Tác dụng bảo vệ của Quercetin đối với các tế bào nội mô bị tổn thương do thiếu oxy và quá trình tái oxy hóa

Để biết thêm thông tin, liên lạctina.xiang@wecistanche.com

Tiểu sử: Bệnh mạch nhỏ não (CSVD) là một nhóm các hội chứng lâm sàng bao gồm tất cả các quá trình bệnh lý của các mạch nhỏ trong não, có thể gây đột quỵ và sa sút trí tuệ nghiêm trọng. Tuy nhiên, cơ chế bệnh sinh của CSVD không rõ ràng nên việc điều trị còn hạn chế. Rối loạn chức năng tế bào nội mô sớm hơn các triệu chứng lâm sàng, chẳng hạn như tăng huyết áp và tăng bạch cầu. Do đó, việc điều trị tế bào nội mô được kỳ vọng sẽ là một bước đột phá mới.Quercetin, một loại flavonoid có trong nhiều loại thực vật, có chức năng chống viêm và chống oxy hóa. Nghiên cứu này nhằm mục đích điều tra tác dụng bảo vệ của quercetin đối với tổn thương tế bào nội mô và cung cấp lý thuyết cơ bản để ứng dụng tiếp theo trong phòng khám.

Phương pháp: Tế bào nội mô vi mạch não người (HBMECs) được nuôi cấy trong ống nghiệm, và mô hình tổn thương của tế bào nội mô được thiết lập do thiếu oxy và tái oxy hóa (H / R). Tác dụng bảo vệ của quercetin đối với HBMEC đã được nghiên cứu từ các khía cạnh của khả năng tồn tại của tế bào, sự di chuyển của tế bào, hình thành mạch và quá trình chết rụng. Để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế của quercetin,stress oxy hóavà ứng suất lưới nội chất đã được phân tích. Hơn nữa, tính toàn vẹn của hàng rào máu não (BBB) ​​cũng đã được nghiên cứu.

Kết quả: Quercetincó thể thúc đẩy khả năng tồn tại, di chuyển và hình thành mạch của HBMEC, và ức chế quá trình apoptosis. Ngoài ra, quercetin còn có thể kích hoạt lộ trình truyền tín hiệu Keap1 / Nrf2, giảm biểu hiện protein ATF6 / GRP78. Nghiên cứu sâu hơn cho thấy rằng quercetin có thể làm tăng sự biểu hiện của Claudin -5 và Zonula tắc -1.

Kết luận: Các thí nghiệm của chúng tôi cho thấy quercetin có thể bảo vệ HBMEC khỏi H / R, có tác dụng thúc đẩy tăng sinh tế bào, di chuyển tế bào và hình thành mạch, giảm tổn thương tiềm năng màng ty thể và ức chế quá trình chết của tế bào. Điều này có thể liên quan đến khả năng chống oxy hóa và ức chế căng thẳng mạng lưới nội chất. Đồng thời, quercetin có thể làm tăng mức độ liên kết BBB, cho thấy rằng quercetin có thể duy trì tính toàn vẹn của BBB.

Từ khóa: bệnh mạch nhỏ não, tế bào nội mô, quercetin, stress oxy hóa, căng thẳng lưới nội chất, hàng rào máu não

GIỚI THIỆU

Bệnh mạch máu não nhỏ(CSVD) là một thuật ngữ chung bao gồm tất cả các quá trình bệnh lý liên quan đến các mạch nhỏ trong não và đề cập đến một nhóm các hội chứng lâm sàng, hình ảnh và bệnh lý với các nguyên nhân khác nhau chứa các tiểu động mạch nội sọ đến các tiểu tĩnh mạch có đường kính.<400 μm）（wardlaw="" et="" al,2013;="" wardlaw="" et="" al,2019).="" the="" most="" common="" symptoms="" include="" mainly="" new-onset="" subcortical="" small="" infarcts,="" lacunar="" foci="" of="" vascular="" origin,="" cerebral="" white="" matter="" hyperintensities,="" microbleeds,="" cerebral="" atrophy,="" and="" enlarged="" perivascular="" spaces="" (wardlaw="" et="" al,2013).="" with="" the="" progression="" of="" the="" disease,="" subclinical="" and="" early-stage="" patients="" can="" have="" emotional="" abnormalities,="" gait,="" memory,="" disorientation,="" and="" even="" stroke="" and="" dementia="" and="" other="" serious="" consequences.="" up="" to="" 25%="" of="" stroke="" and="" 45%="" of="" dementia="" are="" caused="" by="" csvd(cannistraro="" et="" al,2019),="" which="" brings="" a="" heavy="" socioeconomic="" burden="" and="" is="" a="" major="" problem="" that="" needs="" to="" be="" addressed="" by="" slow="" disease="" and="" health="" strategies.="" scholar="" has="" used="" dynamic="" contrast="" enhanced-mri="" technique="" to="" find="" that="" blood-brain="" barrier(bbb)leakage="" is="" more="" prevalent="" in="" csvd="" patients(zhang="" et="" al,2017).="" extravasation="" of="" blood="" components="" may="" lead="" to="" local="" vascular="" changes="" and="" diffuse="" brain="" tissue="" damage.="" the="" bbb="" is="" a="" junction="" of="" endothelial="" cells,="" pericytes,="" and="" astrocyte="" tight="" junctions(keaney="" and="" campbell,="" 2015).in="" addition,="" more="" and="" more="" scholars="" also="" believe="" that="" endothelial="" dysfunction="" plays="" a="" key="" role="" in="" the="" early="" development="" of="" csvd="" (hainsworth="" et="" al,2015).="" therefore,="" protecting="" endothelial="" cells="" may="" be="" a="" potential="" therapeutic="" strategy="" for="">

