Vai trò không phụ thuộc vào protein của phốt phát trong sự tiến triển của bệnh thận mãn tính
Mar 20, 2022
Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Irene Faria Duayer1 et al
Trừu tượng:Một số yếu tố góp phần vàochức năng thậnsuy giảm ở bệnh nhân CKD, và vai trò của hàm lượng phosphate trong chế độ ăn uống vẫn còn là một vấn đề tranh luận. Nghiên cứu này nhằm mục đích phân tích cơ chế mà phosphate, không phụ thuộc vào protein, có liên quan đến sự tiến triển của CKD. Những con chuột AdultMunich-Wistar đã được cắt bỏ 5/6 quả thận (Nx), được cho ăn bằng chế độ ăn ít protein và được chia thành hai nhóm. Chỉ có hàm lượng photphat (photphat thấp, LoP, 0. 2 phần trăm; photphat cao, HiP, 0. 95 phần trăm) chế độ ăn mới khác nhau. Sau sáu mươi ngày, các thông số sinh hóa vàquả thậnmô học đã được phân tích. Nhóm HiP cho thấy chức năng thận kém hơn, với mức PTH, FGF -23 cao hơn và sự bài tiết phân đoạn của photphat. Trong phân tích mô học của mô thận, họ cũng cho thấy tỷ lệ xơ hóa mô kẽ cao hơn, biểu hiện của -actin, PCNA vàthậnxâm nhập bởi đại thực bào. Nhóm LoP cho thấy sự biểu hiện beclin -1 cao hơn trong tế bào ống thận, một dấu hiệu của dòng chảy tự thực khi so sánh với nhóm HiP. Phát hiện của chúng tôi làm nổi bật hoạt động của photphat trong việc cảm ứngquả thậnviêm mô kẽ và xơ hóa, góp phần vào sự tiến triển của bệnh thận. Tác dụng có thể có của phosphate đối với sự rối loạn điều hòa cơ chế tự động của tế bào thận cần được nghiên cứu thêm bằng các nghiên cứu lâm sàng.
Từ khóa:phân lân;chế độ ăn; Suy thậnsự tiến triển;thậnxơ hóa; autophagy;sự chết tế bào
Đóng góp chính:Các cơ chế bảo vệ thận, bằng cách hạn chế chế độ ăn nhiều phosphat, vẫn chưa được xác định. Trong nghiên cứu này, quá tải phosphate tác động đến sự tiến triển của CKD bằng cách kích hoạt các con đường viêm và cảm ứngquả thậnxơ hóa mô kẽ. Ảnh hưởng của tăng phosphat máu đối với quá trình apoptosis của tế bào thận và các tế bào tự sinh thực vật cần được nghiên cứu thêm.
Cistanche tubulosa ngăn ngừa bệnh thận, bấm vào đây để lấy mẫu
1. Giới thiệu
Mãn tínhquả thậndịch bệnh (Suy thận) được coi là một vấn đề sức khỏe cộng đồng. Tỷ lệ mắc bệnh tăng theo độ tuổi và dao động từ 11 đến 13 phần trăm trên toàn thế giới [1]. Mặc dù CKD nói chung là một tình trạng không thể đảo ngược, một số phương pháp có thể được sử dụng để làm chậm sự tiến triển của bệnh, chẳng hạn như kiểm soát huyết áp, rối loạn lipid máu và tăng đường huyết, sử dụng thuốc ức chế men chuyển và chế độ ăn ít protein [2-7] . Trong số các chiến lược này, chế độ ăn ít protein là đề xuất gây tranh cãi cao nhất để trì hoãnquả thậnsuy giảm chức năng, do lo ngại về tính tuân thủ, an toàn và hiệu quả của nó. Sự thiếu đồng thuận về lợi ích của việc giảm protein trong khẩu phần phụ thuộc vào vai trò chồng chéo của protein và hàm lượng phosphat trong khẩu phần. Vì các nguồn protein giàu photphat, nên giảm lượng protein ăn vào để đạt được lượng photphat hạn chế. Có thể hạn chế protein mà không hạn chế photphat, mặc dù điều ngược lại là khó.
