Phân Lập Chiết Xuất Từ Vi Sinh Vật Cộng Sinh San Hô Mềm Salinispora Arenicola Có Tác Dụng Chống Lão Hóa Và Bảo Vệ Tế Bào Chết Phần 1

trừu tượng: Các tế bào đã phát triển một hệ thống tích hợp cao chịu trách nhiệm cho sự ổn định của hệ protein, cụ thể là mạng lưới cân bằng protein (PN). Vì mất cân bằng protein là một dấu hiệu đặc trưng của lão hóa và các bệnh liên quan đến tuổi tác, nên việc kích hoạt các mô-đun PN có thể có thể kéo dài tuổi thọ. Ở đây, chúng tôi trình bày dữ liệu về hoạt tính sinh học của chiết xuất (SA223-S2BM) được tinh chế từ chủng Salinispora arenicola TM223-S2 được phân lập từ san hô mềm Scleronephthya lewinsohni; san hô này được thu thập ở độ sâu 65 m từ hệ sinh thái Mesophotic Biển Đỏ EAPC (nam Eilat, Israel). Xử lý tế bào người bằng các mô-đun proteostatic được kích hoạt SA223-S2BM làm giảm tải lượng oxy hóa và mang lại khả năng bảo vệ chống lại stress oxy hóa và độc tính gen. Hơn nữa, SA223-S2BM đã tăng cường các hoạt động của proteasome và lysosomal-cathepsins ở ruồi Drosophila và thể hiện tác dụng bảo vệ da được chứng minh bằng sự ức chế hiệu quả các enzym liên quan đến lão hóa da, elastase và tyrosinase. Chúng tôi đề xuất rằng chiết xuất SA223-S2BM tạo thành một nguồn có khả năng hứa hẹn để ưu tiên các phân tử có đặc tính chống lão hóa.

Glycoside của cistanche cũng có thể làm tăng hoạt động của SOD trong các mô tim và gan, đồng thời làm giảm đáng kể hàm lượng lipofuscin và MDA trong mỗi mô, loại bỏ hiệu quả các gốc oxy phản ứng khác nhau (OH-, H₂O₂, v.v.) và bảo vệ chống lại tổn thương DNA gây ra bởi gốc OH. Cistanche phenylethanoid glycoside có khả năng loại bỏ gốc tự do mạnh mẽ, khả năng khử cao hơn vitamin C, cải thiện hoạt động của SOD trong huyền phù tinh trùng, giảm hàm lượng MDA và có tác dụng bảo vệ nhất định đối với chức năng màng tinh trùng. Cistanche polysacarit có thể tăng cường hoạt động của SOD và GSH-Px trong hồng cầu và mô phổi của chuột lão hóa thực nghiệm do D-galactose gây ra, cũng như làm giảm hàm lượng MDA và collagen trong phổi và huyết tương, đồng thời tăng hàm lượng elastin, có tác dụng nhặt rác tốt đối với DPPH, kéo dài thời gian thiếu oxy ở chuột già, cải thiện hoạt động của SOD trong huyết thanh và làm chậm quá trình thoái hóa sinh lý của phổi ở chuột già thực nghiệm. Với sự thoái hóa hình thái tế bào, các thí nghiệm đã chỉ ra rằng Cistanche có khả năng chống oxy hóa tốt và có tiềm năng trở thành dược phẩm ngăn ngừa và điều trị các bệnh lão hóa da. Đồng thời, echinacoside trong Cistanche có khả năng đáng kể trong việc loại bỏ các gốc tự do DPPH và có khả năng loại bỏ các loại oxy phản ứng và ngăn chặn sự thoái hóa collagen do gốc tự do gây ra, đồng thời cũng có tác dụng sửa chữa tốt đối với tổn thương anion gốc tự do của thymine.