Quercetinlà một flavonoid có trong một số loài thực vật, chẳng hạn như Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc có các hoạt động chống oxy hóa và chống viêm mạnh và có thể phát huy tác dụng bảo vệ trong các tình trạng bệnh lý khác nhau bao gồm bệnh tim mạch, rối loạn chuyển hóa, bệnh thoái hóa thần kinh, tiểu đường, ung thư và béo phì (Dok-Go et al, 2003; Comalada et al, 2005; Cho và cộng sự, 2006). Tiền xử lý với quercetin làm tăng đáng kể mức độ biểu hiện của các enzym chống oxy hóa nội sinh trong tế bào thần kinh hình tháp CA1 ở hải mã của động vật bị thiếu máu cục bộ, cho thấy tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ thần kinh mạnh mẽ (Chen và cộng sự, 2017). Các nghiên cứu gần đây cũng phát hiện ra rằng quercetin có tác dụng bảo vệ thần kinh chống lại tổn thương do thiếu máu cục bộ trong khi duy trì tính toàn vẹn của BBB (Jin và cộng sự, 2019). Tuy nhiên, tác dụng của nó đối với tế bào nội mô vi mạch não (BMEC) trong tình trạng thiếu oxy và tái oxy hóa (H / R) chưa được nghiên cứu rõ ràng, và protein đích của quercetin bảo vệ BMECs chưa được báo cáo.

Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi đã khám phá tác dụng bảo vệ của quercetin đối với các tế bào nội mô vi mạch não người (HBMEC) bị tổn thương bởi H / R trong quá trình nuôi cấy. Đồng thời, chúng tôi đã nghiên cứu sâu hơn về cơ chế có thể có của tác dụng bảo vệ của nó, để cung cấp cơ sở lý thuyết hơn cho việc thúc đẩy lâm sàng của quercetin và cung cấp những ý tưởng mới để điều trị CSVD.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Phương tiện, Thuốc thử và Kháng thể