Trong các nghiên cứu thực nghiệm, tác dụng của chế độ ăn ít protein đã bảo vệ các mô hình CKD khỏi tổn thương cầu thận và protein niệu [8], thúc đẩy việc duy trì mức lọc cầu thận tốt hơn [9]. Cần lưu ý rằng protein và phosphat trong chế độ ăn có mối tương quan chặt chẽ với nhau. Do đó, mặc dù một số nghiên cứu thực nghiệm đã tập trung vào việc đánh giá tác động cô lập của việc hạn chế protein, chúng cũng có thể bị sai lệch do việc hạn chế phosphat vô tình. Mặt khác, sự đóng góp của từng cá nhân của chế độ ăn giàu phosphat đối với sự phát triển CKD đã được chứng minh rõ ràng [10,11]. Chế độ ăn giàu phốt phát đã được chứng minh là tạo ra nhiều kẽquả thậnxơ hóa và teo ống thận, với xơ vữa cầu thận tối thiểu, ở chuột tăng urê huyết. Điều thú vị là thiệt hại đã giảm bớt sau khi hạn chế phốt phát [12]. Lưu ý, hàm lượng protein trong chế độ ăn không được đề cập trong nghiên cứu này.
Trong tình huống lâm sàng, chế độ ăn ít protein làm giảm nồng độ chất độc urê huyết và bảo tồn chức năng thận còn sót lại, ngay cả trong quá trình chuyển đổi từ chế độ chăm sóc bảo tồn sang chế độ lọc máu gia tăng [13].Ăn kiêngchất đạmhạn chế cũng làm chậm tiến triển CKD trong một phân tích tổng hợp gần đây [14]. Tuy nhiên, vì việc hạn chế protein có tương quan với mức phosphat huyết thanh thấp hơn, tác dụng có lợi này của chế độ ăn có thể được giải thích một phần là do việc hạn chế phosphat. Nghiên cứu tiền cứu lớn nhất cho đến nay, MDRD [15], chỉ cho thấy một lợi ích nhỏ của chế độ ăn ít protein ở bệnh nhân suy thận trung bình, trong khi sự tiến triển của bệnh thận không bị ảnh hưởng ở bệnh nhân suy thận nặng. Tuy nhiên, hàm lượng phốt phát trong chế độ ăn không được đề cập trong thử nghiệm này và tác động của sự đóng góp của từng cá nhân trong việc làm chậmSuy thậnsự tiến triển vẫn chưa được biết.
Được biết, phốt phát có thể làm giảm Klotho trong thận và tuần hoàn [16], một loại protein chống lão hóa liên quan đến bảo vệ tế bào và chống xơ hóa, với tác dụng chống oxy hóa và chống nhiễm trùng [17]. Ngoài ra, quá trình tự động tự động bị lỗi trong tế bào thận do thiếu Klotho đã được chứng minh [18]. Autophagy là một quá trình dị hóa với các chức năng quan trọng trong việc duy trì cân bằng nội môi của tế bào và duy trì khả năng tồn tại của tế bào trong điều kiện căng thẳng. Một số bằng chứng cho thấy mối liên hệ giữa autophagy và sự tiến triển của CKD thông qua các con đường khác nhau, bao gồm cả tín hiệu TGF [19], một yếu tố tạo sợi mạnh cho sự phát triển của xơ hóa thận. TGF- ảnh hưởng đến một số quá trình sinh học, điều chỉnh sự tăng sinh và biệt hóa tế bào, quá trình apoptosis, và hoạt động bằng cách liên kết với các thụ thể xuyên màng cụ thể, tạo ra tín hiệu nội bào qua trung gian của các protein SMAD [20]. Apoptosis là một cơ chế chết tế bào theo chương trình khác với hoại tử. Phosphat đã được mô tả như một chất trung gian của quá trình apoptosis trong các mô hình thực nghiệm của tế bào nội mô [21], nguyên bào nuôi [22], và tế bào trung mô phúc mạc [23]. Có bằng chứng về sự tham gia của quá trình chết tế bào apoptotic trong sự tiến triển củaquả thậnchấn thương [24], nhưng ảnh hưởng của phosphate đối với quá trình apoptosis của tế bào thận vẫn chưa được làm sáng tỏ.
