Tác động của Nephrotoxin Ochratoxin A lên các tế bào thận của con người được nghiên cứu bởi một mô hình đồng văn hóa mới lạ bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện của nguyên bào sợi

edmund.chen@wecistanche.com

Trừu tượng:Cácquả thậnđang bị đe dọa bởi rất nhiều chất độc hại tiềm ẩn. Để nghiên cứu ảnh hưởng của nephrotoxin ochratoxin A (OTA), chúng tôi đã thiết lập một mô hình đồng nuôi cấy tế bào bao gồm ngườithận tế bào ống lượn gần và nguyên bào sợi. Chúng tôi đã nghiên cứu tác động của OTA đối với sự tồn tại của tế bào, sự biểu hiện của các gen và / hoặc protein liên quan đến sự chết của tế bào, chất nền ngoại bào và cân bằng nội môi năng lượng. Hoại tử do OTA gây ra đã được tăng cường ở cả hai loại tế bào khi có sự hiện diện của loại tế bào khác tương ứng, trong khi quá trình chết rụng do OTA gây ra là độc lập từ đó. Trong nguyên bào sợi, nhưng không phải trong tế bào ống, hiệu ứng đồng nuôi cấy có thể nhìn thấy liên quan đến sự biểu hiện của protein p21 liên quan đến chu kỳ tế bào. Sự biểu hiện của vimentin protein chỉ thị chuyển tiếp từ biểu mô sang trung mô độc lập với điều kiện nuôi cấy. Sự biểu hiện của lncRNA WISP 1- AS1 do OTA gây ra đã được tăng cường trong đồng nuôi cấy. Tiếp xúc với OTA dẫn đến những thay đổi trong biểu hiện của các gen liên quan đến chuyển hóa năng lượng với tác dụng huy động glucose và giảm biểu hiện của protein ty thể. Chúng tôi cùng nhau chứng minh rằng phản ứng của các tế bào có thể khác nhau khi có sự hiện diện của các tế bào tự nhiên ở gần nhau, do đó tạo điều kiện cho tế bào nói chuyện chéo. Do đó, để đánh giá độc tính của một chất, sẽ là một lợi thế nếu xem xét việc sử dụng các chất đồng nuôi cấy thay vì các chất nuôi cấy đơn chất.

Từ khóa:ochratoxin A; nuôi cấy tế bào; sự chuyển hoá năng lượng; sự cân bằng apoptosis-hoại tử; ti thể; quả thận; thận

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN KIDNEY / RENAL THẤT BẠI

Giới thiệu

Do chức năng bài tiết của nó,quả thậnbị đe dọa bởi một loạt các quan điểm phụ có hại như ma túy hoặc chất gây ô nhiễm thực phẩm, như độc tố nấm mốc dẫn đến cấp tính hoặc thậm chí tồi tệ hơn - mãn tínhbệnh thậnvới tỷ lệ khoảng 10 phần trăm [1,2]. Để hiểu cơ chế của hành động gây độc cho thận, rất hữu ích khi tìm ra các chiến lược để giảm bớt những tình huống bất lợi này và nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để giải quyết câu hỏi tại sao và làm thế nàothậnđang có nguy cơ tuyệt chủng [3–5]. Để nghiên cứu dòng chảy của một chất trên một sinh vật, thường rất khó sử dụng động vật nguyên con vì các vấn đề liên quan đến đạo đức và các điều kiện tiên quyết về tổ chức, tốn kém và phức tạp. Hơn nữa, việc chuyển giao kiến ​​thức sang tình huống con người có liên quan đến những điều không chắc chắn. Do đó, các mô hình nuôi cấy tế bào đã được thiết lập và được sử dụng rộng rãi, và có ưu điểm là loại tế bào đặc biệt và phản ứng của nó với một chất hoặc phương pháp điều trị có thể được nghiên cứu trong các điều kiện được kiểm soát. Mặc dù nhiều phát hiện quan trọng đã được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp này, nhưng vẫn có một số nhược điểm cố hữu: các tế bào của một dòng tế bào thường bị bất tử bằng cách gây đột biến hoặc các phương pháp khác - đôi khi quyết liệt - [6]. Điều này cho phép dễ dàng xử lý và sử dụng lâu dài nhưng với nguy cơ gây ra trong một hệ thống mô hình cụ thể có thể không được chuyển giao cho tình huống của toàn bộ cơ quan hoặc sinh vật. Do nhược điểm này, thay vì sử dụng các dòng tế bào bất tử, các tế bào sơ cấp có thể được sử dụng, nhưng việc tạo ra các tế bào sơ cấp thường rất khác nhau và đòi hỏi các kỹ năng kỹ thuật tiên tiến. Ngoài ra, các tế bào sơ cấp thường không tồn tại trong một thời gian dài và cần các điều kiện nuôi cấy cá thể đặc biệt. Nhưng các tế bào sơ cấp tiến gần hơn một bước với điều kiện tự nhiên và ít nhất đôi khi hóa ra chúng nhạy cảm hơn với các kích thích độc hại như các dòng tế bào [7], nghĩa là các dòng tế bào có thể mạnh mẽ hơn. Một bất lợi khác là thực tế là các tế bào thường được nuôi trong môi trường độc canh, tức là, không có dòng chảy của các loại tế bào khác, mà trong cơ quan nội tạng của chúng thường ở gần nhau. Do đó, có thể là một bước tiến tới một tình huống thực tế hơn để nghiên cứu phản ứng của một loại tế bào đối với một chất hoặc phương pháp điều trị khi có sự hiện diện của các tế bào đó, những tế bào này ở gần cơ quan bản địa.

