Tetrandrine làm giảm chấn thương tế bào nang thông qua Calpain phụ thuộc vào canxi -1 Phong tỏa tín hiệu

Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Yin Ding, Xuanli Tang, Yuhui Wang, Dongrong Yu, Caifeng Zhu và Jin Yu *

trừu tượng

Tiểu sử:Podocytes đã trở thành mục tiêu quan trọng cho các can thiệp vào proteinuricquả thậnbệnh tật. Nhiều nghiên cứu đã báo cáo rằng sự biểu hiện quá mức của protein kênh cation 6 tiềm năng thụ thể nhất thời (TRPC6) trong tổn thương tế bào podocyte sẽ điều chỉnh dòng chảy cộng với Ca2 trong tế bào và kích thích tín hiệu calpain calpain -1 phụ thuộc Ca2. Thuốc truyền thống của Trung Quốc, tetrandrine, một chất chẹn kênh Ca2 cộng không chọn lọc, từ lâu đã được sử dụng để điều trị mãn tínhquả thậndịch bệnh. Nghiên cứu này nhằm mục đích khám phá các cơ chế có thể có cơ bản của các đặc tính chống proteinuric của tetrandrine.

Phương pháp:Chúng tôi đã nghiên cứu sự tham gia của tetrandrine trong quá trình truyền tín hiệu Ca2 cộng với calpain phụ thuộc -1 trong tế bào vỏ chuột và chuột mắc bệnh thận do adriamycin. Cyclosporine A (CsA) và U73122 được sử dụng làm đối chứng dương tính. Khả năng tồn tại của tế bào, độc tính tế bào, nồng độ Ca2 cộng, hoạt tính calpain, và mức độ biểu hiện mRNA và protein của đường truyền tín hiệu calpain -1 đã được kiểm tra. Các thay đổi lâm sàng và bệnh lý đã được đo lường.

Kết quả:Tetrandrine làm giảm dòng Ca2 nội bào cộng với dòng chảy trong TRPC 6- podocytes được nuôi cấy biểu hiện quá mức. Trong cả nghiên cứu in vitro và in vivo, việc sử dụng tetrandrine điều hòa hoạt động calpain và sự biểu hiện của calpain -1 và khôi phục sự biểu hiện của Talin hạ nguồn -1 và nephrin. So với CsA, điều trị bằng tetrandrine thể hiện tác dụng ức chế vượt trội đối với hoạt động của calpain và biểu hiện của calpain -1.

Kết luận:Tetrandrine có khả năng điều trị trong tổn thương tế bào podocyte bằng cách ngăn chặn sự hoạt hóa phụ thuộc Ca2 cộng với đường truyền tín hiệu calpain -1. Tetrandrine làm giảm protein niệu, cải thiện chức năng thận và giảm bớt tổn thương bệnh lý thận.

Từ khóa:Tetrandrine, Tổn thương tế bào nang, Protein kênh cation tiềm năng thụ thể thoáng qua 6, Calpain -1

Cistanche tubulosa ngăn ngừa bệnh thận, bấm vào đây để lấy mẫu

Tiểu sử

Podocytes là tiền đề để duy trì tính thấm chọn lọc của hàng rào lọc cầu thận và tính toàn vẹn cấu trúc cầu thận. Tổn thương tế bào nang thường liên quan đến các bệnh thận có proteinuric, bao gồm xơ cứng cầu thận phân đoạn khu trú (FSGS), bệnh thận màng, bệnh thay đổi tối thiểu và bệnh tiểu đườngquả thậnbệnh [1–4]. Bảo vệ và phục hồi các tế bào nang khỏi các yếu tố gây hại là một thách thức lớn trong việc điều trị thành công bệnh thận.