Quercetin(purity>98%) được mua lại từ Best Biological Technology Co, Ltd. (Thành Đô, Trung Quốc). HBMEC được mua từ Qingqi Biotechnology Development Co., Ltd (Thượng Hải, Trung Quốc). Huyết thanh bò thai (FBS) được lấy từ Công nghiệp sinh học (Kibbutz Beit Haemek, Israel). Penicillin / streptomycin và môi trường đại bàng biến tính của Dulbecco (DMEM) được mua từ Hyclone (GA, Hoa Kỳ). Bộ kiểm tra điện thế màng ty thể (JC -1), bộ kiểm tra protein BCA, 2, 7- dichloride-hydro fluorescein diacetate (DCFH-DA) và lysate NP4 0 được mua từ Beyotime Biotechnology (Thượng Hải, Trung Quốc). Chế phẩm phosphatase và chất ức chế protease hoàn chỉnh được mua từ Roche (Thượng Hải, Trung Quốc). Apoptosis Kit được mua từ BD Biosciences (Sparks, MD, United States). Malondialdehyde (MDA), Superoxide dismutase (SOD), Phân tử kết dính tế bào -1 (ICAM -1), Phân tử kết dính tế bào mạch máu -1 (VCAM {{1 0}} ) xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (ELISA) là (Cambridge, Abcam đã mua lại công ty dfrom1 "一 Vương quốc Anh). Kích hoạt yếu tố phiên mã 6 (ATF6), protein điều chỉnh glucose 78 (GRP78), Zonula tắc 1 (ZO -1), Claudin -5, GAPDH được mua từ Công nghệ tín hiệu tế bào (Danvers, Hoa Kỳ). IgG kháng thỏ liên hợp với peroxidase (HRP) của cải ngựa được lấy từ công ty Jackson (Pennsylvania, Hoa Kỳ). Bộ phân phối nhanh SDS-PAGE và dung dịch tạo màu ECL được mua từ EpiZyme Biotechnology (Thượng Hải, Trung Quốc). Nuôi cấy tế bào và mô hình chấn thương HBMECs được nuôi cấy trong DMEM có chứa 1 0 phần trăm FBS và 1 phần trăm penicillin-streptomycin, ở 37Cincubator với 5 phần trăm CO2. Để gây ra endothel tổn thương tế bào ial, HBMECs được điều trị với tình trạng thiếu oxy trong 12 giờ sau đó là tái oxy hóa 8 giờ, và các quy trình cụ thể như sau (Warpsinski và cộng sự, 2020): HBMEC lần đầu tiên được ủ với môi trường không có huyết thanh trong tủ ấm thiếu oxy (1% O, 5 phần trăm CO.94 phần trăm N) trong 12 giờ, và sau đó môi trường được thay đổi thành môi trường bình thường chứa 10 phần trăm FBS, trong khi chúng được ủ trong tủ ấm normoxia (95 phần trăm O2,5 phần trăm CO2) trong 8 giờ. Xử lý Quercetin 2 mg Quercetin được hòa tan trong 331μL DMSO để tạo thành dung dịch gốc có nồng độ 1 mmol / L và được bảo quản ở -20 độ. Dung dịch làm việc được pha loãng thành 0,1,0.5,1,2,5.10umol / L với DMEM, trong đó phần trăm DMSO dưới 0,1 phần trăm. Khi các tế bào đã được kết dính, quercetin với môi trường không có huyết thanh được thêm vào, và các đĩa này sau đó được đặt vào tủ ấm thiếu oxy. Sau 12 giờ, các tế bào được loại bỏ, thay đổi thành quercetin với môi trường huyết thanh, và được đặt trong tủ ấm normoxia trong 8 giờ.

Thử nghiệm khả năng tồn tại của tế bào

Ảnh hưởng củaquercetinvề khả năng tồn tại của HBMEC đã được kiểm tra bằng Bộ đếm tế bào -8 theo hướng dẫn sử dụng. Đầu tiên người ta đánh giá liều lượng an toàn của quercetin đối với tế bào trong trường hợp không gây tổn thương tế bào nội mô, sau đó thử nghiệm tác dụng bảo vệ của nó trong điều kiện tế bào bị tổn thương. Tất cả các kết quả thí nghiệm được lặp lại ít nhất ba lần.

Các thí nghiệm Di chuyển vết xước và chữa lành vết xước đã được thực hiện bằng phương pháp cào tế bào. Trước khi xử lý quercetin, một đường thẳng vuông góc được vẽ ở đáy đĩa nuôi cấy và được chụp ảnh để ghi lại trong 0 h, và các tế bào sau đó được xử lý quercetin và làm mô hình trước khi chụp ảnh để ghi lại. Vùng trước và vùng sau được đối chiếu hai lần.

Sự hình thành ống bắt chước khả năng tạo mạch của tế bào, Matrigel (9-12 mg / ml) được đặt ở dưới cùng của đĩa nuôi cấy, sau đó quercetin và các tế bào đã xử lý mô hình được mạ lên trên, sau 8 giờ, ảnh được chụp. Sự tạo nhánh của mạch máu được phân tích và so sánh bằng ImageJ.

Tiềm năng của màng ti thể và xét nghiệm quá trình rụng trứng

Bộ thay đổi điện thế màng ti thể và bộ dụng cụ apoptosis được sử dụng để phát hiện quá trình apoptosis của tế bào. Sự thay đổi điện thế màng ty thể được phát hiện bằng cách nhuộm HBMEC với đầu dò huỳnh quang JC -1. Dung dịch nhuộm JC -1 (1 ×) được thêm vào và ủ trong tủ cấy 37 độ trong 20 phút trước khi được rửa hai lần với đệm nhuộm JC -1 (1 ×) và cuối cùng được thêm vào mỗi giếng để PBS . Sau đó, trình hình ảnh ô nội dung cao được sử dụng để phân tích.

HBMEC được thu thập từ các đĩa giếng 6-, được ly tâm để loại bỏ phần nổi phía trên, sau đó thêm dung dịch liên kết 1 × Annexin V để thổi và trộn các tế bào, sau đó thêm thuốc nhuộm FITC Annexin V để ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong 10 tối thiểu, thêm dung dịch nhuộm propidium iodide (PI) 5 phút trước máy và sử dụng máy đo lưu lượng Beckman để phát hiện.