bên trongquả thận, các tế bào ống lượn gần được bao quanh bởi các nguyên bào sợi và ảnh hưởng - có thể là lẫn nhau - có thể được giả định. Đây cũng là trường hợp tronglàm hỏng thậncác tình huống mà trong hầu hết các trường hợp dẫn đến viêm và xơ hóa mô kẽ ống tuỷ [8,9], và có tính chất quyết định đối với sự suy giảm củaquả thậnhàm số. Do khả năng vận chuyển và enzym của chúng,thậntế bào ống lượn gần bị đe dọa bởi nhiều chất độc hại tiềm ẩn như ma túy, tàn dư của chúng hoặc độc tố nấm mốc. Một vai trò của các nguyên bào sợi xung quanh là cung cấp chất nền ngoại bào bằng cách giải phóng collagens và các thành phần chất nền khác và do đó tham gia vào sự toàn vẹn của mô [10]. Nhưng chúng cũng - cùng với các tế bào biểu mô - tham gia vào các quá trình viêm hoặc trong sợibệnh thận[11] với nguy cơ phát triểnsuy thận. 

Một loại độc tố nấm mốc được nghiên cứu kỹ lưỡng có liên quan đến sức khỏe con người là ochratoxin A (OTA) [12,13]. Nó có thể được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm khác nhau [12,14] và để tránh tiếp xúc và hấp thụ nó là hầu như không thể [9,15]. Điều này dẫn đến quan sát rằng OTA được phát hiện thường xuyên trong máu người ở nồng độ nano nano thấp [16]. Ở động vật tiếp xúc, OTA dẫn đếnsuy thậnvà thay đổi sợi xơ [17,18]. Phơi nhiễm OTA được cho là có liên quan đến con ngườibệnh thận[19]. Trong các tế bào ống lượn gần chính của người, tác dụng gây độc của OTA đã được chứng minh, điều này cũng có thể quan sát thấy ở các nguyên bào sợi sơ cấp của người, mặc dù nó không nổi bật như ở các tế bào ống lượn gần [7]. Các cơ chế đằng sau tác động độc hại của OTA vẫn chưa được hiểu hoàn toàn và là chủ đề của nhiều nghiên cứu đang diễn ra. Các tế bào lân cận với các chức năng khác nhau can thiệp đến mức nào và do đó điều chỉnh chức năng của tế bào hầu như không được biết nhưng có thể mong đợi. Trong một nghiên cứu trước đây sử dụng mô hình đồng nuôi cấy bao gồm chuộtquả thậntế bào ống gần và nguyên bào sợi, hóa ra là một loại nhiễu xuyên âm giữa cả hai loại tế bào diễn ra, dẫn đến nhận xét rằng tác động của OTA như chuyển tiếp biểu mô sang trung mô (EMT) chỉ xảy ra trong điều kiện đồng nuôi cấy [20]. Một kết luận khác có thể rút ra từ nghiên cứu đó và những nghiên cứu khác là tế bào chuột mạnh hơn về khả năng chống chịu với OTA so với tế bào ống lượn gần của người [7,20] và do đó cần phải có một hệ thống mô hình dựa trên tế bào người để đánh giá kỹ hơn tình trạng của con người và nguy cơ phơi nhiễm OTA.

Do đó, trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi thiết lập một mô hình đồng nuôi cấy tế bào tiên tiến bao gồm tế bào ống lượn gần của người (tế bào HK2) và nguyên bào sợi của người (tế bào CCD -1092 SK) để nghiên cứu ảnh hưởng của OTA đối với sự tồn tại của tế bào (quá trình chết rụng , hoại tử) và biểu hiện của một số gen được chọn mẫu liên quan đến chu kỳ tế bào, chết tế bào, chất nền ngoại bào và sự trao đổi chất. Tương tự như các nghiên cứu trước đây sử dụng tế bào chuột [20], các tế bào ống lượn gần của con người được đặt trên các thiết bị lọc và các bộ lọc được đặt bên trên một lớp nguyên bào sợi được gieo hạt ở đáy đĩa petri sao cho mặt đáy của tế bào biểu mô hướng về phía các nguyên bào sợi, cho phép một kiểu hội thoại giữa cả hai loại tế bào.

Kết quả

Hoạt động giải phóng và phân hủy protein, lactate Dehydrogenase -3Để có ấn tượng đầu tiên về các tác động có thể có của bản thân các điều kiện nuôi cấy cũng như về các tác động đối với các thay đổi do OTA gây ra, chúng tôi đã so sánh hoạt động của caspase -3 như một thước đo cho quá trình chết rụng của các tế bào được nuôi cấy đơn với hoạt động của các tế bào được nuôi cấy trong đồng - nuôi cấy được ủ có hoặc không có 100 nM OTA trong hai thời điểm, 24 và 48 giờ. Ngoài ra, việc giải phóng lactate dehydrogenase (LDH) được xác định như một biện pháp cho sự hoại tử cũng như hàm lượng protein để tạo ấn tượng tổng thể về tình trạng tế bào. Do đó, một lượng tế bào bằng nhau được đặt vào đáy giếng (nguyên bào sợi) hoặc trên một ống năm mươi (tế bào ống lượn gần). Sau khi đạt đến hợp lưu, năm mươi phân tử được đặt vào các giếng nơi chứa các nguyên bào sợi (xem phần tóm tắt đồ họa). Như thể hiện trong Hình 1A, hầu như không có tác động phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy lên hàm lượng protein có thể được quan sát thấy ở cả hai loại tế bào sau 24 hoặc 48 giờ (xem thêm Tệp bổ sung S1). Trong nguyên bào sợi, việc tiếp xúc với OTA dẫn đến sự gia tăng nhỏ hàm lượng protein trong khi ở tế bào hình ống, OTA dẫn đến sự giảm nhẹ hàm lượng protein cho thấy OTA có thể có tác động tiêu cực đến tế bào hình ống. Những tác động này hầu như không phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy ở cả hai loại tế bào