Bấm vào cistanches herba

【Để biết thêm thông tin:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

từ khóa: sự lão hóa; phản ứng chống oxy hóa; vi sinh vật biển; mạng lưới nguyên sinh chất; Salinispora arenicola

1. Giới thiệu

Lão hóa được đặc trưng bởi sự suy giảm khả năng hoạt động và khả năng chống lại căng thẳng phụ thuộc vào thời gian, cũng như tăng tỷ lệ tử vong và bệnh tật [1]. Lão hóa không chỉ là một quá trình thụ động, vì nó được điều chỉnh bởi các sự kiện báo hiệu tế bào và phân tử được bảo tồn tiến hóa [2,3]. Các sinh vật liên tục bị thách thức bởi cả các yếu tố gây căng thẳng bên trong (liên quan đến trao đổi chất) và bên ngoài (có nguồn gốc từ chế độ ăn uống hoặc môi trường), có thể dẫn đến sự tích tụ dần dần của các phân tử sinh học bị hư hỏng và cuối cùng làm tổn hại đến cân bằng nội môi của tế bào [4,5]. Protein tham gia vào tất cả các chức năng quan trọng của tế bào và do đó, cân bằng nội môi của hệ protein (cân bằng protein) rất quan trọng đối với chức năng và sự sống của tế bào [6].

Tính toàn vẹn của hệ protein được duy trì bởi mạng lưới cân bằng protein (PN), mở rộng đến tất cả các ngăn dưới tế bào và được điều chỉnh ở cấp độ tế bào, mô và sinh vật để đảm bảo sức khỏe và tuổi thọ của sinh vật [7]. Duy trì sự cân bằng protein đòi hỏi các tế bào phối hợp và điều chỉnh các chức năng tổng hợp, gấp nếp, sắp xếp, vận chuyển và phân hủy của tất cả các polypeptide [8,9]. Các chức năng tế bào này chủ yếu được thực hiện bởi ba nhánh chính của PN được kết nối với nhau, đó là mạng lưới các chaperone phân tử, ubiquitin-proteasome-(UPP) và các con đường phân giải protein autophagy-lysosome-(ALP) [10,11].

Những người đi kèm phân tử đảm bảo sự gấp nếp và duy trì hình dạng của protein thích hợp, đồng thời chúng cũng hợp tác với các con đường thoái hóa [12]. UPP là nơi kiểm soát chất lượng tổng hợp protein chính và tham gia vào quá trình tái chế các protein có thời gian sống ngắn bình thường và các protein bị gấp sai hoặc không được mở ra không thể sửa chữa được [6], trong khi ALP chịu trách nhiệm nhận biết và loại bỏ các tập hợp protein và các bào quan bị hư hỏng [13]. Mất cân bằng protein là một dấu hiệu lão hóa [14], cũng như là yếu tố nguy cơ chính đối với nhiều bệnh lý liên quan đến tuổi tác ở người, bao gồm ung thư, tiểu đường, rối loạn tim mạch và bệnh thoái hóa thần kinh [15]. Do đó, kích hoạt PN được coi là một phương pháp đầy hứa hẹn để trì hoãn sự khởi phát và/hoặc tiến triển của lão hóa và các bệnh liên quan đến tuổi tác [16–18].

Lão hóa da được đặc trưng bởi những thay đổi về cấu trúc và chức năng trong (trong số những thành phần khác) của ma trận ngoại bào, chẳng hạn như elastin [19]. Elastase là enzyme liên quan đến sự thoái hóa của elastin, dẫn đến sự phát triển của các nếp nhăn và mất tính đàn hồi [20]. Tyrosinase là một loại enzyme quan trọng trong quá trình tổng hợp melanin, chịu trách nhiệm tạo ra sắc tố của da người (trong số những loại khác) [21,22]. Tuy nhiên, việc kích hoạt quá mức tyrosinase có liên quan đến một số rối loạn về da, chẳng hạn như tăng sắc tố và khối u ác tính [22,23]. Do đó, ức chế elastase và tyrosinase tạo thành một cách tiếp cận nổi bật chống lão hóa da.