ELISA

Sau khi các tế bào được xử lý bằng H / R hoặc quercetin, phần nổi phía trên sẽ được thu thập. ICAM -1, VCAM -1, SOD và MDA đã được phát hiện bằng cách sử dụng bộ dụng cụ ELSA theo hướng dẫn sử dụng.

Thử nghiệm các loài oxy phản ứng (ROS) Khả năng tạo ra ROS được phát hiện bằng đầu dò DCFH-DA, được đánh giá bởi bộ hình ảnh tế bào hàm lượng cao và được phân tích bằng huỳnh quang sử dụng ImageJ. Western Blotting

HBMEC được thu thập từ đĩa nuôi cấy, NP40 lysate bổ sung chế phẩm phosphatase và chất ức chế protease hoàn chỉnh được sử dụng để tách protein từ tế bào. Hàm lượng protein được xác định và protein 30ug được lấy cho các thí nghiệm hấp thụ miễn dịch. Gel SDS-PAGE được sử dụng để điện di, được chặn bằng sữa khô không béo 5% sau khi chuyển điện sang màng PVDF trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó là chống Nrf2 (thỏ, 1: 1, 000), chống Keapl (thỏ, 1: 1, 000), chống ATF6 (thỏ, 1: 1, 000 ), chống GRP78 (thỏ, 1: 1, 000), chống ZO -1 (thỏ, 1: 1, 000), chống Claudin -5 ( kháng thể thỏ, 1: 1, 000) được ủ qua đêm ở 4C. Sau khi rửa vào ngày hôm sau, các kháng thể thứ cấp chống thỏ pha loãng của Dê (IgG HRP, 1:10, 000) được thêm vào và ủ trong 1 giờ. Cuối cùng, phát hiện được phát triển sau khi rửa ba lần trong TBST.

Phân tích proteomic

HBMEC được điều trị bằng H / R với sự hiện diện của quercetin (l umol / L). Sau đó, các tế bào được cạo nhẹ ra khỏi đĩa nuôi cấy bằng dụng cụ nạo tế bào, thu thập trong tủ lạnh, nhanh chóng được đặt trong nitơ lỏng, và sau đó được bảo quản ở độ -80 trong 5 phút. Công nghệ iTRAQ được sử dụng để phân tích protein, protein có giá trị p<0.05 and="" ratio="" multiple="" changes="">1,2 hoặc<0.83 were="" defined="" as="" differentially="" expressed="">

Phân tích thống kê

Dữ liệu phù hợp với phân phối chuẩn và độ lệch chuẩn trung bình ± được sử dụng để thể hiện dữ liệu. GraphPad Prism 8 được sử dụng để phân tích thống kê. Hai mẫu độc lập được phân tích bằng phép thử t và dữ liệu đo được mô tả bằng giá trị trung bình ± Độ lệch chuẩn (SD). Việc so sánh giữa các nhóm được thực hiện bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA). giá trị p<0.05 indicated="" that="" the="" difference="" was="" statistically="">

KẾT QUẢ

Kết quả

Ảnh hưởng của Quercetin đến khả năng tồn tại của tế bào

Để kiểm tra tác động của quercetin đối với khả năng tồn tại của tế bào, trước tiên, chúng tôi đã kiểm tra một liều lượng quercetin an toàn trên tế bào, như thể hiện trong Hình 1A, không ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của tế bào tại 0. 1-10 umol / L . Tiếp theo, để tìm kiếm liều lượng hiệu quả trên cơ sở tổn thương tế bào nội mô, chúng tôi đã chỉ ra rằng quercetin ở 0. {4}} μmol / L có thể thúc đẩy khả năng tồn tại của tế bào trong H / R-HBMEC, như được hiển thị trong Hình 1B. Các thí nghiệm tiếp theo được thực hiện xung quanh khoảng nồng độ này. Điều đáng chú ý là khi nồng độ thuốc đạt đến 10 μmol / L, độc tính tế bào đã xuất hiện. Chúng tôi nghĩ rằng khi HBMEC bị H / R phá hủy, khả năng chịu đựng của chúng sẽ giảm. Do đó, khi nồng độ thuốc cao hơn một chút, sự phá hủy các tế bào sẽ tăng lên. Do đó, độc tính tế bào xảy ra khi nồng độ thuốc là 10 μmol / L.