Hình 1. Ảnh hưởng của ochratoxin A (OTA) và / hoặc điều kiện nuôi cấy lên hàm lượng protein (A), hoạt tính -3 của caspase (B) và giải phóng lactate dehydrogensase (LDH) (C). Tế bào được nuôi cấy trong môi trường đơn hoặc đồng nuôi cấy và tiếp xúc với 1 0 0 nM OTA trong 24 hoặc 48 giờ. N=3 - 6, n=14 - 18 (protein, LDH) hoặc 8–9 (caspase -3). * chỉ ra ap <0,05 đối="" với="" các="" tế="" bào="" không="" tiếp="" xúc="" với="" ota="" (so="" sánh="" các="" hiệu="" ứng="" ota,="" tương="" ứng="" với="" bên="" trái)="" hoặc="" với="" các="" tế="" bào="" trong="" nuôi="" cấy="" đơn="" (so="" sánh="" các="" hiệu="" ứng="" nuôi="" cấy,="" tương="" ứng="" với="" bên="" phải).="" để="" giải="" thích="" rõ="" hơn="" về="" ảnh="" hưởng="" đến="" hàm="" lượng="" protein,="" chúng="" tôi="" đã="" nghiên="" cứu="" quá="" trình="" apoptosis="" và="" hoại="" tử.="" so="" với="" nguyên="" bào="" sợi,="" ota="" có="" tác="" dụng="" rõ="" ràng="" đối="" với="" quá="" trình="" apoptosis="" ở="" tế="" bào="" ống="" sau="" 24="" giờ="" tiếp="" xúc="" với="" mức="" tăng="" hoạt="" động="" khoảng="" 2.="" 5-="" lần="" (hình="" 1b).="" sau="" 48="" giờ="" tiếp="" xúc,="" sự="" gia="" tăng="" vẫn="" có="" thể="" quan="" sát="" được="" nhưng="" không="" đặc="" biệt="" như="" sau="" 24="" giờ.="" tuy="" nhiên,="" những="" sự="" gia="" tăng="" này="" hầu="" như="" không="" phụ="" thuộc="" vào="" các="" điều="" kiện="" nuôi="" cấy="" ngoại="" trừ="" rằng="" sau="" 48="" giờ="" với="" sự="" hiện="" diện="" của="" nguyên="" bào="" sợi,="" hoạt="" động="" của="" caspase="" trong="" tế="" bào="" ống="" giảm="" nhẹ,="" cho="" thấy="" tác="" dụng="" bảo="" vệ="" khiêm="" tốn="" của="" đồng="" nuôi="" cấy.="" tuy="" nhiên,="" tác="" dụng="" bảo="" vệ="" của="" đồng="" nuôi="" cấy="" có="" thể="" quan="" sát="" được="" đối="" với="" các="" nguyên="" bào="" sợi,="" đặc="" biệt="" là="" khi="" có="" ota.="" trong="" đồng="" nuôi="" cấy,="" sự="" phóng="" thích="" ldh="" được="" tăng="" cường="" rõ="" ràng="" trong="" nguyên="" bào="" sợi="" và="" tế="" bào="" ống="" khi="" so="" sánh="" với="" điều="" kiện="" nuôi="" cấy="" đơn="" độc="" lập="" với="" sự="" hiện="" diện="" của="" ota="" (hình="" 1c).="" trong="" tế="" bào="" ống,="" ota="" dẫn="" đến="" sự="" gia="" tăng="" ldh="" được="" giải="" phóng="" vào="" môi="" trường,="" đặc="" biệt="" là="" sau="" khi="" tiếp="" xúc="" 48="" giờ,="" điều="" này="" không="" rõ="" rệt="" ở="" nguyên="" bào="" sợi.="" tổng="" hợp="" lại,="" sự="" hiện="" diện="" của="" loại="" tế="" bào="" khác="" tương="" ứng="" dẫn="" đến="" hoại="" tử="" tăng="" cường="" nhưng="" ít="" chết="" rụng="" hơn="" do="" đó="" hàm="" lượng="" protein="" tổng="" thể="" không="" bị="" thay="" đổi="" đáng="" kể.="" tác="" động="" của="" ota="" đối="" với="" quá="" trình="" chết="" và="" hoại="" tử="" cũng="" hầu="" như="" không="" phụ="" thuộc="" vào="" sự="" hiện="" diện="" hay="" vắng="" mặt="" của="" loại="" tế="" bào="">