Vì cơ chế mà chế độ ăn nhiều phosphate làm tăng tốc độ tiến triển của CKD vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn, chúng tôi đã giả thuyết rằng nó có thể liên quan đến một người bị rối loạn chức năng autophagic. Do đó, trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã đánh giá hai nhóm chuột Munich-Wistar theo hàm lượng phốt phát trong chế độ ăn của chúng (0 thấp. 2 phần trăm so với cao 0. 95 phần trăm) và kiểm tra tác động của một chế độ ăn ít phốt phát trênthận'các thay đổi về mô học và hóa mô miễn dịch, bao gồm cả dấu hiệu autophagy, beclin -1.
2. Kết quả
Các thông số huyết động, hình thái và sinh hóa thu được từ nhóm chế độ ăn ít (LoP) và nhiều phosphat (HiP) được đưa ra trong Bảng 1. Như mong đợi, việc cắt bỏ thận 5 / 6- làm giảm độ thanh thải creatinin và tăng trong huyết thanh urê và creatinin ở cả hai nhóm. Động vật từ nhóm HiP có chức năng thận thấp hơn, bằng chứng là creatinine cao hơn và độ thanh thải creatinine thấp hơn; chúng cũng thể hiện hematocrit thấp hơn và trọng lượng cuối cùng thấp hơn. Nhóm HiP đã trình bày sự gia tăng bài tiết phosphate trong huyết thanh và phân đoạn, cũng như hormone tuyến cận giáp (PTH) và yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi -23 (FGF -23). Đáng chú ý, áp lực của đuôi, trọng lượng ban đầu và sự bài tiết albumin qua nước tiểu là tương tự nhau giữa các nhóm.
Các phát hiện mô học được thể hiện trong Hình 1–3. Bệnh xơ cứng cầu thận (GS) hầu như không được tìm thấy ở cả hai nhóm. Tuy nhiên, tỷ lệ xơ hóa mô kẽ cao hơn đáng kể ở những con chuột trong nhóm HiP. Theo đó, những con vật này cũng có tỷ lệ - khu vực nhuộm actin cơ trơn cao hơn và sự thâm nhập vào thận cao hơn bởi các đại thực bào, được đánh giá bằng biểu hiện ED -1, như được trình bày trong Bảng 2. Biểu hiện SMAD (p-SMAD) được phosphoryl hóa, dấu hiệu kích hoạt con đường TGF-beta, không khác nhau giữa các nhóm.
Các tế bào dương tính với kháng nguyên nhân tế bào tăng sinh (PCNA) chiếm ưu thế trong nhóm HiP, cho thấy rằng quá tải phosphate thúc đẩy tăng sinh tế bào thận mạnh hơn. Ngược lại, số lượng tế bào apoptotic có xu hướng cao hơn ở nhóm LoP. Tương tự như vậy, các tế bào beclin 1- dương tính cao hơn đáng kể trong các tổn thương mô kẽ ở nhóm LoP, điều này cho thấy tác dụng có thể có của phốt phát cao hơn trong việc ức chế quá trình tự thực tái sinh trênquả thậnkhăn giấy.
3. Thảo luận
Nghiên cứu thử nghiệm này đã điều tra xem việc hạn chế phosphate trong chế độ ăn uống có phải là một bước hiệu quả để làm chậm sự tiến triển của CKD hay không, bất kể việc hạn chế protein trong chế độ ăn uống đồng thời. Chúng tôi đã kiểm tra ảnh hưởng của chế độ ăn với các hàm lượng photphat khác nhau ({{0}}. 2 so với 0,95%) trong mô hình động vật cắt thận 5 / 6-, với tất cả động vật được ăn chế độ ăn ít protein (12 phần trăm). Phát hiện của chúng tôi cho thấy rằng chế độ ăn nhiều phốt phát có liên quan đến tăng phốt phát trong máu, mặc dù tăng PTH, FGF -23, và do đó, bài tiết theo phân đoạn của phốt phát. Ngoài ra, HiP gây suy giảm chức năng thận và gia tăng xơ hóa mô kẽ, có liên quan đến biểu hiện -actin cao hơn, thâm nhập đại thực bào và tăng sinh tế bào, cũng như ức chế quá trình tự động.