Podocytes là những tế bào được biệt hóa tận cùng, chuyên biệt hóa cao nằm bên ngoài màng đáy cầu thận và được đặc trưng bởi các quá trình chân. Rối loạn chức năng điều hòa tín hiệu canxi trong tế bào podocyte dẫn đến rối loạn tổ chức xương tế bào podocyte actin, biến dạng quá trình chân, phá vỡ cơ hoành và protein niệu. Protein kênh cation thế năng thụ thể thoáng qua 6 (TRPC6), một protein liên kết với màng ngăn mới trong tế bào podocytes, đã được xác định là một kênh ion dẫn cộng Ca2 không đặc hiệu [5–8]. Biểu hiện TRPC6 ở cầu thận tăng lên trong nhiều bệnh proteinuric di truyền và mắc phải. Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng sự biểu hiện quá mức của TRPC6 trong tế bào podocytes gây ra sự gia tăng vượt trội dòng Ca2 nội bào cộng với dòng chảy, được cho là nguyên nhân gây ra tổn thương tế bào podocyte. Lượng canxi tăng lên trong tế bào podocytes kích hoạt các con đường truyền tín hiệu xuôi dòng, bao gồm calpain -1, Talin -1, nephrin và calcineurin, để điều chỉnh hoạt động hoặc biểu hiện của các gen mục tiêu [9–12]. Fangji Huangqi Tang là một loại thuốc y học cổ truyền Trung Quốc (TCM) để điều trị hội chứng thận hư [13]. Nó bao gồm sáu loại thảo mộc: Radix Stephania Tetrandra (rễ của Stephania tetrandra), Radix Astragali (rễ của cây Hoàng kỳ), Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (rễ của cây Atractylodes macrocephaly), Radix Glycyrrhiriszae (rễ của Rhizoma, Zing u) (rễ của Zingiber Officinale) và Fructus Ziziphi Jujubae (Fructus của Ziziphus jujuba) [1]. Tetrandrine, một trong những thành phần hoạt động chính của Radix Stephania Tetrandra, một thuốc chẹn kênh Ca2 cộng với không chọn lọc, đã được thử nghiệm trong các thử nghiệm lâm sàng và được chỉ định để làm giảm protein niệu và cải thiện chức năng thận [14, 15]. Một nghiên cứu trước đây đã chứng minh tác dụng ngăn chặn của tetrandrine đối với tín hiệu RhoA phụ thuộc cộng Ca2 trong tế bào podocytes [16], nhưng các cơ chế cơ bản vẫn chưa được làm sáng tỏ. Trong tài liệu này, các mô hình TRPC 6- biểu hiện quá mức đã được phát triển trong ống nghiệm và in vivo. Sau khi sử dụng tetrandrine, các thay đổi về tín hiệu TRPC 6- phụ thuộc Ca2 cộng với được đánh giá, bao gồm các mục tiêu hạ nguồn, calpain -1, Talin -1, nephrin và calcineurin. Cyclosporine A (CsA), một chất ức chế calcineurin, được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh protein niệu) [17] và U73122, một chất ức chế mở kênh TRPC6 [18] được sử dụng làm đối chứng tích cực.

Phương pháp

Nuôi cấy tế bào và cấu tạo plasmid

Tế bào dòng tế bào podocyte chuột bất tử có điều kiện (MPC5), lấy từ Giáo sư Peter Mundel (Trường Y Mount Sinai, Hoa Kỳ), được duy trì ở 33 độ để tăng sinh, và sau đó chuyển sang 37 độ để biệt hóa. Te TRPC6 biểu hiện plasmid được xây dựng bằng cách sao chép toàn bộ chiều dài của trình tự DNA mã hóa của gen TRPC6 vào các vị trí EcoRI / BamHI của vectơ pCDH-GFP-PURO và được đóng gói thành lentivirus. Khi được biệt hóa và phát triển đến khoảng 80 phần trăm hợp lưu, các tế bào podocytes được gieo hạt với mật độ tế bào 4 × 104 mỗi cm2 và được ủ kết hợp với TRPC 6- vi-rút biểu hiện quá mức. Dòng tế bào ổn định Te TRPC6, được xác minh bằng cách sử dụng protein TRPC6 và biểu hiện mRNA, được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Tus, podocytes MPC5 được chia thành ba nhóm, nhóm kiểm soát bình thường (NC), nhóm lentivirus trống (Lv-NC) và nhóm TRPC 6- biểu hiện quá mức (OverTRP).

Điều trị bằng thuốc tế bào in vitro và thử nghiệm độc tính tế bào

Khả năng tồn tại của tế bào đã được truy cập bằng cách sử dụng bộ công cụ Đếm tế bào {{0}} (CCK -8), theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tổng cộng 5 0 00 MPC5 podocyte trên mỗi giếng đã được phát triển thành bộ ba trong 96- đĩa giếng. Các tế bào được xử lý bằng một loạt CsA (0–2μmol / L; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) và tetrandrine (0–40μmol / L; Sigma Aldrich) ở 37 độ trong 48 giờ. CCK -8 sau đó được thêm vào các đĩa (10μL / giếng), sau đó được ủ trong bóng tối trong 2 giờ. Độ hấp thụ ở bước sóng 450nm được đo bằng đầu đọc vi tấm (BioTek Instruments, USA). Độc tính tế bào được kiểm tra bằng cách định lượng, giải phóng lactate dehydrogenase (LDH) sử dụng Bộ xét nghiệm LDH về độc tính tế bào-WST (Phòng thí nghiệm Dojindo, Nhật Bản). Là một đối chứng tích cực, các tế bào được xử lý với 10μmol / LU73122 (Cal sinh hóa, Hoa Kỳ) ở 37 độ trong 10 phút.

Tách chiết RNA và định lượng phản ứng chuỗi phiên mã ngược-polymerase (qRT ‑ PCR)

RNA tổng số được chuẩn bị từ các tế bào nuôi cấy vàquả thậncác mô sử dụng thuốc thử RNAiso Plus (Takara, Nhật Bản) và được phiên mã ngược thành bộ cDNA PrimeScript ™ RT Master Mix (Takara) theo quy trình của nhà sản xuất. qRT-PCR được thực hiện bằng Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Đức). Trình tự mồi của gen mục tiêu và gen tham chiếu được liệt kê trong Bảng bổ sung S1. Dữ liệu được thu thập bằng hệ thống ABI Prism 7900HT FAST Real-Time PCR. Việc định lượng tương đối biểu hiện gen mục tiêu đã được chuẩn hóa bằng cách sử dụng phương pháp so sánh 2- ΔΔCt. Glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) được sử dụng làm chất kiểm soát nội bộ.