Western Blot và mRNA Expression

CDKN1A / p21Chu kỳ tế bào được chứng minh là chịu ảnh hưởng của OTA và có thể cho thấy rằng protein p21 tham gia vào chu kỳ tế bào đã được điều chỉnh bởi OTA trong tế bào ống [21]. Để điều tra mức độ ảnh hưởng của protein, cũng như sự biểu hiện của mRNA mã hóa p21 bởi sự hiện diện của nguyên bào sợi, chúng tôi đã thực hiện Western blots và RT-PCR. Như thể hiện trong Hình 2A, B và 3, 48 giờ tiếp xúc với 100 nM OTA dẫn đến sự gia tăng lượng protein p21 trong đơn chất nhưng cũng trong các điều kiện đồng nuôi cấy trong tế bào ống. Trong nguyên bào sợi ở điều kiện đồng nuôi cấy s, OTA không ảnh hưởng đến sự biểu hiện của protein p 21- bởi vì sự biểu hiện mRNA được tăng lên bởi OTA độc lập với sự hiện diện của loại tế bào khác. Điều thú vị là trong điều kiện đồng nuôi cấy, việc tiếp xúc với OTA không làm tăng thêm sự biểu hiện của protein p21. Trong tế bào hình ống, sự biểu hiện của chúngRNA không bị thay đổi theo tần số của nguyên bào sợi nhưng trong nguyên bào sợi trong đồng nuôi cấy, pZlmRNA biểu hiện không chỉ được tiếp xúc với OTA mà còn ở các tế bào không tiếp xúc với OTA (xem thêm Tệp bổ sung S1). Điều này cho thấy rằng p của loại tế bào khác có ảnh hưởng đến sự biểu hiện của protein p21, đặc biệt là trong nguyên bào sợi.

Cyclooxygenase 2 (COX2)Nó đã được chứng minh rằng protein cyclooxygenase 2 (COX2) cũng như mức mRNA được tăng lên trong quá trìnhsuy thận[22]. Như được thể hiện trong Hình 2C, D và 3, chỉ trong nguyên bào sợi, sự biểu hiện protein được tăng lên khi tiếp xúc với OTA. Ngoài ra, với sự hiện diện của các tế bào ống, sự biểu hiện của protein COX2 được tăng cường ở những tế bào không được điều trị cũng như ở những tế bào tiếp xúc với OTA, chứng tỏ sự thâm nhập rõ ràng của các tế bào ống. Tuy nhiên, biểu hiện mRNA không bị OTA xâm nhập và ảnh hưởng rất nhẹ của việc đồng nuôi cấy xảy ra khi tiếp xúc với OTA. Ngược lại, trong tế bào ống, mRNA và protein biểu hiện COX2 hoàn toàn độc lập với OTA hoặc sự hiện diện của nguyên bào sợi. Điều đó cho thấy liên quan đến COX2 tế bào ống có thể xâm nhập vào nguyên bào sợi nhưng nguyên bào sợi không có dòng chảy vào tế bào ống.

FibronectinSuy thậnthường kèm theo xơ hóa. Trong quá trình xơ hóa, sự tích tụ chất nền ngoại bào diễn ra và một quan sát bên cạnh đó là sự gia tăng lượng protein fibronectin [23]. Do đó, sự thay đổi phụ thuộc OTA của mRNA mã hóa fibrone và biểu hiện protein được xác định trong điều kiện nuôi cấy đơn hoặc đồng. Như thể hiện trong Hình 3 và 4A, B, 48 giờ tiếp xúc của tế bào ống với 100 nM OTA dẫn đến giảm fifibronectin nội bào cả trong nuôi cấy đơn và đồng nuôi cấy. Hiệu ứng OTA thấp hơn trong đồng nuôi cấy. Hơn nữa, số lượng mRNA mã hóa cho fifibronectin bị giảm do tiếp xúc OTA độc lập với các điều kiện nuôi cấy và sự hiện diện của nguyên bào sợi dẫn đến sự biểu hiện mRNA thấp hơn trong các tế bào kiểm soát và tiếp xúc với OTA. Ngược lại, trong các nguyên bào sợi, sự biểu hiện fifibronectin hầu như không bị thay đổi bởi OTA cũng như điều kiện nuôi cấy vì có sự khác biệt lớn, đặc biệt là ở các khối Western. Có thể thấy rõ xu hướng biểu hiện do OTA gây ra trong nuôi cấy đơn tính.

VimentinVimentin là một loại protein có sự phong phú tăng lên khi quá trình chuyển đổi biểu mô sang trung mô (EMT) diễn ra và sự phát triển EMT có thể dẫn đếnsuy thận[23]. Do đó, sự thay đổi phụ thuộc OTA của mRNA vimentin và biểu hiện protein được xác định trong điều kiện nuôi cấy đơn và đồng. Như thể hiện trong Hình 3 và 4C, D, 48 giờ tế bào ống tiếp xúc với 100 nM OTA dẫn đến lượng protein vimentin ít hơn cả trong điều kiện nuôi cấy đơn và đồng. Tuy nhiên, với sự hiện diện của các nguyên bào sợi, sự biểu hiện protein vimentin độc lập với các điều kiện nuôi cấy. Sự biểu hiện của mRNA mã hóa vimentin hầu như không bị thay đổi bởi OTA cũng như các điều kiện nuôi cấy, ngoại trừ việc tiếp xúc với OTA trong đồng nuôi cấy có tăng nhẹ. Trong nguyên bào sợi, sự biểu hiện protein vimentin hoàn toàn độc lập với sự tiếp xúc với OTA cũng như sự hiện diện của các tế bào ống. Ngoài ra, biểu hiện mRNA mã hóa vimentin hầu như không bị thay đổi

Biểu hiện của một số gen đã chọnĐể kiểm tra thêm một cách mẫu mực về mức độ ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy cũng như sự biểu hiện của các RNA khác, chúng tôi đã chọn một số gen, có vai trò trong quá trình chết-hoại tử, phát triển ung thư hoặc chuyển hóa năng lượng (xem thêm Tệp bổ sung S1).

