũ tương (GEM) để sao chép ngược. tiền xử lý dữ liệu scRNA-seq và kiểm soát qua y.

Dựa trên bộ gen tham chiếu của chuột GRCm38 (mm10), quy trình CellRanger V.4.0.0 (10×Genomics) để xử lý RNA đơn bào dữ liệu trình tự cho từng thử nghiệm (GSE197229). Ma trận biểu hiện gen kỹ thuật số được zed trong R (V.4.0.4) bằng cách sử dụng gói Seurat (V.4.0.0).21 Trước khi phân tích d Beforem, các ô được lọc theo số UMI (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

Kiểm soát chất lượng và tiền xử lý dữ liệu SeaTac-seq

Dữ liệu ATAC-seq một ô (GSE197229) đã được xử lý trước bởi bộ kiểm lâm ô (V.2.0.0) bằng dòng lệnh đếm. Để xử lý và phân tích dữ liệu scATAC-seq tiếp theo, chúng tôi đã sử dụng gói ArchR (V.1.0.1).24 Sau đó, chúng tôi sử dụng hàm addArchRGethe nome ('mm10') để chú thích bộ gen và tạo một mũi tên với chức năng cre ArrowFiles với các tham số mặc định. Tiếp theo, chúng tôi đã sử dụng chức năng filterDoublets để xóa các cặp đôi tiềm năng và tạo một dự án ArchR bằng cách sử dụng chức năng ArchRProject với các tham số mặc định. Sau đó, chúng tôi đã sử dụng gói Harmony để loại bỏ hiệu ứng lô bằng hàm addHarmony.25 Để giảm kích thước, chúng tôi sử dụng hàm addIterativeLSI trong ArchR để chạy với các tham số def t. Đối với nhúng một ô, chúng tôi đã chọn đối tượng reduceDims một cách hài hòa và sử dụng hàm addTSNE với tham số 'perplexity=30' để trực quan hóa.

Phân tích tích hợp dữ liệu siRNA-seq và scATAC-seq

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. Để cải thiện độ chính xác của các dự đoán nhằm tích hợp tốt hơn hai bộ dữ liệu, một lần nữa chúng tôi đã tích hợp dữ liệu scATAC-seq và scRNA-seq bằng cách sử dụng chế độ 'tích hợp có giới hạn'. Tóm lại, chúng tôi đã chú thích dữ liệu scATAC-seq với các loại tế bào dựa trên điểm gen của scATAC-seq. Sau đó, chúng tôi đã tạo một danh sách hạn chế sao cho độ tương tự biểu hiện gen chỉ được tính toán trong cùng một loại tế bào cho cả scATAC-seq và scRNA-seq. Phân cụm không được giám sát với t-SNE đã tiết lộ 13 cụm ô con, được chú thích bằng các dấu hiệu đã biết hoặc giả định trong Bảng 1 bổ sung trực tuyến.

Quỹ đạo dòng giả thời gian

Quỹ đạo dòng tế bào của các tế bào ung thư đã được suy ra bằng cách sử dụng gói R Monocle2 (V.2.18.0).26 Tế bào đơn nhân tìm hiểu biểu đồ tổng thể rõ ràng từ dữ liệu bộ gen đơn bào bằng nhúng đồ thị đảo ngược để sắp xếp các ô, do đó giải quyết các vấn đề phức tạp các quá trình sinh học mạnh mẽ và chính xác.27 Chúng tôi đã sử dụng chức năng ''differentialGeneTest'' để lấy DEG từ mỗi cụm và sau khi xây dựng quỹ đạo tế bào, chúng tôi đã phát hiện các gen được biểu hiện khác nhau trong thời gian giả. Tất cả các gen phụ thuộc vào thời gian giả được hiển thị bằng biểu đồ_giả thời gian_hàm bản đồ nhiệt lấy một đối tượng CellDataSet. Biểu đồ quỹ đạo dòng dõi và đường cong biểu thức mượt mà dựa trên CellDataSet được tạo bởi quỹ đạo biểu đồ_ô_và biểu đồ_gen_trong_giả thời gian, tương ứng.28