Thấm phương tây

tổng số mẫu protein được chiết xuất từ ​​các tế bào nuôi cấy vàquả thậnkhăn giấy. Nồng độ protein được xác định bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm protein BCA (Thermo Fisher Scientific). Các mẫu được tách trên gel natri dodecyl sulfat-polyacrylamide 10% và được chuyển lên màng polyvinylidene difluoride. Màng sau đó bị chặn qua đêm ở độ 4 với các kháng thể chính, cụ thể là chống TRPC6 (Santa Cruz, Hoa Kỳ), chống đau bụng -1 (Abcam, Vương quốc Anh), chống Talin -1 (Abcam) , chống nephrin (Santa Cruz), và chống calcineurin (Abcam). Sau khi rửa sạch, màng được ủ với IgG chống nhiễm khuẩn dê (H plus L; Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA). Màng cũng được xử lý để phát hiện GAPDH (Abcam) để tải đều. Các dải Te được nhận biết bởi kháng thể chính đã được hình dung, và mật độ quang học của các dải protein được phân tích bằng phần mềm TanonImage (Tanon, Trung Quốc).

Xác định Ca2 cộng với cytosolic trong tế bào podocytes nuôi cấy Tế bào podocyte MPC5 được gieo hạt và xử lý bằng tetrandrine, CsA và U73122 trong 48 giờ, 48 giờ và 10 phút, tương ứng. Tế bào nang sau đó được ủ với RPMI -1640 bổ sung 10μM Fluo -3 AM (Phòng thí nghiệm Dojindo) trong 30 phút trong bóng tối. Sau đó, chúng ngay lập tức được rửa bằng nước muối đệm phosphat, trong đó chúng được duy trì và kích thích ở bước sóng 488nm. Nồng độ tương đối của ion Ca2 cộng trong cytosolic được đánh giá bằng cách đo cường độ huỳnh quang sử dụng hệ thống hình ảnh đồng tiêu laser Zeiss (Zeiss, Hoa Kỳ).

Đo lường hoạt động calpain

Hoạt động của Calpain được xác định bằng Bộ công cụ xét nghiệm hoạt động của Calpain từ Abcam Inc., theo giao thức của nhà sản xuất. Phần nổi phía trên (150 uL) của podocytes hoặcquả thậncác mô được lấy trong dung dịch đệm thích hợp (145mmol / L Nacl, 1 0 0mmol / L Tris-HCL, pH7,3) và 0,15mLN-Succinyl-Leu-Tyr-AMC (500 umol / L). Sau 1- giờ ủ ở 37 độ trong bóng tối, các mẫu được đọc bằng cách sử dụng một máy đo flo được trang bị bộ lọc kích thích 360nm và bộ lọc phát xạ 440nm.

Mô hình chuột gây bệnh thận do Adriamycin (ADRN) Dựa trên ước lượng Fermi về kích thước mẫu [19] và sự khác biệt về protein niệu giữa nhóm đối chứng và nhóm mô hình trong các thí nghiệm sơ bộ của chúng tôi, tổng số chuột cần thiết trong nghiên cứu của chúng tôi đã được xác định. Tổng cộng 56 con chuột Sprague – Dawley đực khỏe mạnh, nặng khoảng 200g và tuổi khoảng 8 tuần (Viện TCM Chiết Giang), được chia ngẫu nhiên thành bảy nhóm (n =8 chuột / nhóm), cụ thể là nhóm ADR, ADR plus nhóm liều thấp tetrandrine (4mg / kg / ngày), ADR cộng với nhóm liều trung bình tetrandrine (8mg / kg / ngày), ADR cộng với nhóm liều cao tetrandrine (16mg / kg / ngày), ADR cộng với nhóm điều trị CsA (30mg / kg / ngày), ADR cộng với liều trung bình của tetrandrine (8mg / kg / ngày) kết hợp với nhóm CsA (30mg / kg / ngày) và nhóm NC. Chuột trong nhóm mô hình và nhóm điều trị bằng thuốc được gây mê bằng cách tiêm ketamine hydrochloride vào màng bụng (50mg / kg), và hai liều ADR (4mg / kg) được tiêm vào tĩnh mạch đuôi để phát triển mô hình chuột FSGS. Sau 12 tuần, mẫu nước tiểu của chuột được thu thập trong 24 giờ bằng cách sử dụng lồng trao đổi chất, tiếp theo là thu thập máu và thu hoạchthận. Hiệu quả lâm sàng đã được quan sát và những thay đổi trong 24- giờ protein nước tiểu, albumin huyết tương, creatinine huyết thanh (Scr) và nồng độ nitơ nước tiểu trong máu (BUN) được đo bằng bộ dụng cụ chẩn đoán có sẵn trên thị trường với máy phân tích hóa học tự động (HITACHI 7180 ).