Ảnh hưởng của Quercetin đối với sự di chuyển tế bào và hình thành mạch

Để kiểm tra tác động của quercetin đối với khả năng di chuyển và tạo mạch của tế bào nội mô, các HBMEC đã được điều trị H / R trong khi sử dụng quercetin. Chúng tôi đã thực hiện xét nghiệm xước để kiểm tra khả năng di chuyển của tế bào, cho thấy rằng việc điều trị H / R làm suy yếu khả năng di chuyển của H / R-HBMEC so với đối chứng và quercetin có thể thúc đẩy đáng kể sự di chuyển của tế bào ở nồng độ 0 . 1-1 μmol / L. Sự hình thành ống được sử dụng để bắt chước sự hình thành mạch in vitro, và chiều dài nhánh của nó thể hiện khả năng tạo mạch. Kết quả cho thấy rằng điều trị H / R làm giảm khả năng tạo mạch, nhưng quercetin 0. 1-1 μmol / L có thể đảo ngược tổn thương này, như thể hiện trong Hình 2.

Ảnh hưởng của Quercetin đến quá trình chết của tế bào

Để kiểm tra tiềm năng của quercetin trong việc ức chế quá trình tự chết của tế bào nội mô, chúng tôi đã sử dụng điện thế màng ti thể và quá trình tự chết để đánh giá. Khi các tế bào bị thương để trải qua các sự kiện apoptotic, điện thế màng ty thể giảm, huỳnh quang đỏ tế bào chất giảm đáng kể, tăng huỳnh quang xanh lá cây và cuối cùng là Red / Green (R / G) được sử dụng để đại diện cho sự thay đổi điện thế màng ty thể, sẽ giảm khi điện thế màng ty thể bị tổn hại. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng sau khi điều trị H / R, điện thế màng ty thể của tế bào giảm, thể hiện bằng sự tăng huỳnh quang màu xanh lá cây. Với liều lượng ngày càng tăng của quercetin, huỳnh quang màu đỏ liên tục được tăng cường, cho thấy rằng quercetin có thể nâng cao điện thế màng ty thể một cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 3A, C). Hơn nữa, phương pháp đo tế bào dòng chảy đã được sử dụng để kiểm tra trực tiếp quá trình chết rụng của tế bào. Kết quả cho thấy HBMECs thể hiện tỷ lệ apoptosis cao hơn sau khi điều trị H / R, trong khi quercetin ở 0. 1-1 umol / L thể hiện khả năng ức chế apoptosis rõ ràng (Hình 3B, D).

Ảnh hưởng của Quercetin đến sự kết dính tế bào

Khi các tế bào nội mô bị hư hỏng, một số phân tử kết dính, chẳng hạn như ICAM {{0}} và VCAM -1 được sản xuất, hấp thụ các chất độc hại vào BBB và làm tổn thương nhu mô não (Hauptmann và cộng sự, 2020 ) .Để kiểm tra ảnh hưởng của quercetin đến khả năng tạo ra các phân tử kết dính của H / R-HBMECs, ICAM -1 và VCAM -1 đã được đo bằng ELISA. Trong nghiên cứu của chúng tôi, H / R làm tăng mức độ ICAM -1 và VCAM -1, nhưng việc bổ sung quercetin dưới nồng độ 0. 1-1 umol / L đã làm giảm tác dụng này (Hình 4).

Quercetin có thể ức chế stress oxy hóa

Quercetin là một flavonoid có khả năng chống oxy hóa mạnh, vì vậy chúng tôi đã sử dụng đầu dò DCFH-DA để phát hiện ROS. Chúng tôi quan sát

tăng tạo ROS ở các HBMEC tiếp xúc với H / R, điều này đã giảm rõ rệt khi xử lý bằng quercetin ở nồng độ {{0}}. 1-1 umol / L Trong khi đó, chúng tôi phát hiện thấy sự thay đổi mức độ của stress oxy hóa sản phẩm SOD và MDA với ELISA, và kết quả cho thấy rằng quercetin ở nồng độ 0. 1-1 μmol / L có thể làm giảm SOD và MDA, vốn được nâng cao bởi H / R, do đó cho thấy rằng quercetin có thể làm giảm thiệt hại của HBMECs từ ứng suất oxy hóa (Hình 5).