Gọi biến thể số bản sao một ô

Để xác định các tế bào ác tính với các biến thể số lượng bản sao nhiễm sắc thể quy mô lớn (CNV), chúng tôi đã sử dụng gói suy luậnCNV R để suy ra cấu hình di truyền của từng tế bào dựa trên biểu hiện trung bình của các bộ gen lớn trong từng vùng nhiễm sắc thể của bộ gen khối u so với các tế bào bình thường.29 Trên cơ sở từng mẫu một, các tế bào miễn dịch được sử dụng làm tham chiếu để ước tính CNV trong các tế bào liên quan đến ung thư.

phân tích làm giàu

Các phân tích chú thích GO và đường dẫn KEGG đã được thực hiện bằng cách sử dụng gói R clusterProfiler (V.3.11.1) với các tham số của PValueCutoff=0.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} }.05, MingsSize=10 và MaxGSSize=500.20Phân tích làm giàu bộ gen (GSEA) được áp dụng bằng cách sử dụng 50 bộ gen đặc trưng (h.all.V.7.4.symbols. gmt) để xác định mức độ làm giàu đáng kể lộ trình chức năng thông qua phần mềm GSEA (V.4.1.0), với tiêu chí sàng lọc giá trị P danh nghĩa<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Phân tích PCR thời gian thực định lượng

Các tế bào MC38 và HCT-116 được cấy vào các đĩa sáu giếng trong 6 giờ và sau đó được xử lý bằng CAG trong 24 giờ nữa. Các tế bào được rửa ba lần bằng PBS lạnh và ly tâm ở 180g trong 5 phút ở 4 độ . Đồng thời, sau khi mài mô khối u. Theo hướng dẫn của nhà sản xuất, RNA tổng số được chiết xuất từ ​​các tế bào MC38, HCT-116 và mô khối u bằng thuốc thử TRIzol. Thể tích phản ứng là 20µL chứa: 1µg RNA, 5µL 5×Hiscript III qRT SuperMix và RNase Free dH2 O. cDNA đã được xử lý PCR định lượng, với thể tích phản ứng là 10µL với 1µL cDNA, hỗn hợp 5µL qPCR, mồi 0,75µL 5µM (Chuyển tiếp và Đảo ngược) và 3,25µL RNase-free dH2 O. Các mồi được tổng hợp bởi GenScript Biotech Corporation (Nam Kinh, Trung Quốc) theo các trình tự sau (bảng bổ sung trực tuyến 2).

Khám phá mục tiêu thông qua phương pháp lập hồ sơ khả năng tiếp cận đáp ứng mục tiêu