Tất cả các quy trình thí nghiệm liên quan đến việc sử dụng động vật đã được phê duyệt bởi Ủy ban Đạo đức về Thí nghiệm Động vật tại Viện TCM Chiết Giang (Đường Tianmushan No.132) và được thực hiện nghiêm ngặt theo các nguyên tắc được nêu trong Hướng dẫn NIH về Chăm sóc và Sử dụng Động vật Phòng thí nghiệm .

Nhuộm mô học, kính hiển vi điện tử và phân tích

Con chuộtthậnđược cố định trong paraformaldehyde, khử nước bằng cách sử dụng một loạt etanol đã phân loại, và nhúng vào parafin. Các phần (dày 5- μm) được nhuộm bằng hematoxylin và eosin (H&E) và trichrome của Masson và được kiểm tra dưới kính hiển vi quang học. Thận được tưới máu và cố định bằng glutaraldehyde, sau đó được cắt thành các khối 1- mm3tissue để nhúng epoxy. Kính hiển vi điện tử được thực hiện bằng các quy trình tiêu chuẩn. Năm siêu vi ảnh được lấy ngẫu nhiên từ mỗi mẫu vật. Tốc độ hợp nhất của quy trình chân Podocyte (PFR) được tính bằng công thức sau: PFR (phần trăm)=∑LFP / ∑LBM × 100 phần trăm, trong đó ∑LFP là tổng chiều dài của quy trình chân hợp nhất và ∑LBM là tổng chiều dài của màng đáy mao mạch ngoại vi (BM).

Phân tích thống kê

Dữ liệu được biểu thị dưới dạng sai số trung bình ± tiêu chuẩn của phép đo và phân tích bằng SPSS 2 0. 0 (IBM Statistics SPSS, US) và GraphPad Prism 6 dành cho Windows (GraphPad Software Inc., USA). Phân phối chuẩn được đánh giá bằng đồ thị qq và kiểm định SW. Dữ liệu cho thấy một phân phối chuẩn. Khi hai nhóm dữ liệu được so sánh, thử nghiệm t mẫu độc lập được áp dụng. Sự khác biệt giữa ba hoặc nhiều nhóm độc lập được so sánh bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều, theo sau là bài kiểm tra sau hoc của Tukey. Ý nghĩa thống kê được đặt ở mức p<>

Kết quả

Lựa chọn nồng độ tối ưu và độc tính tế bào của tetrandrine, CsA và U73122

Thử nghiệm CCK {{0}} được sử dụng để phát hiện khả năng sống sót của tế bào. Như được thể hiện trong Hình 1a và b, nồng độ tối đa 1 0 μmol / L của tetrandrine và 0. 1μmol / L của CsA không ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của tế bào podocytes MPC5. Thử nghiệm giải phóng LDH xác nhận thêm rằng 10μmol / L tetrandrine và 0,1μmol / L CsA trong 48 giờ không có độc tính, trong khi 10μmol / LU73122 trong 10 phút cho thấy độc tính dự kiến ​​(Hình 1c). Do đó, các thí nghiệm tế bào tiếp theo đã sử dụng tetrandrine và CsA ở lần lượt là 10μmol / L và 0,1μmol / L.

Tetrandrine làm giảm lượng Ca2 nội bào cộng với dòng chảy trong các tế bào MPC5 được nuôi cấy biểu hiện quá mức TRPC6

Sử dụng chuyển nạp plasmid, một mô hình tế bào TRPC6 biểu hiện quá mức trong tế bào podocytes MPC5 đã được thiết lập thành công. qRT-PCR và phân tích Western blot đã chứng minh rằng mức độ biểu hiện của TRPC6 trong nhóm Over-TRP tăng đáng kể so với ở nhóm NC và Lv-NC (p<0.05; fig.="" 2a="" and="" b).="" and="" full-length="" gel="" and="" blot="" of="" trpc6="" were="" included="" in="" supplementary="" fig.="">

Hình ảnh huỳnh quang (Hình 2c) và phân tích bán định lượng (Hình 2d) chỉ ra rằng sự biểu hiện quá mức của TRPC6 tăng cường dòng Ca2 nội bào cộng với dòng chảy Ca2 nội bào, trong khi không có sự khác biệt rõ ràng giữa nhóm NC và Lv-NC. Mười tế bào nhóm OverTRP sau đó được điều trị bằng các loại thuốc thử nghiệm. Nhóm tiền xử lý thuốc Te (tetrandrine, CsA, và U73122) có tác dụng ức chế dòng chảy cộng thêm Ca2 nội bào (P<0.05), while="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" among="" the="" three="" groups="" of="">

Ảnh hưởng của tetrandrine đối với hoạt động và sự biểu hiện của calpain ‑ 1, calcineurin, Talin‑ 1 và nephrin trong tế bào MPC5