WISP 1- AS1là một RNA dài không mã hóa (lncRNA) được tạo ra bởi OTA ảnh hưởng đến điều hòa phiên mã và đóng một vai trò trong sự cân bằng apoptosis-hoại tử và có thể trong quá trình phát triển ung thư [24]. Như được thấy trong Hình 5A, 48 giờ tiếp xúc với 100 nM OTA dẫn đến sự gia tăng rõ rệt trong biểu hiện của lncRNA đó. Nếu không có OTA, sự hiện diện của loại tế bào tương ứng khác hầu như không có dòng chảy trên biểu thức. Tuy nhiên, với sự hiện diện của OTA, sự biểu hiện của nó trong đồng nuôi cấy cao hơn so với nuôi cấy đơn tính.

GDF15Yếu tố khác biệt tăng trưởng 15 (GDF15) là một thành viên của siêu họ yếu tố tăng trưởng biến đổi phản ứng với căng thẳng. Nó được thảo luận như một dấu ấn sinh học cũng chobệnh thậnhoặc như một yếu tố dự báo cho sự tồn tại củaquả thậnbệnh nhân ghép [25,26]. Sự biểu hiện của mã hóa mRNA cho GDF15 được tăng cường ở cả hai loại tế bào sau khi tiếp xúc với OTA như thể hiện trong Hình 5B. Hiệu ứng gây ra bởi OTA này được ưu tiên trong các nguyên bào sợi khi các tế bào ống ở gần đó. Tuy nhiên, trong các tế bào hình ống, sự biểu hiện độc lập với sự hiện diện của nguyên bào sợi (Hình 5B).CDK2Kinase 2 phụ thuộc Cyclin (CDK2) được xác định bằng phân tích mạng lưới tương quan có trọng số như một chất điều hòa chính của rối loạn điều hòa chu kỳ tế bào do OTA gây ra [21]. Trong nguyên bào sợi trong nuôi cấy đơn, sự biểu hiện của mRNA mã hóa CDK2 không bị thay đổi bởi OTA. Hơn nữa, sự hiện diện của các tế bào ống không ảnh hưởng đến sự biểu hiện mRNA. Tuy nhiên, trong các tế bào hình ống, OTA dẫn đến một biểu hiện tăng cường một chút chỉ khi có mặt các nguyên bào sợi (Hình 5C).

Protein liên quan đến Glycogen và Glucose: PYGM, GYS1 và GLUT1 (SLC2A1)Cácquả thậncũng tham gia vào quá trình cân bằng nội môi glucose và có thể cung cấp glucose cho cơ thể bằng cách tạo gluconeogenesis hoặc bằng cách huy động các nguồn dự trữ glycogen [27]. Glycogen phosphorylase (PYGM) đóng vai trò phân hủy các dự trữ glycogen, do đó huy động glucose [28]. Như đã thấy trong Hình 6A, 48 giờ tiếp xúc với 100 nM OTA dẫn đến sự gia tăng rõ rệt trong biểu hiện của mRNA mã hóa cho glycogen phosphorylase, đặc biệt là trong các tế bào ống. Tuy nhiên, ở tế bào ống, sự gia tăng này không phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy trong khi ở nguyên bào sợi, sự biểu hiện do OTA gây ra cao hơn khi có tế bào ống so với điều kiện không có tế bào ống, Glycogen synthase 1 (G ^ YSl) xúc tác phản ứng ngược lại. và trong khi sự biểu hiện của men phosphorylase được điều hòa, thì sự biểu hiện của enzym tổng hợp lại bị điều chỉnh bởi OTA trong các tế bào ống và trong các nguyên bào sợi trong cotilture (Hình 6B). Điều này cho thấy tác dụng huy động glucose củaOTA, Điều thú vị là, mRNAexpressionof theglucose vận chuyểnGLUTl (SLC2A1) cũng được điều chỉnh bởi OTA (Hình 6C), nhấn mạnh ý tưởng về nhu cầu glucose tăng cường do sự tiếp xúc vớiOTA có thể do

Protein liên quan đến ty thể: NDUFB10 và MRPS16

Có những dấu hiệu cho thấy việc tiếp xúc với OTA có thể dẫn đến giảm tiềm năng của ty thể trongquả thậntế bào [24] cho thấy rằng chức năng ti thể có thể bị ảnh hưởng bởi sự tiếp xúc với OTA, có thể bị ảnh hưởng thêm bởi sự hiện diện của nguyên bào sợi. Do đó, đại diện cho các RNA khác mã hóa protein ty thể, chúng tôi trình bày ở đây sự biểu hiện của các mRNA mã hóa cho NDUFB1 0 và MRPS16. NDUFBt0 mã hóa NADH của ty thể: tiểu đơn vị ubiquinone oxidoreductase B10, là một phần của phức hợp hô hấp ty thể I và được biểu hiện nhiều ở tim vàquả thận(Gen NCBI. Có sẵn trực tuyến: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4716 (truy cập ngày 17 tháng 3 năm 2021)). Gen MRPS16 mã hóa cho protein S16 của ribosom trong ty thể, có vai trò trong quá trình tổng hợp protein của ty thể. Như thể hiện trong Hình 7, phơi nhiễm OTA trong 24 giờ dẫn đến sự giảm biểu hiện của cả hai mRNA. Trong các tế bào hình ống, sự giảm biểu hiện của gen NDUFB10 không bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện của các nguyên bào sợi, trong khi ở các nguyên bào sợi, sự giảm biểu hiện NDUFB10 do OTA gây ra được giải quyết một chút khi có sự hiện diện của các tế bào hình ống (Hình 7A). Trong tế bào hình ống, sự biểu hiện của gen mã hóa cho tiểu đơn vị ribosome của ty thể bằng OTA cũng thấp hơn khi có sự hiện diện của nguyên bào sợi, trong khi ở nguyên bào sợi, sự hiện diện của tế bào hình ống dẫn đến sự biểu hiện mRNA MRPS16 cao hơn một chút (Hình 7B). Điều này cho thấy rằng chức năng của ty thể có thể bị ảnh hưởng bởi OTA nhưng hiệu ứng OTA có thể được sửa đổi bổ sung khi hai loại tế bào gần nhau.