Việc sàng lọc các protein liên kết với CAG đã được thực hiện như đã mô tả trước đây.31 32 Tóm lại, phương pháp lập hồ sơ khả năng tiếp cận đáp ứng mục tiêu (TRAP) đã được sử dụng để khám phá các protein liên kết với CAG trong môi trường tế bào bằng cách theo dõi lysine do sự tương tác phối tử gây ra khả năng tiếp cận thay đổi ở cấp độ proteome. Tóm lại, hai đĩa tế bào được xử lý lần lượt bằng 10µM CAG và dimethyl sulfoxide (DMSO). Sau 1-giờ ủ, các tế bào được hoán vị bởi bộ đệm M-PER (Thermo Science) và các dung dịch ly giải thu được được dán nhãn cộng hóa trị bằng cách bổ sung phức hợp pyridin formaldehyde và borane cùng nhau đánh dấu cụ thể dư lượng lysine dạng protein ở nhiệt độ phòng để lập hồ sơ khả năng tiếp cận . Sau đó, các chất ly giải được kết tủa bằng dung môi hữu cơ, và các hạt thu được được hòa tan lại trong urê 8mol/L, khử bằng dithiothreitol (DTT) ở 56 độ trong 30 phút, tiếp theo là alkyl hóa bằng iodoacetamide (IAA) trong bóng tối trong 30 phút. Một lượng dung dịch DTT thích hợp lại được thêm vào để phản ứng với lượng IAA dư thừa. Sau đó, hệ protein được pha loãng với dung dịch amoni bicacbonat cho đến khi nồng độ cuối cùng của urê đạt 1mol/L. Các chất phân hủy protein thu thập được khử muối trên các cột C18 HLB (Waters, Milford, Massachusetts, USA), và các peptit được làm giàu được sấy khô và hoàn nguyên trong dung dịch nước axit formic (FA) 0,1%. Hệ thống AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF (Waters) đã được sử dụng để phân tích các mẫu để lập hồ sơ định lượng về khả năng tiếp cận lysine thay đổi để đáp ứng với liên kết CAG để khám phá mục tiêu. Thu thập dữ liệu phụ thuộc ở chế độ tích cực được sử dụng để thu thập dữ liệu. Phân tích dữ liệu được thực hiện bằng PEAKS Studio V.8.5 (Giải pháp BSI, Waterloo, Canada). Cụ thể, quá trình alkyl hóa cys đã được chọn là một sửa đổi cố định, và quá trình oxy hóa methionine và dimethyl hóa lysine, đạt được bằng cách ghi nhãn TRAP, được đặt làm sửa đổi thay đổi. Tóm lại, các peptide có chứa quá trình khử methyl do TRAP gây ra và thể hiện những thay đổi phong phú đáng kể khi có và không có quá trình ủ CAG được chỉ định là peptide đáp ứng mục tiêu. Tỷ lệ về mức độ phong phú của từng peptide được gắn nhãn TRAP cho biết mức độ thay đổi khả năng tiếp cận và có liên quan mật thiết với ái lực liên kết phối tử. Bài kiểm tra t của sinh viên đã được thực hiện để đánh giá xem những thay đổi về khả năng tiếp cận được phát hiện của các peptide được dán nhãn có ý nghĩa thống kê hay không. Giá trị p giữa các nhóm (p<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

nuôi cấy hữu cơ

Các organoid ung thư đại trực tràng ở người được xây dựng và nuôi cấy bởi Chongqing Kingbiotech.33 Các mẫu mô của bệnh nhân thu được sau ca phẫu thuật được cắt thành từng mảnh càng nhỏ càng tốt bằng kéo vô trùng. Các mảnh mô được trộn kỹ với Matrigel (Corning, Cat#356231) theo tỷ lệ xấp xỉ 1:4 trên nước đá. Quá trình xử lý tiếp theo đề cập đến các giao thức đã xuất bản. Tóm lại, các huyền phù Matrigel mảnh được gieo nhanh chóng vào tấm nhiều giếng để tạo thành các giọt hình bán cầu và chuyển sang 37 độ trong 15–20 phút, cho phép các giọt đông đặc lại. Đã thêm lượng môi trường nuôi cấy thích hợp (KingcultureTM Organoid Growth Medium, Cat#KCW-2) ​​vào từng giếng và thay môi trường 2–4 ngày một lần.

Phân lập và nuôi cấy tế bào T CD8 người

Thêm cùng một thể tích nước muối sinh lý vào máu ngoại vi của người khỏe mạnh có chứa chất chống đông máu để pha loãng máu toàn phần. Thêm một thể tích dung dịch tách nhất định vào ống ly tâm 15mL, từ từ thêm máu toàn phần đã pha loãng dọc theo thành ống lên trên cùng của dung dịch tách và ly tâm ở 750g trong 20 phút. Sau khi ly tâm, dùng pipet hút cẩn thận bạch cầu đơn nhân ở lớp trắng ở giữa vào ống ly tâm 15mL, thêm một thể tích PBS nhất định để hòa tan lại, ly tâm 250g trong 5 phút và loại bỏ phần nổi phía trên. Sau khi thêm các hạt từ tính CD8 của con người vào các kết tủa tế bào, các tế bào T CD8 được sắp xếp theo cột phân loại LS. Các tế bào T CD8 đã được thêm vào tấm đục lỗ đã được phủ sẵn kháng thể 5µg/mL CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB_2865578) và sau đó là 10ng/mL IL{{15} } (Peprotech Cat# 212-12) và 5µg/mL CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81, RRID: AB_468920) được thêm vào để nuôi cấy trong 24 giờ.