Nó đã được chứng minh rằng Ca2 cộng trong tế bào kích hoạt calpain, một protease cysteine ​​phụ thuộc Ca2 và calcineurin, một protein phosphatase phụ thuộc Ca2 / calmodulin. Phù hợp với các quan sát trước đó, hoạt động và mức độ biểu hiện của calpain và calcineurin trong nhóm Over TRP đều cao hơn so với nhóm NC và Lv-NC (p<0.05; fig.="" 3a-e,="" h="" and="" i).="" drop="" intervention="" in="" cultured="" trpc6-overexpressing="" podocytes="" established="" that="" tetrandrine="" inhibited="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" expression.="" te="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" mrna="" levels="" were="" significantly="" reduced="" in="" the="" tetrandrine-exposed="" group="" than="" in="" the="" csa="" intervention="" group=""><0.05; fig.="" 3a="" and="" d).="" western="" blotting="" results="" demonstrated="" a="" considerable="" decrease="" in="" calpain-1="" protein="" levels="" because="" of="" tetrandrine=""><0.05; fig.="" 3c="" and="" h).="" in="" addition,="" calcineurin="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05; fig.="" 3b)="" after="" tetrandrine="" exposure,="" but="" the="" mrna="" and="" protein="" expression="" levels="" of="" calcineurin="" remain="" unchanged="" (fig.="" 3e="" and="" i).="" treatment="" with="" csa="" did="" not="" block="" calpain="" activation="" (fig.="" 3a),="" and="" the="" effect="" was="" not="" as="" robust="" as="" that="" of="" tetrandrine="" in="" calpain-1="" mrna="" expression=""><0.05; fig.="" 3d).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 3b,="" e="" and="">

The podocyte cytoskeleton-associated anchoring protein Talin-1 and the slit diaphragm protein nephrin are two specific targets of calpain-1. When treated with tetrandrine, there was an increasing trend in mRNA and protein expression of Talin-1 (p >0. 05) và nephrin (p<0.05), compared="" with="" that="" in="" the="" overtrp="" group,="" but="" this="" finding="" was="" not="" statistically="" significant="" among="" the="" three="" treatment="" groups="" (p="">0. 05; Hình 3f, g, j và k).

Gel và blots có độ dài đầy đủ được bao gồm trong Hình bổ sung S1.

Thí nghiệm in vivo sử dụng mô hình ADRN trên chuột Để mô tả phản ứng đối với sự ức chế tín hiệu TRPC6 / calpain -1 qua trung gian tetrandrine, một mô hình ADRN đã được phát triển trên chuột. Các cấu hình biểu hiện mRNA và protein của TRPC6 đã tăng lên đáng kể ở nhóm ADRN so với ở nhóm chuột chow chow ăn bình thường (nhóm NC; p<0.05; fig.="" 4a="" and="" b).="" consistent="" with="" the="" above="" studies="" in="" cell-based="" models,="" the="" activity="" and="" expression="" levels="" of="" calpain="" and="" calcineurin="" increased="" remarkably="" in="" the="" adrn="" group=""><0.05; fig.="" 4c-g,="" j,="" and="" k)="" than="" in="" the="" nc="">

Điều trị bằng CsA không ngăn chặn sự hoạt hóa calpain do biểu hiện quá mức TRPC6 gây ra (Hình 4c), và tác dụng không mạnh bằng tetrandrine đối với biểu hiện protein -1 đau cal (p<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="" k).="" the="" tetrandrine="" group="" was="" down="" compared="" to="" the="" adr="" group="" (fig.="">

Điều trị bằng CsA không ngăn chặn sự hoạt hóa calpain do biểu hiện quá mức TRPC6 gây ra (Hình 4c) và tác dụng không mạnh bằng tetrandrine đối với biểu hiện protein calpain -1 (p<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="">

Hơn nữa, biểu thức của Talin -1 và nephrin đã được đánh giá (Hình 4h, i, l và m). Cả mức Talin -1 và nephrin đều giảm ở chuột ADRN so với ở nhóm NC (p<0.05). upon="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" mrna="" levels="" and="" protein="" expression="" of="" talin-1="" and="" nephrin="" were="" visibly="" increased.="" the="" high-dose="" group="" of="" tetrandrine="" recovered="" the="" expression="" of="" the="" two="" structural="" components,="" similar="" to="" the="" adr+csa="" group="" (p="">0.05).

Gel và blots có độ dài đầy đủ được bao gồm trong Hình bổ sung S2.

Tetrandrine ức chế sự tiến triển ADRN và giải cứu mô bệnh học Te tác dụng của tetrandrine lênquả thậnchức năng ở chuột Sprague-Dawley được điều trị bằng ADRN sau đó đã được đánh giá (Hình 5a-d). Không có sự khác biệt đáng kể ban đầu về mức protein niệu 24- giờ, Scr và BUN giữa các nhóm. Mười hai tuần sau, nồng độ protein niệu 24 giờ, Scr và BUN ở nhóm ADRN tăng lên có ý nghĩa thống kê, trong khi nồng độ albumin huyết tương giảm rõ rệt so với nhóm NC (P<0.05). after="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" levels="" of="" proteinuria,="" scr,="" and="" bun="" were="" markedly="" decreased,="" whereas="" the="" level="" of="" albumin="" was="" significantly="" improved="" compared="" to="" those="" in="" the="" adr="" group=""><0.05). among="" the="" three="" dose-response="" subgroups="" of="" tetrandrine,="" a="" significant="" difference="" was="" observed:="" the="" middle="" dose="" demonstrated="" considerably="" better="" efficacy="" than="" the="" other="" two="" doses=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" levels="" of="" serum="" alanine="" aminotransferase,="" before="" and="" after="" treatment="" among="" groups="" (p="">0. 05; dữ liệu không được hiển thị).