Các sản phẩm tự nhiên (NP) có lịch sử lâu đời—được ghi chép rõ ràng, trước khi khoa học và công nghệ hiện đại ra đời, trong các nền văn hóa khác nhau—về điều trị bệnh cho con người [24–26]. Do đó, các NP có thể đóng vai trò là nguyên liệu ban đầu và giàn giáo được làm giàu cao để phát triển thuốc; thực sự, hơn một nửa số loại thuốc là NP, có nguồn gốc từ NP hoặc lấy cảm hứng từ NP [27–29]. Thế giới biển, nơi chứa đựng đa dạng sinh học nhất, phần lớn chưa được khám phá và do đó có thể là nguồn tài nguyên lớn nhất để khám phá các VQG mới [30]. Trong số các sinh vật sống trong môi trường biển, san hô mềm là nhà cung cấp đầy hứa hẹn các NP hoạt tính sinh học và được biết là nơi chứa nhiều vi sinh vật đa dạng [31,32].

Với những sự thật này, chúng tôi hiện đang thực hiện sàng lọc NP thông lượng cao trên diện rộng để xác định các phân tử hoạt tính sinh học có khả năng làm chậm quá trình lão hóa tế bào và / hoặc lão hóa in vivo. Trong nghiên cứu được trình bày ở đây, chúng tôi đã kiểm tra chiết xuất metanol, cụ thể là SA223-S2BM, của chủng Salinispora arenicola (S. arenicola) TM223-S2 bằng cách áp dụng các thử nghiệm in vitro, cũng như thử nghiệm dựa trên tế bào và các phương pháp hướng dẫn sinh học in vivo. Chủng S. arenicola TM223-S2 được phân lập từ san hô mềm Scleronephthya lewinsohni (S. Levinson) (ban đầu được đặt tên là Scleronephthya lewinsohni bởi Verseveldt và Benayahu, 1978), được thu nhận một cách bền vững từ EAPC của hệ sinh thái Mesophotic Biển Đỏ ( nam Eilat, Israel) ở độ sâu 65 m. Dịch chiết metanol SA223-S2BM đã kích hoạt cơ chế bảo vệ tế bào ở cả tế bào người và ruồi Drosophila melanogaster (D. melanogaster) và phát huy các đặc tính bảo vệ da trong ống nghiệm. Do đó, chiết xuất SA223-S2BM có thể là nguồn để xác định khả năng các phân tử có đặc tính chống lão hóa và bảo vệ tế bào tiềm năng.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. SA223-Nguồn gốc và cách ly của trích xuất S2BM

2.1.1. Bộ sưu tập san hô

San hô mềm S. Levinson được thu thập bằng ROV H800 (ECA Robotics) do Sam Rothberg R/V của Viện Khoa học Hàng hải Đa dạng ở Eilat (IUI) vận hành. Tại chỗ, việc chụp ảnh được thực hiện bằng máy ảnh đen trắng ánh sáng yếu VS300 (ECA Robotics) và máy ảnh 1CAM Alpha HD (Hình ảnh SubC). Các mẫu được lấy bằng nhánh ROV từ rạn san hô mesophotic của Eilat, ngoài bến cảng dầu (29◦300 47.0900 N, 34◦350 56.7100 E), ở độ cao 65 m, vào ngày 7 tháng 3 2017. Địa điểm thu gom có ​​đặc điểm là độ dốc vừa phải với các mảng đá bao quanh bởi đáy biển đầy cát. Sau khi thu thập, vật liệu ngay lập tức được đông lạnh ở -80 ◦C. Một mẫu chứng từ được bảo quản trong etanol 70 phần trăm để nhận dạng phân loại và gửi tại Bảo tàng Lịch sử Tự nhiên Steinhardt, Đại học Tel Aviv (SMNHTAU_Co_37500).

2.1.2. Cách ly và nhận dạng chủng

S. arenicola TM223-S2 được phân lập từ 1 mL mẫu S. Levinson. Mẫu san hô mềm thu thập được nghiền trong nước biển vô trùng và đun nóng ở 50 ◦C trong 1 giờ. Huyền phù thu được được pha loãng nhiều lần, cấy trên môi trường thạch phân lập chọn lọc và ủ ở 28 ◦C trong ít nhất 6 tuần. Chủng Salinispora đã được phân lập, và khuẩn lạc được làm sạch trên môi trường thạch nước biển (MBA) (Difco, Thermo Fisher Khoa học Inc., Waltham, MA, Hoa Kỳ) và được bảo quản ở -20 ◦C trong dung dịch 10% glycerol.