trồng trọt

Sau khi các chất hữu cơ được ủ với CAG trong 24 giờ, môi trường nuôi cấy mới được thay thế, sau đó các chất hữu cơ và tế bào T CD8 đã hoạt hóa được treo trong gel ma trận, sau đó huyền phù được thêm vào đĩa sáu giếng và đặt vào 37 tủ ấm độ trong 15 phút, và sau đó 2mL môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh không có huyết thanh được thêm vào trong 24 giờ.

phong cách phương Tây

Các tế bào MC38 và HCT-116 được cấy vào các đĩa sáu giếng trong 6 giờ và sau đó được xử lý bằng CAG trong 24 giờ nữa. Các tế bào được rửa ba lần bằng PBS lạnh và ly tâm ở 180g trong 5 phút ở 4 độ. Tổng số protein được ly giải bằng phương pháp ly giải WB-IP chứa 1% chất ức chế protease trong 30 phút trên đá. Tổng lượng protein được đánh giá bằng cách sử dụng bộ định lượng protein BCA. Các mẫu protein được phân tách bằng điện di gel polyacrylamide SDS 10% –12% và chuyển sang màng PVDF (polyvinylidene fluoride) ở 350 mA trong 90 phút. Các màng PVDF bị chặn với 5% BSA trong 1 giờ, các dải có kháng thể sơ cấp được chỉ định qua đêm và với kháng thể thứ cấp được ủ trong 90 phút ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, các dải được phát hiện bằng hệ thống chất phát quang hóa học LumiGLO (KPL, Gaithersburg, Maryland, Hoa Kỳ).

tế bào học dòng chảy

Sau khi tiêu hóa mô khối u và huyền phù tế bào đơn đã được chuẩn bị. Nhuộm bề mặt được thực hiện với các kháng thể kháng nguyên bề mặt trong bộ đệm FCM (Flow Cytometry) (PBS chứa 1 phần trăm FBS) và nhuộm trên băng với các kháng thể thích hợp trong 30 phút. Thuốc nhuộm hoạt tính (eBioscience) đã được sử dụng để loại bỏ các tế bào chết. Nhuộm cytokine nội bào được thực hiện với dung dịch cố định tế bào BD/dung dịch màng ngoại bào, và các tế bào được cố định và thấm, sau đó nhuộm bằng kháng thể chống lại cytokine trong dung dịch đệm Perm/Wash (Khoa học sinh học BD).

Các plasmid đột biến CTSB được truyền

Các tế bào HCT-116 được cấy vào các đĩa giếng 6-trong 12 giờ và sau đó được truyền nhiễm bằng CTSB-WT-EGFP hoặc plasmid đột biến CTSB (Y75A, A77V và G198A) trong 36 giờ.

Can thiệp truyền hoặc plasmid biểu hiện quá mức của CTSB vào tế bào MC38 hoặc tế bào -116 HCT

Các tế bào MC38 (1×106 /giếng) được cấy vào các đĩa giếng 6-trong 6 giờ, sau đó được truyền RNA can thiệp CTSB (trình tự: Forward-GGACAUAGAUCUACCUGAATT và Reverse-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) trong 48 giờ và các mức biểu hiện mRNA hoặc protein của Ctsb và H2-k1 đã được phát hiện. Các tế bào -116 HCT (1×106 /giếng) được cấy vào các đĩa giếng 6-trong 6 giờ, sau đó được chuyển nhiễm bằng can thiệp CTSB (trình tự: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) hoặc plasmid biểu hiện quá mức trong 48 giờ và mRNA hoặc mức độ biểu hiện protein của CTSB và HLA-A đã được phát hiện.

công nghệ lắp ghép

Cấu trúc 3D của CTSB đã được tải xuống từ Cơ sở dữ liệu Protein (ID PDB: 2iPP) và cấu trúc của CAG đã được tải xuống từ PubChem. Quá trình ghép nối được thực hiện trong Autodock 2 với việc ghép nối thô bằng thuật toán ủ mô phỏng và tinh chỉnh tiếp theo bằng thuật toán di truyền.