Những thay đổi về mô hình học được thể hiện trong Hình 6. Ở chuột ADRN, nhuộm H&E và Masson cho thấy FSGS, xơ hóa mô kẽ thận và thâm nhiễm tế bào viêm mô kẽ thận. Ngoài ra, hình ảnh kính hiển vi điện tử của các cầu thận cho thấy các quá trình chân podocyte có hiệu quả cao, béo lên và hợp nhất với 80-100% podocyte PFR. Chuột trong các phân nhóm tetrandrine (nhóm liều trung bình và liều cao) có ít tổn thương hơn so với nhóm ADR với các mức độ khác nhau, và sự cải thiện ở nhóm liều cao vượt trội hơn so với nhóm liều trung bình. Ở các nhóm được điều trị bằng tetrandrine liều thấp, trung bình và cao, PFR của tế bào podocyte lần lượt là 70 –80%, 50 –60% và 30 –40%. Những dữ liệu này cho thấy rằng tetrandrine bảo vệ chống lại sự phá hủy cấu trúc của cầu thận do sử dụng ADR. Không có sự khác biệt đáng kể về những thay đổi bệnh lý dưới kính hiển vi ánh sáng giữa các nhóm (tetrandrine liều cao, CsA và tetrandrine kết hợp với CsA). Ngoài ra, PFR podocyte ở nhóm ADRN được điều trị bằng CsA cũng giống như ở nhóm được điều trị bằng tetrandrine liều cao.

Thảo luận

Tế bào nang ngày càng trở nên quan trọng như một mục tiêu cho các can thiệp trong FSGS và các bệnh thận liên quan [20, 21]. Ở đây, dựa trên dữ liệu in vitro và in vivo,

đã chứng minh rằng tác dụng bảo vệ podocyte và chống protein niệu của tetrandrine, một chất chẹn kênh Ca2 cộng không chọn lọc, được trung gian thông qua việc ức chế dòng chảy Ca2 cộng trong tế bào và dòng chảy tín hiệu Ca2 cộng-phụ thuộc -1, bao gồm cả Talin -1 , nephrin và calcineurin. Tetrandrine có hiệu quả hơn trong việc cản trở sự ức chế calpain -1.

Theo những phát hiện trước đây, podocyte TRPC6 là kênh chủ yếu góp phần vào sự thay đổi dòng Ca2 cộng với dòng chảy trong điều kiện bình thường và bệnh lý [7, 22]. Người ta đã biết rộng rãi rằng hoạt động của calpain phụ thuộc vào mức canxi và có liên quan đếnquả thậnchấn thương, đặc biệt là tổn thương BM chống cầu thận [10, 23]. Trong số 15 đồng dạng calpain đã được xác định, calpain -1 gần đây đã được chứng minh là có liên kết hoạt động TRPC6 với tổn thương tế bào podocyte [24]. Calpain -1 được báo cáo là phân cắt protein neo liên kết với tế bào podocyte Talin -1 và protein màng ngăn khe, nephrin, làm rối loạn tính toàn vẹn của tế bào vỏ và gây ra protein niệu nghiêm trọng [8–12, 16]. Calcineurin là một phosphatase phụ thuộc cộng Ca2 trước đây đã được chứng minh là có vai trò trong tế bào podocytes vàquả thậnhàm số. Ngày càng có nhiều bằng chứng chỉ ra rằng calpain có thể phân cắt và kích hoạt calcineurin theo cách phân giải protein [25, 26]. Nghiên cứu này đã tạo ra các mô hình biểu hiện quá mức TRPC6 bằng cách nhiễm vi rút trong tế bào vỏ nuôi cấy và tiêm adriamycin ở chuột SD. Theo đó, chúng tôi đã chỉ ra rằng TRPC 6- qua trung gian dòng Ca2 plus đã kích hoạt hoạt động calpain và biểu thức calpain thành viên gia đình calpain -1. Calpain tăng lên -1 sau đó phân cắt Talin -1 và nephrin.