Thảo luận

Cácquả thậncó nguy cơ tuyệt chủng bởi nhiều chất độc cho thận với nguy cơ cấp tính hoặc chronitsuy thận[1]. Để nghiên cứu tác động của các chất gây độc cho thận đối với các loại tế bào khác nhau và để giảm việc xử lý động vật, nuôi cấy tế bào đã được áp dụng rộng rãi. Các phương pháp nuôi cấy tế bào này có thêm ưu điểm là có thể kiểm soát được các điều kiện thí nghiệm và các tác động cụ thể của một chất được khảo sát bằng cách sử dụng một loại tế bào xác định. Bên cạnh những ưu điểm không thể tranh cãi này, vẫn còn một số cân nhắc: ví dụ, trong "cơ quan nội tạng", một loại tế bào (ví dụ, tế bào ống lượn gần trongquả thận) được bao quanh bởi các loại tế bào khác (ví dụ: nguyên bào sợi) với sự phụ thuộc lẫn nhau đa tạp. Do đó, phản ứng đối với một chất được quan sát khi chỉ sử dụng một loại tế bào có thể không giống với sự hiện diện của các tế bào gần nhau trong mô ban đầu. Trong một mô hình bao gồm hai loại tế bào thận chuột khác nhau, người ta đã chỉ ra rằng tồn tại sự trao đổi chéo giữa các tế bào ống và nguyên bào sợi, dẫn đến các phản ứng chỉ xuất hiện khi hai loại tế bào ở gần nhau [20]. Tuy nhiên, khi so sánh kết quả của sự bất thường đó với những phát hiện được quan sát bằng cách sử dụng tế bào ống thận của con người, người ta thấy rằng tế bào chuột rõ ràng là mạnh mẽ hơn so với con người nói về phản ứng của chúng với việc điều trị bằng độc tố nephrotoxin phổ biến, ochrafoxin A (OTA) [7]. Vì vậy, một mô hình đồng nuôi cấy bao gồm các tế bào người là cần thiết. Chúng tôi đã thiết lập một mô hình như vậy bằng cách sử dụng dòng tế bào ống lượn gần HK2 của người và các nguyên bào sợi của người. Tế bào HK2 phát triển trên các miếng chèn của bộ lọc và được kết hợp với các nguyên bào sợi, được phát triển ở đáy của một đĩa giếng 6-. Sau khi ghi lại các thông số cơ bản như quá trình chết rụng và hoại tử, chúng tôi sử dụng mô hình này để thu thập dữ liệu ban đầu về tác động của ochratoxin A đối với sự tiêu hóa của một số protein và RNA liên quan đến chu kỳ tế bào, EMT và chuyển hóa tế bào.

Tế bào sống sót  Dựa trên hàm lượng protein, có vẻ như cả OTA và điều kiện nuôi cấy đều không có tác dụng đáng chú ý. Tuy nhiên, mối quan hệ giữa apoptosis và hoại tử đã được chuyển sang hoại tử ở cả hai loại tế bào khi các tế bào được nuôi cấy cùng nhau. OTA được biết là gây ra quá trình apoptosis trong tế bào ống [29] và kéo dài ít hơn cũng trong nguyên bào sợi [7]. Điều này cũng được phản ánh trong các kết quả hiện tại. Điều thú vị là sự hiện diện của loại tế bào khác tương ứng dẫn đến giảm tỷ lệ apoptosis ở cả hai loại tế bào nhưng lại tăng cường giải phóng LDH. Đây là một gợi ý đầu tiên rằng sự hiện diện của một loại tế bào khác có thể ảnh hưởng đến chức năng tế bào và phản ứng của tế bào với một chất độc hại có thể khác trong đồng nuôi cấy so với nuôi cấy đơn.

Sự biểu hiện của protein và RNA Chúng tôi đã mở rộng nghiên cứu của mình bằng cách xác định sự biểu hiện của protein và RNA của một số protein được lựa chọn điển hình và các RNA mã hóa cho chúng. Khi OTA được chứng minh là có ảnh hưởng đến chu kỳ tế bào [21,30], sự biểu hiện của CDKN1A / p21 đã được nghiên cứu. Theo kết quả nghiên cứu của Dubourg et.al [21], OTA dẫn đến sự biểu hiện tăng cường không chỉ của mRNA CDKN1A mà còn của protein CDKN1A / p21 trong tế bào ống. Trong các tế bào này, sự hiện diện của nguyên bào sợi không ảnh hưởng đến biểu hiện mRNA CDKN1A, trong khi ở nguyên bào sợi, hiệu ứng đồng nuôi cấy rõ ràng có thể nhìn thấy với sự phong phú mRNA tăng cường chỉ có thể nhìn thấy trong đồng nuôi cấy. Tuy nhiên, sự gia tăng mức độ phong phú mRNA này không được phản ánh hoàn toàn bởi sự biểu hiện của protein, điều này cho thấy các cơ chế điều hòa khác. Các nghiên cứu về chu kỳ tế bào có thể được bổ sung để có cái nhìn sâu sắc hơn về tác động lên chu kỳ tế bào. Kinase 2 phụ thuộc cyclin (CDK2) được phát hiện có vai trò trong rối loạn điều hòa chu kỳ tế bào do OTA gây ra [21]. Trong tế bào hình ống, sự biểu hiện mRNA của nó được tăng cường bởi OTA trong quá trình đồng nuôi cấy trong khi nguyên bào sợi không bị ảnh hưởng bởi tế bào hình ống. Kết quả cho thấy chu kỳ tế bào trong tế bào ống chịu ảnh hưởng bởi sự hiện diện của nguyên bào sợi.