Xét nghiệm dịch chuyển nhiệt tế bào

Các tế bào MC38 được gieo vào các đĩa 10cm qua đêm và sau đó được xử lý bằng CAG hoặc 0,1 phần trăm DMSO trong 2 giờ nữa. Các tế bào được thu thập, rửa bằng PBS lạnh và ly tâm ở mức 180 g trong 5 phút. Các tế bào sau đó được chia đều vào các ống ly tâm (70µL mỗi ống) và được làm nóng trong 3 phút ở nhiệt độ sau: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 và 67 độ, các mẫu được làm lạnh trong 3 phút ở nhiệt độ và sau đó giữ trên băng. Sau đó, các mẫu được đặt trong tủ lạnh ở -80 độ qua đêm. Các mẫu được rã đông ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và sau đó được làm lạnh ở -80 độ trong 4 giờ. Cuối cùng, các mẫu được ly tâm ở tốc độ 12,{23}}g trong 25 phút, phần nổi phía trên được thêm vào bộ đệm tải và được phân tích bằng phương pháp Western blot.

nhuộm hóa mô miễn dịch

Các phần paraffin của mô khối u được ngâm trong xylene trong 20 phút để tẩy sáp, sau đó ngâm trong ethanol 100% , 75% và 50% trong 10 phút. Sau khi các lát cắt được sửa chữa kháng nguyên bằng dung dịch sửa chữa kháng nguyên natri citrate, hydro peroxide nội sinh bị vô hiệu hóa với 3% hydro peroxide. Sau khi chặn bằng huyết thanh dê 5% trong 1 giờ, kháng thể kháng Ki67 (1:200) được thêm vào và ủ qua đêm ở 4 độ. Polyme có nhãn HRP chống chuột/thỏ (100µL) đã được thêm vào và các mẫu được ủ ở 37 độ trong 30 phút, tiếp theo là 100µL dung dịch làm việc DAB và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau 1 phút nhuộm bằng hematoxylin, các mẫu được rửa trong 50 phần trăm, 75 phần trăm và 100 phần trăm etanol và xylen trong 5 phút, và kẹo cao su trung tính được sử dụng để dán màng. Phim được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi.

thống kêPhân tích

Phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm GraphPad Prism (V.8.0). Tất cả các kết quả được biểu thị dưới dạng trung bình ± SEM của ba thử nghiệm độc lập. Phân tích phương sai một chiều, sau đó là bài kiểm tra sau đại học của Dunnett được sử dụng để đánh giá sự khác biệt khi có nhiều hơn hai nhóm. Bài kiểm tra t của Học sinh được sử dụng để đánh giá sự khác biệt đáng kể giữa hai nhóm. Một ý nghĩa thống kê đã được đặt ở p<0.05.

KẾT QUẢ

Phân tích đa tế bào đơn của CAG ức chế sự phát triển của ung thư ruột kết được cấy ghép ở chuột

Để tìm hiểu xem CAG có tác dụng chống khối u hay không, trước tiên chúng tôi cấy tế bào ung thư MC38 vào chuột C57BL/6. Chúng tôi lưu ý rằng CAG ức chế đáng kể sự phát triển của khối u (hình bổ sung trực tuyến S1A, B). Sau đó, chúng tôi cấy tế bào CT26 vào chuột BALB/c và phát hiện ra rằng CAG cũng ức chế sự phát triển của khối u (hình bổ sung trực tuyến S1C, D).