Tetrandrine là một alkaloid được chiết xuất từ ​​một cây thuốc cổ truyền của Trung Quốc và là một chất chẹn kênh Ca2 cộng không chọn lọc. Trong tài liệu này, người ta đã khẳng định lại rằng tetrandrine ức chế sự biểu hiện quá mức của TRPC6 và làm giảm dòng Ca2 plus ở cả tế bào và chuột biểu hiện quá mức TRPC6, như đã được ghi nhận trước đây [16]. Quan trọng hơn, nghiên cứu này tập trung vào tác động can thiệp của tetrandrine trên con đường tín hiệu xuôi dòng phụ thuộc canxi. Người ta quan sát thấy rằng, không giống như CsA, tetrandrine làm giảm hoạt động của protease trung tính (calpain) do canxi hoạt hóa. Hơn nữa, tetrandrine làm giảm sự biểu hiện của họ protease được canxi hoạt hóa, calpain -1, và khôi phục sự biểu hiện điều hòa của Talin -1 và nephrin. So với CsA, việc sử dụng tetrandrine thể hiện tác dụng vượt trội đối với việc bất hoạt calpain và sự biểu hiện điều hòa của calpain -1. Những kết quả này cho thấy rằng tetrandrine có tiềm năng điều trị trong tổn thương tế bào podocyte bằng cách ngăn chặn sự kích hoạt phụ thuộc TRPC 6- của con đường truyền tín hiệu calpain -1.

Phospholipase C (PLC) đã được xác định là đối tác liên kết TRPC 6- [27]. U73122 ức chế PLC để tạo ra ít diacylglycerol hơn và giảm độ mở kênh TRPC6 [18, 24]. Do đó, U73122 được sử dụng song song như một đối chứng tích cực và nó đã cho thấy một tác dụng đáng chú ý trong việc giảm dòng chảy cộng thêm Ca2 nội bào, ức chế hoạt động calpain và biểu hiện calpain -1 trong tế bào podocytes biểu hiện quá mức TRPC6. Tuy nhiên, các thử nghiệm độc tính tế bào in vitro cho thấy độc tính tế bào podocyte rõ ràng.

Trong nghiên cứu này, sau 12 tuần tiêm ADR, tình trạng protein niệu nghiêm trọng, giảm albumin máu, và tăng mức BUN và Scr được thấy rõ ở những con chuột được điều trị ADR --. Kính hiển vi ánh sáng cho thấy FSGS, xơ hóa mô kẽ thận, và thâm nhiễm tế bào viêm mô kẽ thận ở chuột ADRN. Kính hiển vi điện tử đã chứng minh hiệu quả lan rộng của các quá trình bàn chân. Dữ liệu in vivo đã chứng minh thêm rằng liệu pháp tetrandrine có thể làm giảm protein niệu, cải thiện chức năng thận và làm giảm sự tiến triển của bệnh xơ cứng cầu thận. Sau khi điều trị bằng tetrandrine, các thay đổi bệnh lý dưới kính hiển vi ánh sáng và kính hiển vi điện tử, 24- h protein niệu, albumin huyết tương, Scr và BUN ở chuột ADRN được cải thiện đáng kể so với nhóm NC.

Chất ức chế calcineurin, CsA, từ lâu đã được sử dụng để điều trị proteinuricquả thậncác bệnh [28]. Calcineurin quan trọng về mặt lâm sàng như một mục tiêu trực tiếp của thuốc ức chế miễn dịch CsA [17, 29]. CSA làm giảm sự biểu hiện của calcineurin và làm giảm yếu tố nhân trung gian calcineurin của các tế bào T đã hoạt hóa [30–32]. Các bằng chứng gần đây ủng hộ tác dụng ổn định của CsA trên bộ xương actin của tế bào podocyte, chẳng hạn như synaptopodin bằng cách ngăn chặn quá trình dephosphoryl hóa qua trung gian calcineurin của synaptopodin [17]. Nó cũng đã được chứng minh rằng calpain có thể phân cắt và kích hoạt calcineurin theo cách phân giải protein [25, 26]. Dữ liệu từ nghiên cứu này khẳng định lại rằng CsA ức chế hoạt động và biểu hiện của calcineurin mạnh hơn tetrandrine. Như đã báo cáo trước đây, CsA dường như không ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động của calpain.

Một hạn chế chính của nghiên cứu là không chứng minh được tác dụng phụ thuộc vào liều lượng giữa các nhóm nhỏ tetrandrine (nhóm liều thấp, liều trung bình và liều cao). Một lời giải thích khả dĩ có thể là phạm vi liều lượng chúng tôi sử dụng quá cao đối với chuột. Ngoài ra, sự khác biệt riêng lẻ trong thí nghiệm trên động vật có thể lớn hơn đáng kể so với sự khác biệt về liều lượng. Cỡ mẫu tương đối nhỏ có thể làm giảm sức mạnh thống kê. Do đó, cần có các nghiên cứu sâu hơn bao gồm liều lượng nhỏ hơn đáng kể và cỡ mẫu thích hợp để xác định chính xác phạm vi liều lượng và tác dụng của tetrandrine trên chuột ARDN.

Tóm lại, trong việc điều chỉnh các con đường truyền tín hiệu canxi, tetrandrine thể hiện tác dụng ức chế rõ ràng đối với calpain -1, trong khi CsA ảnh hưởng trực tiếp đến sự ức chế calcineurin. Những phát hiện này cho thấy rằng điều trị kết hợp tetrandrine và CsA có thể ảnh hưởng đến nhiều mục tiêu của mạng lưới tín hiệu canxi để cải thiện kết quả lâm sàng. Các nghiên cứu xác nhận là cần thiết để xác nhận những quan sát này cũng như làm sáng tỏ các cơ chế của tác dụng hiệp đồng.