Quercetin có thể điều chỉnh protein Keap1 / Nrf2 và ATF6 / GRP78

Để khám phá thêm cơ chế bảo vệ của quercetin trên HBMEC, chúng tôi đã phân tích mức độ biểu hiện củastress oxy hóavà các protein liên quan đến căng thẳng lưới nội chất. Keap1 / Nrf2 được biết là điều chỉnh phản ứng chống oxy hóa in vivo. Tổn thương do stress oxy hóa buộc các tế bào nội mô phải trải qua phản ứng căng thẳng, dẫn đến tăng mức Keapl / Nrf2 (Warpsinski và cộng sự, 2 0 20). Trong nghiên cứu này, H / R dẫn đến việc kích hoạt các cơ chế phản ứng chống oxy hóa tế bào và tăng mức Keapl và Nrf2, có thể được tăng cường thêm bởi quercetin ở 0. 5-1 umol / L để tăng cường khả năng chống oxy hóa của HBMECs .ATF6 / GRP78 là một trong những con đường điều chỉnh cân bằng nội môi của lưới nội chất (ER). Căng thẳng ER có thể làm trầm trọng thêm tổn thương tế bào nội mô (Nie và cộng sự, 2020) Trong nghiên cứu của chúng tôi, căng thẳng ER được kích hoạt bởi H / R, và mức ATF6 và GRP78 đã tăng lên. Quercetin ở l umol / L có thể làm giảm đáng kể mức protein của cả hai, ức chế stress ER và bảo vệ HBMEC khỏi tổn thương H / R (Hình 6).

Quercetin có thể duy trì tính toàn vẹn của BBB

BMEC là xương sống của cấu trúc BBB và việc chúng chết hoặc chết sau khi bị tổn thương H / R ảnh hưởng đến tính toàn vẹn và chức năng của BBB (Ding và cộng sự, 2019). của các protein liên kết với BBB ZO -1 và Claudin -5. So với nhóm kiểm soát, biểu hiện của ZO -1 và Claudin -5 là

giảm tổn thương H / R, cho thấy rằng BBB đã bị hư hỏng và tổn thương này có thể được phục hồi bằng quercetin ở nồng độ 0. 5-1 μmol / L, cho thấy rằng quercetin có thể duy trì chức năng của tế bào nội mô (Hình 7).

Phân tích proteomic

Để tìm các protein biểu hiện khác biệt (DEP) của các HBMEC bị thương H / R khi có quercetin hay không, ITRAO được sử dụng để tiến hành phân tích proteomics. Protein thể hiện ap<0.05 and="" a="" ratio="" fold="" change="">1,2 hoặc<0.83 were="" defined="" as="" deps.="" in="" our="" study,="" the="" differences="" in="" protein="" among="" the="" control,="" h/r,="" and="" quercetin="" groups="" were="" compared.="" the="" results="" showed="" that="" 172="" proteins="" were="" identified="" as="" deps="" between="" the="" control="" and="" h/r="" groups,="" among="" which="" 94="" were="" upregulated="" and="" 78="" were="" downregulated="" in="" the="" h/r="" group.="" there="" were="" 1,016="" proteins="" identified="" as="" deps="" between="" the="" h/r="" group="" and="" the="" quercetin="" group,="" of="" which="" 553="" were="" up-regulated="" and="" 463="" were="" down-regulated="" in="" the="" quercetin="" group,="" as="" shown="" in="" figure="" 8a.="" between="" control="" vs="" h/r="" and="" h/r="" vs="" quercetin="" group,56="" of="" the="" same="" deps="" were="" shared="" between="" the="" two="" groups.="" the="" expressions="" of="" these="" deps="" were="" analyzed="" by="" hierarchical="" clustering="" as="" shown="" in="" figure="" 8b.="" among="" these="" deps,="" the="" top="" 20="" were="" shown="" in="" table="" among="" these="" 20="" commons,="" insulin="" receptor-related="" protein="" (insrr),="" dual-specificity="" protein="" phosphatase="" 3="" (dusp3),="" annexin="" a2(anxa2),="" hemoglobin="" subunit="" alpha="" (hba1),="" phosphoglycerate="" kinase="" 1="" (pgk1),="" vitronectin="" (vtn),="" glucose-6-phosphate="" isomerase="" (gpi)="" are="" related="" to="" endothelial="">

THẢO LUẬN

CSVD, với tư cách là gánh nặng kinh tế xã hội và y tế ngày càng gia tăng, đã nhanh chóng thu hút sự chú ý. Nhưng đáng ngạc nhiên là cơ chế bệnh sinh của CSVD hiện nay vẫn còn mù mờ, không có kế hoạch điều trị rõ ràng. Do các giai đoạn sau của CSVD có thể tiến triển đến các kết quả nghiêm trọng như đột quỵ và sa sút trí tuệ, việc xác định các tổn thương sớm để điều trị có thể trì hoãn hiệu quả sự tiến triển của CSVD (Cannistraro và cộng sự, 2019). Người ta đã chỉ ra rằng những thay đổi bệnh lý ban đầu của CSVD nằm ở rối loạn chức năng tế bào nội mô và các loại thuốc ổn định rối loạn chức năng của nó có thể cải thiện tính dễ bị tổn thương của chất trắng não trong tổn thương CSVD (Rajani và cộng sự, 2018). Với vai trò của các tế bào nội mô trong CSVD, chúng tôi bắt đầu nghiên cứu tác dụng bảo vệ của y học cổ truyền Trung Quốc đối với các tế bào nội mô bằng cách sử dụng HBMEC.