Để tiết lộ thêm về cơ chế cụ thể mà CAG ức chế sự phát triển của khối u, chúng tôi đã phân tích nó bằng kỹ thuật scRNA-seq và scATAC-seq (hình 1A). Chúng tôi chia quần thể tế bào thành bốn nhóm: tế bào ung thư, nguyên bào sợi, tế bào tủy và tế bào lympho (hình 1B, hình bổ sung trực tuyến S2A, B). Chúng tôi thấy rằng các tế bào ung thư (52 phần trăm ) và nguyên bào sợi (41 phần trăm ) chủ yếu xâm nhập vào các mô khối u, trong khi các tế bào miễn dịch chỉ chiếm 7 phần trăm . Sau đó, chúng tôi chia tế bào ung thư thành tám tập con và nguyên bào sợi thành ba tập con (hình 1C–E). Sau đó, phân tích làm giàu các gen biểu hiện cao trong mỗi quần thể tế bào cho thấy các con đường phân tử MHC-I trong tế bào ung thư đã được làm giàu, cũng như các tín hiệu chống khối u của tế bào T và tế bào NK (hình bổ sung trực tuyến S2C). Sau đó, bốn nhóm tế bào cũng được tìm thấy bằng cách sử dụng phân tích tích hợp scATAC-seq và scRNA-seq (hình 2D–G). Sau khi so sánh, chúng tôi thấy rằng các tế bào ung thư (tế bào C01, C03), CD8 cộng với tế bào T, tế bào Spp1 cộng với TAM và nguyên bào sợi (tế bào F01 và F02) xuất hiện theo trình tự ATAC (hình 1F, G), và hơn nữa, được biểu hiện cao các yếu tố phiên mã được làm giàu trong các tế bào này (hình 1H). Thông qua những phân tích này, chúng tôi suy đoán rằng sự ức chế sự phát triển khối u của CAG có liên quan chặt chẽ đến những thay đổi trong các tế bào này.

Cag thúc đẩy trình bày kháng nguyên tế bào khối u

Để phân tích cơ chế chống khối u của CAG, đầu tiên chúng tôi phân tích quần thể tế bào khối u và chia các tế bào ung thư thành tám nhóm nhỏ (hình 2A, B, hình bổ sung trực tuyến S3A). Kết quả cho thấy, so với nhóm PBS, các tế bào nhóm C05 giảm đáng kể trong khi các tế bào nhóm C07 tăng lên (hình 2C). Trong khi đó, để xác minh tính chính xác của việc phân cụm tế bào khối u, chúng tôi đã so sánh CNV của tế bào lympho và tế bào tủy với tư cách là tế bào tham chiếu. Kết quả cho thấy CNV của tế bào ung thư cao hơn đáng kể so với tế bào miễn dịch (hình bổ sung trực tuyến S3B). Khi phân tích các tập hợp con của tế bào ung thư, chúng tôi thấy rằng các gen phản ứng interferon Isg15, Irf7, Ifit3 và Ifi47 được biểu hiện cao trong quần thể tế bào C07 và C08 của nhóm CAG so với nhóm PBS (hình bổ sung trực tuyến S3C). Việc phân tích quần thể tế bào khối u cho thấy các con đường liên quan đến trình diện kháng nguyên đã được làm phong phú đáng kể trong nhiều quần thể tế bào. Do đó, chúng tôi suy đoán rằng CAG có thể thúc đẩy sự trình diện kháng nguyên của các tế bào ung thư để đóng vai trò chống khối u (hình 2D). Sau đó, chúng tôi đã chọn các gen liên quan đến trình diện kháng nguyên và thấy rằng mức độ biểu hiện trong nhóm CAG cao hơn đáng kể so với nhóm PBS (hình 2E, hình bổ sung trực tuyến S3D). Chúng tôi cũng phát hiện ra rằng CAG thúc đẩy sự trình diện kháng nguyên trong các mô khối u (hình 2F, G).