Một phân tích tổng hợp của 12 nghiên cứu thuần tập liên quan đến 25.546 bệnh nhân mắc bệnh thận mạn không lọc máu đã chứng minh mối liên quan độc lập giữa nồng độ phosphat huyết thanh,quả thậnthất bại, và tỷ lệ tử vong [25]. Hơn nữa, một nghiên cứu thuần tập hồi cứu trên 13.772 bệnh nhân sự cố lọc máu đã cho thấy mối liên quan giữa tăng phosphat máu và các bất thường khác của rối loạn CKD-khoáng và xương với sự suy giảm nồng độ dưquả thậnhàm [26]. Cơ chế hạn chế phosphate làm chậm tiến triển CKD vẫn chưa được thiết lập. Trong một nghiên cứu thử nghiệm, chúng tôi đã chỉ ra rằng chế độ ăn giàu photphat có liên quan đến chức năng thận bị suy giảm nhiều hơn, khi so sánh với chế độ ăn ít photphat ở chuột Wistar được phẫu thuật cắt tuyến cận giáp và cắt 5 / 6- thận, sử dụng tuyến cận giáp bổ sung nội tiết tố (PTH) [11]. Kusano và cộng sự. [1 0] cho thấy rằng việc bảo vệ chức năng thận có liên quan đến chế độ ăn ít photphat (0. 3 phần trăm), bất kể hàm lượng protein trong khẩu phần ở chuột tăng urê là bao nhiêu. Tuy nhiên, những con chuột có khẩu phần photphat bình thường (0,5%) chỉ mang lại những lợi ích này nếu được cho ăn với chế độ ăn rất ít protein (8,4%). Tổng hợp lại, những kết quả này cho thấy rằng vai trò của photphat trong chế độ ăn có thể mạnh hơn protein trong chế độ ăn. Tuy nhiên, cả hai nghiên cứu nêu trên đều không cố gắng điều tra các con đường tiềm ẩn có thể liên quan đến tổn thương thận liên quan đến phốt phát.
Tác động của quá tải phosphat trong tiến triển của bệnh thận mạn tính là chủ đề của một số nghiên cứu. Labels et al. lần đầu tiên đề xuất khả năng này ở mô hình động vật, nhưng protein [27] trong chế độ ăn không được kiểm soát, điều này có thể che mất tác dụng cô lập của photphat. Một lợi ích được cho là của việc hạn chế không phụ thuộc vào phosphat, chứ không phải là hạn chế protein trong kịch bản CKD, rất được quan tâm vì nguy cơ kiểm soát phosphat huyết thanh cùng với lượng protein bị hạn chế có thể dẫn đến suy dinh dưỡng và gây tử vong cao hơn.
Hàm lượng photphat trong khẩu phần không nhất thiết xác định nồng độ photphat trong huyết thanh ở bệnh nhân CKD [28], làm nổi bật tầm quan trọng của việc hạn chế khẩu phần không phụ thuộc vào nồng độ huyết thanh của nguyên tố này. Các tác động bệnh lý của phosphat trên xương và hệ tim mạch thúc đẩy các biện pháp can thiệp để điều trị chứng tăng phosphat máu. Trong thực hành lâm sàng, các biện pháp can thiệp để giảm nồng độ phosphat bao gồm hạn chế ăn kiêng và chất kết dính phosphat. Mặc dù lợi ích của cách tiếp cận này đối với các tiêu chí lâm sàng còn bị nghi ngờ trong một nghiên cứu quy mô mẫu nhỏ [29], đối mặt với kiến thức rằng dư thừa phốt phát là nguyên nhân dẫn đến việc sản xuất quá mức PTH và FGF -23, việc duy trì là hợp lý nồng độ phosphat càng thấp càng tốt ở bệnh nhân CKD [30].