Quercetin là một flavonoid có trong nhiều loại thực vật (Nawrot-Hadzik và cộng sự, 2019). Nó có các hoạt động chống oxy hóa và chống viêm mạnh và có thể phát huy tác dụng bảo vệ trong các tình trạng bệnh lý khác nhau. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh rằng quercetin có thể cải thiện tổn thương H / R, và một số dữ liệu thực nghiệm xác nhận kết luận của chúng tôi rằng quercetin có thể thúc đẩy khả năng tồn tại của tế bào, di chuyển tế bào, hình thành mạch, tăng tiềm năng màng ty thể và ức chế quá trình chết.

Xem xét rằng quercetin có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, chúng tôi đã nghiên cứu cơ chế mà quercetin bảo vệ HBMECs về mặt chống oxy hóa. Mức độ ROS có thể tăng lên đáng kể do căng thẳng oxy hóa (Wu và cộng sự, 2018), và sự tích tụ ROS có thể gây ra nhiều bệnh, bao gồm các bệnh tim mạch, rối loạn chức năng nội mô và các bệnh liên quan đến lão hóa, và các bệnh thoái hóa thần kinh (Chen và cộng sự, 2015; Jakaria và cộng sự, 2018; Santos và cộng sự, 2018). Hơn nữa, stress oxy hóa xảy ra trong quá trình peroxy hóa lipid, tạo ra MDA, sẽ phá hủy sự cân bằng oxy hóa oxy hóa của cơ thể và làm tăng tổn thương tế bào nội mô (Yang và cộng sự, 2021).

Keapl / Nrf2 được coi là con đường tự chống oxy hóa stress quan trọng nhất hiện nay, và việc kích hoạt con đường này có thể cải thiện đáng kể tình trạng rối loạn chức năng tế bào nội mô. Đặc biệt, ROS giúp thúc đẩy việc kích hoạt lộ trình tín hiệu Nrf2 (Selimoglu-Buet và cộng sự, 2017). Chúng tôi đã chứng minh rằng quercetin có thể làm giảm quá trình tạo ROS và MDA, đồng thời tăng biểu hiện protein Keapl và Nrf2, cho thấy rằng quercetin có thể làm giảm tổn thương tế bào nội mô bằng cách giảm phản ứng stress oxy hóa thông qua kích hoạt đường truyền tín hiệu Keapl / Nrf2.

Không chỉ vậy, căng thẳng ER kéo dài sẽ kích hoạt phản ứng protein mở ra và làm thay đổi biểu hiện của các gen chống oxy hóa, dẫn đến quá trình chết rụng tế bào nội mô (Tang et al, 2019). Hơn nữa, căng thẳng oxy hóa cũng có thể gây ra rối loạn sự gấp khúc của protein trong ER, gây ra căng thẳng ER và làm trầm trọng thêm tình trạng tổn thương tế bào nội mô (Hetz, 2012). Stress ER có thể được kích hoạt bằng ba con đường sau: ER kinase giống PKR (PERK), inositol yêu cầu enzyme 1 (IRE1) và ATF kích hoạt -6, bảo vệ tế bào khỏi stress ER trong điều kiện nội môi (Hetz et al , Năm 2020). Nhưng khi bị tác động bởi các kích thích bất lợi bên ngoài, ba con đường này sẽ kích hoạt phản ứng stress ER và gây ra quá trình chết rụng tế bào. Hơn nữa, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc ức chế phản ứng stress ER có thể đảo ngược rối loạn chức năng tế bào nội mô do H / R gây ra (Chen và cộng sự, 2020). Trong nghiên cứu của chúng tôi, quercetin có thể làm giảm hàm lượng ATF6 / GRP78 tăng cao do H / R gây ra phản ứng căng thẳng của lưới nội chất và bảo vệ các tế bào nội mô.