Tiếp theo, chúng tôi đã sử dụng scATAC-seq để phân tích các lý do cụ thể đằng sau việc trình bày kháng nguyên tế bào khối u thúc đẩy CAG. Chúng tôi thấy rằng quần thể tế bào khối u biểu hiện cao các yếu tố phiên mã Fos, Junb, Jund, Fosb và Fosl1 (hình 2H, I). Sau đó, chúng tôi đã xây dựng một bản đồ về sự tương tác giữa các yếu tố phiên mã và các gen tương ứng để giải thích rằng CAG đã thúc đẩy sự biểu hiện của các gen liên quan đến trình diện kháng nguyên của tế bào khối u (hình 2J). Trong các mô khối u, chúng tôi cũng phát hiện ra rằng các yếu tố phiên mã Junb, Fos, Jund và Fosb được biểu hiện quá mức đáng kể trong nhóm PBS khi điều trị bằng CAG (hình 2K–N, hình bổ sung trực tuyến S3E-I). Cho đến nay, chúng tôi đã phát hiện ra rằng CAG có thể thúc đẩy sự biểu hiện các yếu tố phiên mã của các gen liên quan đến trình diện kháng nguyên, do đó tăng cường chức năng trình diện kháng nguyên của tế bào ung thư. Tuy nhiên, làm thế nào các tế bào ung thư này phản ứng với các phản ứng của tế bào miễn dịch vẫn chưa rõ ràng.

Để khám phá hiện tượng CAG thúc đẩy sự trình diện kháng nguyên của tế bào ung thư, chúng tôi đã thực hiện phân tích quỹ đạo để điều tra cách các tế bào ung thư thay đổi lẫn nhau để đáp ứng với phản ứng của tế bào miễn dịch. Chúng tôi nhận thấy rằng, theo thời gian, các tế bào ung thư C07 biến đổi thành các tế bào C05, C06 và C08, đồng thời quá trình làm giàu gen cũng cho thấy rằng các tế bào ung thư sẽ chuyển sang trình diện kháng nguyên (hình 3A–E).

CAG tăng cường chức năng tiêu diệt tế bào miễn dịch

Những kết quả này cho thấy CAG có thể trình diện các kháng nguyên tế bào khối u, vậy liệu việc tăng cường trình diện kháng nguyên tế bào khối u có dẫn đến tăng cường chức năng tế bào miễn dịch hay không? Để tìm ra điều này, chúng tôi đã phân tích tế bào lympho và tế bào myeloid tương ứng. Kết quả cho thấy CAG đã thúc đẩy sự xâm nhập của CD8 cộng với tế bào T trong các mô khối u và sự xâm nhập của CD8 cộng với tế bào T và tế bào NK cũng tăng lên, được phát hiện bằng phương pháp tế bào học dòng chảy (hình bổ sung trực tuyến S4A-F). Chúng tôi cũng quan sát thấy rằng CAG đã tăng cường sự biểu hiện của các gen Ifitm2, Cxcr6 và S100a6 trong tế bào CD8 cộng với tế bào T,

Các gen Fcer1g, Gzmb, AW112010 và Zfp36i2 trong các tế bào NK cũng như các gen Nfkbia và Junb trong các tế bào CD4 cộng với T (hình bổ sung trực tuyến S4G). Biểu hiện của Ifng và Gzmb trong CD8 cộng với các tế bào T cũng được tăng cường đáng kể, như được phát hiện bằng phương pháp tế bào học dòng chảy (hình bổ sung trực tuyến S4H, I). Hơn nữa, chúng tôi phát hiện ra rằng sau khi điều trị bằng CAG, sự biểu hiện của các thụ thể ức chế Lag3, Tigit và Havcr2 trên bề mặt của tế bào CD8 cộng với tế bào T đã giảm và sự biểu hiện của các gen Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5 và Pdcd1, đặc trưng cho kích hoạt CD8 cộng với các tế bào T, tăng đáng kể (hình bổ sung trực tuyến S4J). Để xác minh thêm rằng CAG đã tăng cường chức năng tiêu diệt tế bào CD8 cộng với tế bào T bằng cách tăng cường trình diện kháng nguyên khối u, chúng tôi đã cấy tế bào CT26 vào khối u được cấy ghép ở chuột trần và quan sát thấy rằng CAG không thể ức chế hiệu quả sự phát triển của khối u (hình bổ sung trực tuyến S4K-M ).