Chế độ ăn ít protein gây ra khả dụng sinh học thấp của phosphat và làm giảm FGF -23 [31,32] huyết thanh, một chất trung gian tái hấp thu phosphat phụ thuộc natri trên tế bào ống thận. Điều này cho thấy rằng cơ chế điều hòa photphat trong bệnh CKD nâng cao bằng cách nào đó có thể bị ảnh hưởng bởi lượng photphat hấp thụ theo một cách hoàn toàn độc lập với hàm lượng protein trong khẩu phần ăn. Vì lý do này, chúng tôi đã đánh giá ảnh hưởng của hàm lượng photphat trong chế độ ăn uống đối với sự tiến triển của CKD, trong mô hình cắt thận 5 / 6-. Một nghiên cứu thực nghiệm trước đây đã chứng minh rằng phosphate có thể thay đổi phản ứng antiproteinuric đối với chế độ ăn rất ít protein (0. 3 g / kg), cho thấy mối tương quan giữa nồng độ phosphate huyết thanh và phosphat niệu với phản ứng antiproteinuric đối với chế độ ăn hạn chế protein, không phụ thuộc vào chức năng thận [33]. Trong một nghiên cứu chéo bao gồm 11 bệnh nhân bị CKD (eGFR 30–55 mL / phút / m2), nhịp sinh học của phốt phát huyết thanh bị thay đổi với chế độ ăn nhiều phốt phát, điều này không được giải thích bởi sự bài tiết phốt phát trong nước tiểu, PTH, hoặc FGF -23 [34]. Kết quả này củng cố tầm quan trọng của việc hạn chế ăn kiêng phosphat ở bệnh nhân CKD như một mục tiêu điều trị độc lập.
Tình trạng huyết động dường như không liên quan đến sự xấu đi của chức năng thận ở nhóm HiP, vì áp lực động mạch ở cả hai nhóm tương tự nhau. Ngoài ra, chúng tôi không có tổn thương cầu thận đáng kể nào trong mô hình của chúng tôi, điều này có thể được giải thích là do hạn chế protein. Tuy nhiên, chúng tôi ghi nhận nhiều bệnh lý kẽ trong nhóm ăn kiêng HiP.
Xơ hóa mô kẽ có tương quan tốt với mất chức năng thận ở người và chuột.
Một nghiên cứu trước đây đã chỉ ra sự phát triển của chứng suy thận do chế độ ăn nhiều phosphat thông qua peptidyl-prolyl isomerase Pin 1 [35], trong khi các bài báo khác đã chỉ ra vai trò có hại của aKlotho de fi ciency đối vớiquả thậnmô fi brosis [36,37]. Sự xóa bỏ di truyền của Klotho, trong các mô hình thử nghiệm, gây ra lão hóa, chậm phát triển và canxi hóa [38]. FGF 23- Tín hiệu Klotho ức chế tái hấp thu phosphat ở thận. Trong cơ sở suy thận, biểu hiện Klotho giảm ở ống thận [39]. Hơn nữa, chế độ ăn giàu phốt phát đã làm trầm trọng thêm tình trạng thiếu máu trong mô hình tổn thương thận cấp do thiếu máu cục bộ-tái tưới máu và tiếp tục thúc đẩy gia tăngquả thậnxơ hóa mô, đẩy nhanh sự tiến triển của CKD [18]. Sự kết hợp của chế độ ăn uống chứa phosphat đối với biểu hiện thận của Klotho đã được chứng minh trong các mô hình chó [40]. Có thể, trong số các con đường khác, quá tải phosphat làm xấu đi chức năng thận bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện Klotho trên các tế bào ống; nó cần được nghiên cứu thêm trong các nghiên cứu trong tương lai.
Apoptosis và fi brosis được trung gian bởi các cytokine, chẳng hạn như TGF- [41,42]. Chúng tôi đã mô tả mối liên quan của cường cận giáp thứ phát và hậu quả là biểu hiện TGF cao hơn trong quá trình tái tạo tim [43]. Người ta cho rằng có mối liên quan giữa sự hoạt hóa PTH và tín hiệu TGF- kích thích sự tăng sinh của nguyên bào nuôi, tổng hợp collagen, và sự hình thành mạch máu. Thậm chí còn có bằng chứng thực nghiệm về hoạt động tích hợp của các thụ thể TGF- và PTH trên tế bào xương, điều chỉnh tín hiệu tái tạo xương [44]. Vai trò của tín hiệu TGF- / Smad trongquả thậnbệnh đã được mô tả. TGF- liên kết với một thụ thể xuyên màng, kích hoạt quá trình phosphoryl hóa các protein Smads, và thúc đẩy sự chuyển vị của chúng vào nhân để tạo ra các hiệu ứng phiên mã. Do đó, chúng rất cần thiết cho việc truyền tín hiệu của các thành viên trong gia đình TGF-. Thật vậy, sự biểu hiện quá mức của các protein Smad2 và Smad3 trong thận brotic ở các mô hình động vật mắc bệnh CKD đã được chứng minh [45]. Điều thú vị là có bằng chứng về sự kích hoạt Smads bởi các chất trung gian khác độc lập với TGF-, chẳng hạn như các sản phẩm cuối quá trình glycation nâng cao [46] và angiotensin II [47]. Vì ảnh hưởng của tăng phosphat máu lên sự tiến triển của CKD không được chứng minh bằng sự thay thế PTH trong một mô hình thử nghiệm [11], chúng tôi tự hỏi liệu phosphat có đóng vai trò trực tiếp trong việc truyền tín hiệu Smad ở thận hay không. Trong mô hình của chúng tôi, không có hiện tượng tăng phosphat máu khi biểu hiện p-Smad trong tế bào ống thận.