Một hiệu ứng đồng nuôi cấy khác đã được quan sát đối với sự biểu hiện của COX2 trong nguyên bào sợi. Đối với nguyên bào sợi, sự hiện diện của tế bào ống dẫn đến biểu hiện protein tăng cường rõ ràng (tương tự như kết quả quan sát được ở tế bào chuột [20]), điều này không thể nhìn thấy đối với tế bào ống không cho thấy bất kỳ sự phụ thuộc vào nuôi cấy. Điều này chỉ ra rằng vai trò của nguyên bào sợi trong quá trình viêmbệnh thậncó thể đã bị đánh giá thấp bởi các nghiên cứu sử dụng nguyên bào sợi trong nuôi cấy đơn phân. Protein vimentin dạng sợi trung gian được biểu hiện thành phần trong nguyên bào sợi và ngày càng được biểu hiện trong quá trình chuyển đổi từ biểu mô sang trung mô (EMT) trong tế bào biểu mô [10]. Mặc dù người ta đã chứng minh rằng tiếp xúc OTA kéo dài có thể dẫn đến tăng cường biểu hiện của collagen III hoặc fibronectin trong tế bào ống [7], trong nghiên cứu hiện tại, sự biểu hiện của vimentin protein chỉ thị EMT trong tế bào ống thậm chí còn thấp hơn sau khi tiếp xúc với OTA, độc lập của điều kiện nuôi cấy. Ngoài ra, sự biểu hiện của mRNA fibronectin và protein khá thấp hơn và không được tăng cường. Hơn nữa, trong các nguyên bào sợi, không có biểu hiện thay đổi nào có thể chứng minh được để những phát hiện này không gây tranh cãi ủng hộ EMT do OTA gây ra, như được chỉ ra bởi những người khác [31].

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG KIDNEY / RENAL

Để kiểm tra thêm liệu việc nuôi cấy đồng có thể ảnh hưởng đến câu trả lời của tế bào đối với căng thẳng do OTA gây ra hay không, chúng tôi đã xác định sự biểu hiện của một số RNA được lựa chọn điển hình liên quan đến quá trình chết-hoại tử, phát triển ung thư và chuyển hóa năng lượng. Các RNA dài không mã hóa đóng một vai trò quan trọng trong nhiều quá trình điều hòa tế bào và sự trật bánh của chúng, và cả trong bệnh xơ hóa hoặc ung thư thận [32]. WISP 1- AS1 là một RNA dài không mã hóa do OTA tạo ra và được biểu hiện trong các tế bào khối u thận [24]. Chúng tôi nhận thấy sự điều tiết của nó bằng OTA ở cả hai loại tế bào và đồng nuôi cấy đã tăng cường sự điều hòa. Điều này cho phép làm trầm trọng thêm ảnh hưởng của WISP 1- AS1 trên sự cân bằng apoptosis-hoại tử và có thể là sự hình thành khối u. Do đó, việc giải phóng LDH tăng cường được quan sát thấy trong đồng nuôi cấy ít nhất có thể được giải thích một phần là do hàm lượng nâng cao của WISP 1- AS1, được chứng minh là cần thiết đối với bệnh hoại tử do OTA [24].

WISP 1- AS1cũng được nghi ngờ là có vai trò trong quá trình trao đổi chất bao gồm cả mitochon dria [24]. Trong tế bào biểu mô dạ dày, OTA được chứng minh là gây rối loạn chức năng ty thể [33]. Vìquả thậntế bào, có những kết quả gây tranh cãi về việc liệu việc tiếp xúc với OTA có ảnh hưởng đến tiềm năng của ty thể hay không [21,24]. Ti thể bị giảm tiềm năng có thể là kết quả của việc ti thể bị suy giảm hoặc có thể dẫn đến tổn thương ti thể. Sự giảm biểu hiện của các protein ty thể có thể dẫn đến suy giảm chức năng sao chép hoặc theo sau là tiềm năng của ty thể bị thay đổi. Chức năng ti thể bị suy giảm buộc tế bào phải sử dụng các con đường thay thế để đảm bảo cung cấp năng lượng. Việc cung cấp năng lượng dưới sự đóng góp của ty thể không phù hợp có thể được duy trì bằng cách tăng cường sử dụng đường phân dẫn đến tăng cường sản xuất lactate. Tuy nhiên, trong tế bào HEK293, một phôi thai ngườiquả thậndòng tế bào, người ta nhận thấy rằng OTA dẫn đến giảm đường phân và lượng lactate tăng cường do sản xuất lactate từ glutamine phụ thuộc vào sự biểu hiện của lncRNA WISP 1- AS1 [24]. Ngược lại, ở các tế bào biểu mô dạ dày, có thể thấy rằng tiếp xúc với OTA dẫn đến lập trình lại quá trình chuyển hóa glucose theo hướng đường phân và ít hoạt động chu trình axit tricarboxyic hơn [34]. Ở đây chúng ta có thể chỉ ra rằng (1) OTA dẫn đến giảm biểu hiện mRNA của hai protein ty thể được chọn đại diện, đóng vai trò trong quá trình tổng hợp protein ty thể (MRPS16) và sản xuất năng lượng (NDUFB10) và (2) mà các enzyme xử lý glycogen được điều chỉnh. theo cách mà glucose tăng cường có thể được huy động (GYS1 giảm và PYGM tăng). Ngoài ra, khả năng vận chuyển GLUT1 cao hơn dường như được tạo ra. Tuy nhiên, những thay đổi do OTA gây ra này hầu như không phụ thuộc vào các điều kiện nuôi cấy.