2.1.3. Điều tra phát sinh loài

Phân tích phát sinh loài được thực hiện bằng cách sử dụng một đoạn gen 16S rRNA được khuếch đại từ DNA bộ gen của S. arenicola TM223-S2. Theo hướng dẫn của nhà sản xuất, DNA bộ gen của chủng TM223-S2 đã được phân lập bằng cách sử dụng Bộ mô và máu DNeasy (Qiagen). Đoạn ARN ribosom 16S được khuếch đại bằng PCR sử dụng các đoạn mồi 16S F 27, AGA GTT TGA TC(AC) TGG CTC AG (Tm: 56.3 ◦C), và 16S R 1492, TAC GG(CT) TAC CTT GTT ACG ACT T ( Tm: 57,5 ​​◦C). Các bộ khuếch đại được giải trình tự bằng trình tự Sanger và các trình tự này được sắp xếp theo cơ sở dữ liệu RNA ribosome 16S của dự án Targeted Loci của NCBI bằng cách sử dụng MUSCLE. Căn chỉnh đã được kiểm tra thủ công và các khoảng trống đã được loại bỏ. Lịch sử tiến hóa đã được suy luận bằng cách sử dụng phương pháp khả năng tối đa và mô hình Tamura–Nei [33] với 1000 lần lặp lại. Cây ban đầu cho tìm kiếm heuristic thu được tự động bằng cách áp dụng thuật toán BioNJ kết hợp hàng xóm với ma trận khoảng cách theo cặp được ước tính bằng cách sử dụng phương pháp khả năng tổng hợp tối đa (MCL) và sau đó chọn cấu trúc liên kết có giá trị khả năng log cao hơn. Các phân tích tiến hóa được thực hiện trong phiên bản MEGA X 10.1.7 [34].

2.1.4. Điều kiện canh tác

Các bào tử S. arenicola TM223-S2 được bảo tồn ở −20 ◦C trong 10% glycerol. Trước khi nuôi cấy, chủng này đã được hồi sinh trong 15 ngày trên đĩa Petri 15 cm chứa MB (Difco, Thermo Fisher Khoa học Inc., Waltham, MA, Hoa Kỳ) được bổ sung 2% Agar (Difco, Thermo Fisher Khoa học Inc., Waltham, MA , HOA KỲ). Nước biển vô trùng (4 × 10 mL) được đổ lên bề mặt đĩa, và các bào tử và sợi nấm được thu hồi từ đĩa bằng cách dùng dao mổ cào nhẹ lên bề mặt để tạo ra chất cấy. Quá trình lên men ở trạng thái lỏng (LSF) được tiến hành trong bình nón 2 L trong 20 ngày ở 28 ◦C và khuấy trộn 130 vòng/phút. Nhựa Amberlite XAD16 (30 g/L) (Amberlite XAD16HP N, Certis, Lenntech, Delfgauw, Hà Lan) được thêm vào trước khi khử trùng để cho phép bẫy các chất chuyển hóa của vi khuẩn tại chỗ. Năm ml dịch cấy được sử dụng để cấy 1 L trên MB chứa 30 g nhựa Amberlite XAD16. Quá trình lên men ở trạng thái thạch kết hợp với chiết xuất pha rắn (SPE) [35] được thực hiện trên môi trường MB (Difco, Thermo Fisher Science Inc., Waltham, MA, USA) được bổ sung 2% Agar (Difco, Thermo Fisher Science Inc., Waltham, MA, USA) trong hơn 20 ngày ở 28 ◦C. Amberlite XAD16 (35 g) đã khử trùng được trộn với 35 mL chất cấy được trải đều trên bề mặt của đĩa thạch Petri 1 MB (25 cm × 25 cm).

Đối với LSF, nhựa XAD16 được tách ra khỏi canh trường nuôi cấy thông qua quá trình lọc và rửa bằng nước trước khi được rửa giải bằng etyl axetat (100 mL) và sau đó bằng metanol (100 mL). Dịch rửa giải được cô đến khô trong chân không và được hòa tan trong DMSO ở nồng độ 10 mg/mL. Dịch chiết thu được, SA223-S2LAE (được chiết xuất bằng etyl axetat), được sử dụng để đánh giá sinh học.