Các từ viết tắt

FSGS: Xơ cứng cầu thận phân đoạn khu trú; MCD: Bệnh thay đổi tối thiểu; MN: Bệnh thận màng; ĐKD: Bệnh tiểu đườngquả thậndịch bệnh; TRPC6: Protein kênh cation điện thế thụ thể thoáng qua 6; Ca2 cộng: Canxi; TCM: Y học cổ truyền Trung Quốc; Tết: Tetrandrine; CsA: Cyclosporine A; Scr: Creatinin huyết thanh; BUN: Nitơ nước tiểu máu; PFR: Xử lý tốc độ nhiệt hạch; BM: Màng tầng hầm; ADRN: Bệnh thận do adriamycin; PLC: Phospholipase C.

Giới thiệunces

1. Garg P. Một đánh giá về sinh học podocyte. Là J Nephrol. 2018; 47 (Phần 1): 3–13.

2. Khalilpourfarshbaf M, Hajiaghaalipour F, Selvarajan KK, et al. Liệu pháp dựa trên tế bào gốc trung mô chống lại tổn thương tế bào podocyte trong bệnh thận do đái tháo đường. Mô Eng Regen Med. 2017; 14: 201–10.

3. Nagata M. Tổn thương Podocyte và hậu quả của nó. Thận Int. 2016; 89: 1221–30.

4. Pavenstädt H, Kriz W, Kretzler M. Sinh học tế bào của podocyte cầu thận. Physiol Rev. 2003; 83: 253–307.

5. Riehle M, Büscher AK, Gohlke BO, và cộng sự. TRPC6 G757D đột biến mất chức năng liên kết với FSGS. J Am Soc Nephrol. 2016; 27: 2771–83.

6. Ilatovskaya DV, Blass G, Palygin O, et al. Một con đường NOX4 / TRPC6 trong việc điều hòa canxi của tế bào podocyte và tổn thương thận trong bệnh thận do đái tháo đường. J Am Soc Nephrol. 2018; 29: 1917–27.

7. Reiser J, Polu KR, Möller CC, et al. TRPC6 là một kênh liên kết với cơ hoành khe cầu thận cần thiết cho chức năng thận bình thường. Nat Genet. 2005; 37: 739–44.

8. Huang H, You Y, Lin X, et al. Sự ức chế con đường tín hiệu TRPC6 làm giảm bớt tổn thương tế bào podocyte do TGF gây ra - 1. Sinh lý tế bào. 2017; 41: 163–72.

9. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M, et al. Protease Calpain phụ thuộc canxi -1 liên kết hoạt động của TRPC6 với tổn thương tế bào vỏ. J Am Soc Nephrol. 2018; 29: 2099–109.

10. Peltier J, Bellocq A, Perez J, và cộng sự. Kích hoạt và tiết calpain thúc đẩy tổn thương cầu thận trong viêm cầu thận thực nghiệm: bằng chứng từ chuột chuyển gen calpastatin. J Am Soc Nephrol. 2006; 17: 3415–23.

11. Tian X, Kim JJ, Monkley SM, et al. Talin1 liên kết với podocyte rất quan trọng để duy trì hàng rào lọc cầu thận. J Clin Điều tra. 2014; 124: 1098–113.

12. Jiang L, Ding J, Tsai H, et al. Biểu hiện quá mức kênh cation điện thế thụ thể 6 thoáng qua trong tế bào podocytes gây ra sự sắp xếp lại bộ xương tế bào thông qua sự gia tăng hoạt hóa Ca2 cộng và RhoA nội bào. Exp Biol Med (Maywood). 2011; 236: 184–93.

13. Liu X, Zhou QG, Zhu XC, et al. Sàng lọc các thành phần hoạt tính tiềm năng của Fangji Huangqi tang để điều trị hội chứng thận hư bằng cách sử dụng các chất chuyển hóa tích hợp dựa trên "mối tương quan giữa các cấu hình hóa học và trao đổi chất". Mặt trước Pharmacol. 2019; 10: 1261.

14. Liu KC, Lin YJ, Hsiao YT, et al. Tetrandrine gây ra apoptosis ở các tế bào ung thư biểu mô vòm họng NPC-TW 039 ở người bằng cách căng thẳng lưới nội chất và các con đường Ca2 cộng / Calpain. Chống ung thư Res. 2017; 37: 6107–18.

15. Wang YJ, He LQ, Sun W, et al. Dự án tối ưu hóa y học cổ truyền Trung Quốc trong điều trị bệnh thận mãn tính giai đoạn 3: một thử nghiệm đối chứng ngẫu nhiên mù đôi đa trung tâm. J Ethnopharmacol. 2012; 139: 757–64.

16. Yu J, Zhu C, Yin J, et al. Tetrandrine ngăn chặn tiềm năng thụ thể thoáng qua Cation Protein kênh 6 gây ra tổn thương podocyte do biểu hiện quá mức thông qua sự ngăn chặn tín hiệu RhoA / ROCK1. Thuốc Des Devel Ther. Năm 2020; 14: 361–70.