Kết luận, chúng tôi đã chỉ ra rằng trong điều kiện đồng nuôi cấy, phản ứng của tế bào có thể khác với phản ứng được quan sát trong nuôi cấy đơn tính, mặc dù không phải tất cả các thông số được nghiên cứu ở đây đều phụ thuộc vào quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, dựa trên những kết quả được trình bày ở đây, việc sử dụng đồng nuôi cấy nên được ưu tiên hơn nếu có thể, do đó tránh khả năng giám sát các tác động không xảy ra khi chỉ nghiên cứu một loại tế bào. Câu hỏi vẫn là làm thế nào các tế bào giao tiếp với nhau. Các nghiên cứu trong mô hình đồng nuôi cấy chuột cho thấy cơ chế phụ thuộc COX 2- [20] và ở chuột, axit retinoic dường như tham gia vào quá trình trao đổi chéo tế bào củaquả thậnô [35]. Ngoài ra, câu hỏi vẫn còn là, nếu, tại sao và làm thế nào OTA can thiệp vào quá trình chuyển hóa năng lượng tế bào và vai trò của ty thể trong đó.

Xác định Hoạt động LDH và Caspase -3 và Hàm lượng ProteinĐối với quá trình ly giải, tế bào được rửa hai lần trong đệm PBS lạnh đá, được thu thập và ly giải trong đệm MOPSTriton (2 0 mM 3- (N-morpholino) axit propanesulfonic, pH 7,4, 0. 1 phần trăm Triton X100). Hàm lượng protein trong dịch ly giải tế bào được xác định bằng cách sử dụng axit bicinchoninic [36,37]. Hoạt động của LDH trong môi trường hoặc chất ly giải tế bào như là một biện pháp cho sự hoại tử được xác định theo Bergmeyer [38] như được mô tả chi tiết trong [20]. Hoạt động của caspase -3 như một thước đo cho quá trình chết theo phương pháp apoptosis được xác định bằng cách sử dụng chất nền florigenic caspase -3 (DEVD-AFC) như được mô tả trong [39]. Tóm lại, 60 µL dịch chiết tế bào được ủ với 65 µL đệm phản ứng (20 mmol / L piperazine -1, 4- bis (axit 2ethanesulfonic (PIPES)), 4 mmol / L EDTA, 0,2 phần trăm {{26} } [(3- cholaminopropyl) dimethylammonio] -1- propanesulfate (CHAPS), 10 mmol / L dithiotreitol (DTT), pH 7,4) chứa 42 µmol / L DEVD-AFC (Aspglu-val-asp {{ 36}} amino -4- trifluoromethylcoumarin, nồng độ cuối) ở 37 ◦C. Độ huỳnh quang của sản phẩm bị phân cắt (AFC) được đo ở kích thích 400 nm và phát xạ 505 nm. AFC đã xóa được định lượng bằng đường chuẩn sử dụng AFC đã biết nồng độ.

RT-PCR  Việc phân lập tổng số axit ribonucleic (RNA) được thực hiện bằng thuốc thử Trizol (Life Technologies, Darmstadt, Đức). Tế bào được rửa sạch và sau đó được ly giải bằng thuốc thử Trizol và chuyển vào ống phản ứng. Sau khi bổ sung cloroform và ly tâm (12, 000 × g), giai đoạn trên được thu thập và trộn với isopropanol lạnh băng. Sau khi ly tâm (12, 000 × g) phần nổi phía trên được loại bỏ và viên bột được rửa hai lần với 75% etanol và cuối cùng được giải trong nước. Phiên mã ngược được thực hiện bằng cách sử dụng một bộ công cụ thương mại của Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) theo hướng dẫn của họ. PCR thời gian thực được thực hiện bằng thuốc thử SYBR Green (Invitrogen). Mồi được tổng hợp bởi Microsynth AG, Balgach, Thụy Sĩ. Trình tự mồi được trình bày trong Bảng 1. Sự thay đổi lần lượt của biểu hiện gen được tính bằng phương pháp 2∆∆Ct sử dụng biểu thức của EEF2 và RPS17 làm tài liệu tham khảo. Sự biểu hiện của hai gen này hóa ra là những gen ít bị thay đổi hơn (nếu có) trong dữ liệu giải trình tự RNA khi so sánh OTA được xử lý với các tế bào HK2 không được xử lý (kết quả không được công bố).

Khối phương Tây  Sau khi phân tách các protein bằng phương pháp điện di trên gel natridodecylsulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE), các protein được chuyển lên màng nitrocellulose. Sau đó, các vị trí liên kết tự do của màng bị chặn bởi dung dịch 5% sữa khô không béo trong nước muối đệm TRIS (3 mM TRIS base, 14 0 mM NaCl, 0. 17 mM Tris -HCl, pH 7,4) chứa 0,1 phần trăm Tween20. Các kháng thể đầu tiên được pha loãng trong nước muối TRIS cộng với 5% albumin huyết thanh bò (TRIS-BSA, để pha loãng xem Bảng 2) được thêm vào và ủ màng qua đêm. Sau khi rửa, các kháng thể thứ cấp kết hợp với huỳnh quang trong TRIS-BSA được thêm vào trong 90 phút. Sự phát huỳnh quang của các kháng thể thứ hai được ghi lại bằng cách sử dụng hệ thống phát hiện LICOR.

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN ĐAU KIDNEY / RENAL