Đối với SPE, nhựa XAD16 được thu hồi bằng cách cào cẩn thận bề mặt đĩa thạch. Nhựa thu hồi được rửa bằng nước để loại bỏ sinh khối trước khi được rửa giải bằng etyl axetat (100 mL) và sau đó bằng metanol (100 mL). Dịch rửa giải được cô đến khô trong chân không và được hòa tan trong DMSO ở nồng độ 10 mg/mL. Các chất chiết xuất thu được, SA223-S2BAE (được chiết xuất bằng etyl axetat) và SA223-S2BM (được chiết xuất bằng metanol), được sử dụng để đánh giá sinh học.

2.2. Các hoạt động ức chế Elastase và Tyrosinase

Hoạt tính ức chế elastase của chiết xuất ưu tiên được đánh giá bằng cách sử dụng elastase từ tuyến tụy lợn (PPE) loại IV (Merck KGaA, Darmstadt, Đức) và cơ chất N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (Merck KGaA, Darmstadt, Đức), như đã mô tả trước đây [36]. Khả năng ức chế hoạt động xúc tác của tyrosinase trong quá trình oxy hóa L-DOPA thành dopachrom của chiết xuất đã được xác định, như đã báo cáo trước đây [37].

2.3. Các dòng tế bào, điều kiện nuôi cấy tế bào và xét nghiệm khả năng sống của tế bào

Nguyên bào sợi bao quy đầu của con người (tế bào BJ) được mua từ Bộ sưu tập Văn hóa Mô Hoa Kỳ (ATCC), trong khi tế bào sừng bất tử của con người (tế bào HaCaT) được lấy từ Elabscience, Inc. Cả hai dòng tế bào đều được nuôi cấy trong Môi trường Modified Eagle's (DMEM) của Dulbecco (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) bổ sung 10 phần trăm (v/v) huyết thanh bào thai bò (FBS) và 1 phần trăm (v/v) axit amin không thiết yếu và được duy trì trong điều kiện 5 phần trăm CO2, 95 phần trăm độ ẩm và 37 ◦C. Trong tất cả các quy trình thử nghiệm được áp dụng, các tế bào đã được cấy chuyền bằng cách sử dụng dung dịch trypsin/EDTA (Thermo Fisher Science Inc., Waltham, MA, USA). Ảnh hưởng của chiết xuất SA223-S2BM đối với khả năng tồn tại của tế bào được ước tính bằng cách sử dụng xét nghiệm MTT, như đã báo cáo trước đây [38]. Xử lý tế bào bằng hydro peroxide (H2O2) và doxorubicin (DXR) đã được thực hiện như mô tả trong truyền thuyết hình; H2O2 và DXR được lấy từ Merck KGaA (Darmstadt, Đức).

2.4. Các dòng Drosophila và xét nghiệm tuổi thọ

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chủng Drosophila w1118 được mua từ Trung tâm chứng khoán Bloomington Drosophila (Bloomington, IN, Hoa Kỳ). Ruồi được duy trì ở nhiệt độ 25 ◦C và độ ẩm 60 phần trăm trong chu kỳ 12 giờ sáng: 12 giờ tối. Trong tất cả các thí nghiệm được trình bày, chỉ có các mô soma (đầu và ngực) của ruồi được phân tích, vì các mô sinh sản thể hiện sự điều hòa riêng biệt của các cơ chế tạo protein và tốc độ lão hóa so với các mô soma [39].

Tuổi thọ của ruồi đã được thử nghiệm như được mô tả trước [40] bằng cách sử dụng ruồi cái và ruồi đực (số lượng bằng nhau trên mỗi giới tính) được nuôi cấy trong các lọ chứa (hoặc không) chiết xuất được nghiên cứu. Ruồi được chuyển vào lọ đựng thức ăn tươi hai ngày một lần và số ca tử vong được ghi nhận hàng ngày. Đối với các đường cong sinh tồn và phân tích thống kê, quy trình Kaplan–Meier và thử nghiệm thứ hạng nhật ký (Mantel–Cox) đã được sử dụng; ý nghĩa đã được chấp nhận ở p <0,05.