Là một thành phần chính của BBB, các chức năng của tế bào nội mô bao gồm duy trì tính toàn vẹn của chúng. Rối loạn chức năng BBB gây rò rỉ chất lỏng, protein và các thành phần huyết tương khác vào các mô quanh mạch, làm suy giảm thêm sự giãn mạch não và vận chuyển chất dinh dưỡng (Wardlaw và cộng sự, 2019). Khi các tế bào nội mô bị tổn thương và tính toàn vẹn của BBB sẽ bị phá hủy, vì vậy việc bảo vệ các tế bào nội mô có thể duy trì hơn nữa tính toàn vẹn của BBB. Tính thấm của BBB (Yang và cộng sự, 2020). Các tế bào nội mô được neo vào bộ xương actin bằng các protein giàn giáo như ZO -1, tạo ra các điểm nối chặt chẽ giữa các tế bào nội mô để duy trì sự chặt chẽ của BBB (Zhang và cộng sự, 2020). Trong nghiên cứu của chúng tôi, biểu thức của claudin -5 và ZO -1 được sử dụng để biểu thị tính toàn vẹn của BBB. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng mức protein của claudin -5 và ZO -1 đã giảm trong HBMEC bị tổn thương H / R, cho thấy rằng tính toàn vẹn của BBB đã bị gián đoạn và quercetin có thể giảm tổn thương này bằng cách nâng cao claudin {{ Mức protein 9}} và ZO 1.

Hơn nữa, để tìm mục tiêu tiềm năng của quercetin trên HBMEC, i-TRAQ đã được gắn nhãn vào các ô. Sau khi phân tích proteomic, 20 protein biểu hiện khác biệt hàng đầu đã được khảo sát. Trong số đó, INSRR, DUSP3,

ANXA2, HBA1, PGK1, VTN, GPI liên quan đến tế bào nội mô. INSRR được coi là một dấu hiệu đánh dấu nội mô khối u và sự biểu hiện quá mức của nó có thể thúc đẩy hình thành mạch (Nowak-Sliwinska và cộng sự, 2019). ANXA2 tái tổ hợp có thể làm giảm tính thấm của nội mô trong điều kiện thiếu oxy và tổn thương yếu tố viêm, cho thấy ANXA2 có thể tham gia vào việc duy trì độ kín của tế bào nội mô (Li và cộng sự, 2019). Khi nhuộm các phần cổ tử cung của con người, sự biểu hiện mạnh mẽ của DUSP3 được tìm thấy trong các tế bào nội mô và các thí nghiệm cũng chứng minh rằng DUSP3 cần thiết cho sự phát triển vi mạch do yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi cơ bản gây ra (Amand et al. 2014). Sự biểu hiện HBAl trong các tế bào nội mô đã được chứng minh là có khả năng kiểm soát chức năng và trương lực mạch máu (Sangwung và cộng sự, 2017) .PGK1 cũng được cho là làm giảm hình thành xơ vữa (Zhang và cộng sự, 2020). Hơn nữa, VTN được coi là rất quan trọng đối với sự hình thành huyết khối trong bối cảnh tổn thương mạch máu (Bowley và cộng sự, 2017). GPI được làm giàu trong các tế bào nội mô vi mạch của mô hoạt dịch từ bệnh nhân viêm khớp dạng thấp trong môi trường thiếu oxy và điều chỉnh sự bài tiết của yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu từ nguyên bào sợi hoạt dịch của bệnh viêm khớp dạng thấp để tạo thành mạch (Lu và cộng sự, 2017). các protein biểu hiện liên quan đến vô sinh qua trung gian giãn tĩnh mạch thừng tinh cho thấy Nrf2 là chất điều hòa ngược dòng của ANXA2 (Panner Selvam và cộng sự, 2021). Sự ức chế PGK1 có thể kích hoạt con đường Keapl / Nrf2 và kích thích phản ứng chống oxy hóa bảo vệ tế bào (Bollong và cộng sự, 2018). Hai protein có thể là mục tiêu tiềm năng của quercetin thông qua con đường Keapl / Nrf2. Nghiên cứu sâu hơn có thể xác minh vai trò của những protein này đối với tác dụng của quercetin đối với H / R-HBMECs.

Phải thừa nhận rằng quercetin có thể phát huy tác dụng bảo vệ các tế bào nội mô. Nhưng các mục tiêu hành động cụ thể vẫn cần được điều tra thêm, và liệu có các con đường hành động bổ sung hay không vẫn chưa được biết.

Kết luận, nghiên cứu này chỉ ra rằng quercetin duy trì tính toàn vẹn của hàng rào máu não bằng cách bảo vệ các tế bào nội mô. Ở cấp độ phân tử, quercetin có thể đóng vai trò bảo vệ tế bào nội mô bằng cách bảo vệ chống lại stress oxy hóa thông qua con đường Keapl / Nrf2 và ức chế căng thẳng lưới nội chất thông qua con đường ATF6 / GRP78. Nghiên cứu này đặt nền tảng cho TCM để điều trị CSVD bằng cách bảo vệ các tế bào nội mô.