Sau đó, chúng tôi đã phân tích các tế bào myeloid và thấy rằng các tế bào Spp1 cộng với TAM tăng lên sau khi điều trị bằng CAG, trong khi số lượng tế bào C1qc cộng với TAM giảm và số lượng Il1b cộng với bạch cầu đơn nhân tăng lên (hình bổ sung trực tuyến S5A-D). Sau khi điều trị bằng CAG, các tế bào Spp1 cộng với TAM và C1qc cộng với TAM dễ bị chuyển đổi TAM gây viêm hơn. Phân tích làm giàu cho thấy rằng nó chủ yếu tập trung vào Tnf- , Ifn-g và đường truyền tín hiệu phản ứng viêm (hình bổ sung trực tuyến S5E-H). Dựa trên các kết quả nêu trên, chúng tôi suy luận rằng CAG tăng cường chức năng nhận dạng và tiêu diệt tế bào miễn dịch bằng cách thúc đẩy sự trình diện kháng nguyên trong tế bào ung thư. Tuy nhiên, CAG được quy định như thế nào thì không rõ ràng.

Khám phá protein mục tiêu CAG CTSB bằng bẫy

Tiếp theo, chúng tôi sẽ điều tra protein mục tiêu CAG cụ thể đóng vai trò chống ung thư. Chúng tôi chọn tế bào ung thư làm đối tượng nghiên cứu vì nhận thấy CAG có thể tăng cường trình diện kháng nguyên của tế bào ung thư, từ đó tăng cường chức năng tiêu diệt tế bào miễn dịch. Đầu tiên, chúng tôi tổng hợp dẫn xuất biotin của CAG và nhận thấy rằng chỉ 3-OH mới có thể phản ứng (hình bổ sung trực tuyến S6A). Sau đó, chúng tôi đã điều tra xem liệu CAG-biotin có thúc đẩy sự biểu hiện của các gen liên quan đến trình diện kháng nguyên trong dòng tế bào khối u MC38 của chuột hay không. Kết quả cho thấy CAG-biotin không ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gen H2-K1, Cd74 và Anxa1 (hình bổ sung trực tuyến S6B-D).

Do đó, chúng tôi đã sử dụng phương pháp tìm kiếm mục tiêu TRAP trước đây trong phòng thí nghiệm.32 Cả CAG và DMSO đều được ủ với dòng tế bào MC38 (hình 4A). Chúng tôi đã chọn protein có FC Lớn hơn hoặc bằng 2 và ap Nhỏ hơn hoặc bằng 0.05 làm protein mục tiêu ứng viên của CAG. Theo nguyên tắc liên kết của các phân tử nhỏ với protein sẽ dẫn đến hiệu quả ghi nhãn của lysine thấp, chúng tôi đã chọn CTSB cho nghiên cứu (hình 4B). Tiếp theo, chúng tôi sử dụng thử nghiệm dịch chuyển nhiệt tế bào (hình 4) và phép đo nhiệt di vi mô (MST) (hình 4D) để xác minh sự gắn kết giữa CAG và CTSB, và nhận thấy rằng ái lực giữa CAG và CTSB là 26,6nM (hình 4D). Sau đó, chúng tôi đã dự đoán các vị trí liên kết giữa CAG và CTSB theo cấu trúc tinh thể protein của CTSB trong thư viện PDB. Chúng tôi thấy rằng các nhóm hydroxyl ở cả hai đầu của CAG và các vị trí ALA77 và GLY198 của CTSB được liên kết bởi một liên kết hydro, trong khi các vị trí TYR75, PRO76 và ALA173 của CAG và CTSB bị liên kết bởi lực van der Waals (hình 4E) . Để xác minh vị trí liên kết giữa CAG và CTSB, chúng tôi đã chuyển plasmid đột biến của CTSB vào các tế bào -116 HCT. Kết quả cho thấy ái lực giữa plasmid đột biến ở A77V và G198A và CAG cao gấp hàng trăm lần so với plasmid WT (hình 4F, G). Trong phần tiếp theo, chúng ta khám phá cơ chế cụ thể mà CAG đóng vai trò chống khối u thông qua CTSB.

【Để biết thêm thông tin:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】