2.5. Đo lường các loại oxy phản ứng (ROS)

Tế bào hoặc mô của ruồi được ủ với thuốc nhuộm CM-H2DCFDA (Thermo Fisher Science Inc., Waltham, MA, USA) ở nồng độ 10 µM trong PBS trong 30 phút trong bóng tối (37 ◦C và 25 ◦C, tương ứng). Sau khi loại bỏ thuốc nhuộm, các tế bào hoặc mô của ruồi được ủ với PBS trong 15 phút trong bóng tối (37 ◦C và 25 ◦C, tương ứng), được ly giải trong dung dịch đệm ly giải [150 mM NaCl, 1 phần trăm (v/v) NP{{ 11}}, 50 mM Tris, pH 8,0] và sau đó ly tâm ở 14,000 g trong 15 phút (4 ◦C). Sau đó, hàm lượng protein được đo bằng xét nghiệm Bradford (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) và huỳnh quang tạo ra được đo bằng đầu đọc vi bản đa chế độ Spark® (Tecan Trading AG, Männedorf, Thụy Sĩ) khi kích thích và bước sóng phát xạ lần lượt là 490 và 540 nm. Hydrogen peroxide (H2O2) đã được sử dụng như một biện pháp kiểm soát tích cực, vì nó được biết đến rộng rãi là gây ra thiệt hại/căng thẳng oxy hóa [41].

2.6. Phân tích trích xuất RNA, tổng hợp cDNA, s và PCR định lượng thời gian thực (Q-RT-PCR)

Tổng RNA được chiết xuất từ ​​​​các tế bào bằng RNAiso plus (Takara Bio Inc., Shiga, Nhật Bản) và được định lượng bằng máy quang phổ BioSpec-nano (Shimadzu Inc., Kyoto, Nhật Bản). Sau đó, 1 RNAg RNA đã được chuyển đổi thành cDNA bằng cách sử dụng Bộ cDNA FastGene Scriptase II (NIPPON Genetics, Düren, Đức). Để thực hiện các phân tích PCR thời gian thực định lượng, Supermix 5x HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR (Solis BioDyne, Tartu, Estonia) và Hệ thống PCR thời gian thực PikoRealTM (Thermo Fisher Science Inc., Waltham, MA, USA) đã được sử dụng. Các đoạn mồi cụ thể cho gen người được nghiên cứu đã được mô tả trước đây [42]. Gen HMBS đã được sử dụng như một chất chuẩn hóa.

2.7. Phân tích miễn dịch và đo lường hoạt động của Proteasome và Cathepsins

Các nghiên cứu về quá trình miễn dịch đã được tiến hành như mô tả trước đây [43]. Các kháng thể thứ cấp liên hợp peroxidase sơ cấp và cải ngựa được áp dụng trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng và các đốm miễn dịch được phát triển bằng cách sử dụng bộ thuốc thử phát quang hóa học nâng cao (ClarityTM Western ECL Substrate, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Định lượng các đốm miễn dịch được thực hiện bằng phép đo mật độ quét và phần mềm ImageJ [44].

Hoạt tính enzym proteasome và cathepsins trong tế bào hoặc mô của ruồi được đo bằng Hệ thống máy đo huỳnh quang VersaFluor™ (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) bằng cách sử dụng Suc-LLVY-AMC (hoạt tính giống chymotrypsin, CT-L) và Z-FR-AMC fluoropeptide (Enzo Life Science, Inc., Farmingdale, NY, USA), tương ứng, như đã mô tả trước đây [42,45,46]. 6-bromoindirubin-30 -oxime (6BIO) đã được sử dụng như một biện pháp kiểm soát tích cực, vì nó được biết là kích hoạt UPP cả trong tế bào người và ruồi Drosophila [42,47]; thuốc Rapamycin, được sử dụng như một biện pháp kiểm soát tích cực đối với cảm ứng ALP và cathepsins [48].

2.8. kháng thể được sử dụng

Các kháng thể chính chống lại tiểu đơn vị đáng tin cậy 5 (sc-55009), NQO1 (sc-16464), Beclin 1 (BECN1) (sc-11427), Clusterin (CLU) (sc{{7} }), HSP27 (sc-13132), HSP70 (sc-59570) và GAPDH (sc-25778), cũng như các kháng thể thứ cấp liên hợp với peroxidase cải ngựa, được mua từ Santa Cruz Công nghệ sinh học, Inc. (Dallas, TX, Hoa Kỳ). Các kháng thể chính chống lại 53BP1 (4937), phospho-Histone H2A.XSer139 ( H2A.X) (9718) và phosphor-p53Ser15 (9286) được lấy từ Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Kháng thể chống lại SQSTM1/p62 (BML-PW9860) được mua từ Enzo Life Science, Inc. (Farmingdale, NY, USA).

2.9. Phân tích thống kê

Các thí nghiệm đã được thực hiện ít nhất trong các bản sao. MS Excel đã được sử dụng để phân tích thống kê. Ý nghĩa thống kê được đánh giá bằng cách sử dụng bài kiểm tra t của Sinh viên (t-test). Điểm dữ liệu tương ứng với giá trị trung bình của các thử nghiệm độc lập và các thanh lỗi biểu thị độ lệch chuẩn (SD); ý nghĩa tại p < 0.05 hoặc p < 0,01 được biểu thị trong biểu đồ bằng một hoặc hai dấu sao tương ứng.

3. Kết quả

3.1. Xác định Actinomycete liên kết với San hô mềm S. Levinson

Chủng vi khuẩn mục tiêu được phân lập từ san hô S. Levinson, một loài san hô mềm đặc hữu của Biển Đỏ. Các quần thể của loài san hô này thường được tìm thấy ở các vị trí sâu, cả trong hệ sinh thái rạn san hô mesophotic phía trên (30–60 m) và trong hệ sinh thái rạn san hô mesophotic phía dưới (60–105 m) [49]. Hơn nữa, nó là một loại san hô mềm azooxanthellate có được các yêu cầu năng lượng của nó bằng cách cho ăn lọc và do đó, nó được tìm thấy trong môi trường sống tiếp xúc với dòng nước mạnh.

Từ phân tích phát sinh loài dựa trên trình tự 16S rRNA, TM223-S2 phân lập được phát hiện thuộc giống Salinispora (Hình 1).

Vì S. arenicola có thể được phân biệt với S. Pacifica và S. tropica dựa trên trình tự 16S rRNA [50], nên chúng tôi đặt tên cho chủng S. arenicola TM223-S2 này với số gia nhập Ngân hàng gen là MW446171. Chủng này được nuôi cấy như đã báo cáo trong Phần Vật liệu và Phương pháp và được chiết xuất tương ứng bằng etyl axetat và metanol. Điều tra sinh học sơ bộ chỉ ra rằng dịch chiết từ dịch nuôi cấy lỏng, SA223-S2BAE và dịch chiết etyl axetat từ dịch nuôi cấy rắn, SA223-S2LAE, không có bất kỳ hoạt động sinh học đáng kể nào (Hình S1). Do đó, chỉ dịch chiết metanol từ môi trường nuôi cấy rắn kết hợp với chiết pha rắn, SA223-S2BM, được sử dụng trong nghiên cứu này.

3.2. SA223-S2BM trích xuất không có độc tính trong tế bào người và kích hoạt các thành phần chính của PN

Đầu tiên, chúng tôi đã kiểm tra tác động của SA223-S2BM đối với khả năng tồn tại của nguyên bào sợi BJ trên da bình thường và tế bào sừng HaCaT bất tử ở người bằng cách thực hiện xét nghiệm độc tính MTT. Với mục đích này, các tế bào được ủ trong 24 giờ với nồng độ dịch chiết tăng dần và, như thể hiện trong Hình 2A1, A2, dịch chiết không gây tác dụng gây độc tế bào đối với một trong hai dòng tế bào được kiểm tra ở nồng độ lên đến 10 µg/mL ; ở nồng độ cao hơn (trên 10 µg/mL), dịch chiết làm giảm khả năng sống của tế bào chủ yếu ở các tế bào HaCaT.

Sau đó, chúng tôi đã nghiên cứu tác dụng của chiết xuất trên các con đường của tế bào, đảm bảo sự ổn định của hệ protein của tế bào. Chúng tôi quan sát thấy rằng sự tiếp xúc ngắn hạn (24 giờ) của các nguyên bào sợi BJ với chiết xuất được nghiên cứu đã gây ra đáng kể sự biểu hiện của gen proteasome PSMB7 (ở nồng độ 10 µg/mL), trong khi song song, nó có xu hướng làm tăng biểu hiện của gen PSMB6 ở cùng nồng độ (Hình 2B1). Ngoài ra, dịch chiết tạo ra sự biểu hiện của gen đáng tin cậy 20S, PSMB6, và của gen đáng tin cậy 19S, RPN11 ở nồng độ 1 µg/mL trong các tế bào HaCaT (Hình 2B2). Hơn nữa, việc xử lý nguyên bào sợi BJ bằng dịch chiết trong 24 giờ dẫn đến cảm ứng nhẹ về mức độ biểu hiện của tiểu đơn vị đáng tin cậy 20S 5 ở nồng độ 1 µg/mL (Hình 2C). Để hỗ trợ cho những phát hiện của chúng tôi, việc tiếp xúc với chiết xuất đã làm tăng đáng kể hoạt động đáng tin cậy giống như chymotrypsin ở cả nguyên bào sợi BJ và tế bào sừng HaCaT sau 24 giờ ủ (Hình 2D1, D2); các kết quả khác nhau về nồng độ được kiểm tra của chất chiết xuất giữa các tế bào BJ và HaCaT có thể được quy cho các hiệu ứng cụ thể của loại tế bào.

Ngoài ra, các phân tích biểu hiện Q-RT-PCR cho thấy rằng việc xử lý nguyên bào sợi BJ bằng dịch chiết trong 24 giờ đã tạo ra mức độ biểu hiện của các gen liên quan đến ALP, có tên là CTSB, CTSL, CTSD và SQSTM1, ở nồng độ 10 µg/mL ( Hình 3A1). Hơn nữa, chúng tôi đã quan sát thấy rằng việc các tế bào HaCaT tiếp xúc với dịch chiết trong 24 giờ đã dẫn đến việc tạo ra các mức độ biểu hiện của các gen liên quan đến chức năng ALP (CTSB, CTSL, CTSD và SQSTM1) (Hình 3A2).

Phù hợp với những phát hiện này, chúng tôi đã ghi nhận sự điều chỉnh lại của các protein liên quan đến quá trình tự thực BECN1 và SQSTM1/p62 sau khi các nguyên bào sợi BJ tiếp xúc với dịch chiết ở nồng độ 1 µg/mL (Hình 3B1); mức độ biểu hiện của các protein BECN1 và SQSTM1/p62 cũng tăng lên, cũng được quan sát thấy trong các tế bào sừng HaCaT ở cả hai nồng độ được nghiên cứu (Hình 3B2). Theo đó, chúng tôi nhận thấy rằng dịch chiết đã tăng cường hoạt động enzym của lysosomal cathepsins trong cả tế bào BJ và HaCaT (Hình 3C1, C2); một lần nữa, các kết quả khác nhau về nồng độ được kiểm tra của chất chiết xuất giữa các tế bào BJ và HaCaT có thể được quy cho các hiệu ứng cụ thể của loại tế bào.

Hơn nữa, chúng tôi đã kiểm tra tác động của chiết xuất đối với các mức độ biểu hiện của người đi kèm phân tử quan trọng. Do đó, các phân tích mô phỏng miễn dịch tiết lộ rằng chất chiết xuất tạo ra mức độ biểu hiện của các chất đi kèm phân tử CLU (ở cả hai nồng độ được nghiên cứu) trong các tế bào BJ (Hình 3D1), cũng như của HSP27 (1 µg/mL) và HSP70 (ở cả hai nồng độ được nghiên cứu) trong các ô HaCaT (Hình 3D2).

【Để biết thêm thông tin:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】