Tuy nhiên, điều này không loại trừ khả năng kích hoạt con đường TGF độc lập với quá trình phosphoryl hóa Smads. Các nghiên cứu sâu hơn là cần thiết để điều tra con đường thay thế này.
Khi đánh giá mô xương, quá tải phosphate đã gây ra quá trình apoptosis của các tế bào giống như nguyên bào xương [22]. Rojas và cộng sự. đã chứng minh trong sinh thiết xương của những bệnh nhân được cấy ghép rằng số lượng tế bào apoptotic cao hơn ở những người có phosphat thấp và PTH sẽ có tác dụng làm tăng nguyên bào xương và ngăn ngừa quá trình apoptosis [48]. Tác dụng ức chế này của PTH đối với quá trình tự chết của tế bào xương đã được chứng minh trước đây [49]. Bên cạnh những ảnh hưởng đến mô xương, con đường apoptotic cũng liên quan đến suy thận cấp [48] và có thể là chất trung gian có thể dẫn đến sự tiến triển của CKD. Trong mô hình của chúng tôi, chúng tôi đã quan sát thấy tỷ lệ tế bào trải qua quá trình apoptosis vượt trội trong nhóm LoP, không liên quan đến thống kê. Những cân nhắc này cho thấy cơ chế apoptosis bị suy giảm do tăng phosphat máu. Tuy nhiên, chúng ta phải lưu ý rằng không thể đánh giá tác dụng độc quyền của phốt phát đối vớiquả thậnapoptosis của mô một khi động vật cũng đã phát triển PTH và FGF -23 cao.
Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã giải quyết một cơ chế khác có thể gây suy thận do chế độ ăn nhiều phosphate, rối loạn chức năng autophagy, bằng cách đo protein beclin -1, một loại protein điều hòa cần thiết cho sự tạo mầm màng thực quản [50]. Autophagy là một con đường dị hóa liên quan đến sự suy thoái của các thành phần tế bào thông qua các lysosome [51,52]. Quá trình phosphoryl hóa Beclin -1 được coi là tín hiệu tự động xác định cho quá trình kích hoạt và tuyển dụng phức hợp phosphatidylinositol -3- phosphatidylinositol -3- đến các vị trí màng sinh học autophagosome [53]. Sự hạ gục của beclin -1 ngăn chặn quá trình tự động [54] và tái tưới máu do thiếu máu cục bộ làm tăng mức độ của nó [55]. Việc giảm beclin - 1 và đồng thời điều hòa mTOR làm giảm sự phát triển của các tế bào ác tính, làm nổi bật tác dụng nâng cao khả năng sống sót của autophagy [52].
Tác dụng chống xơ hóa của Klotho cũng liên quan đến quá trình tự động điều hòa, một con đường dẫn đến tổn thương do thiếu máu cục bộ trong mô hình AKI và bị suy giảm do nồng độ phosphat cao [18]. Các nghiên cứu thực nghiệm đã chỉ ra rằng thông lượng autophagic làm giảm sự xâm nhập của đại thực bào và xơ hóa thận do phosphat. Ngoài ra, môi trường giàu phosphat gây ra hiện tượng mitophagy trong tế bào hình ống trong ống nghiệm [56]. Dữ liệu của chúng tôi cho thấy rằng hàm lượng phốt phát trong chế độ ăn cũng điều chỉnh sự biểu hiện của beclin -1 trong ống thận in vivo. Chế độ ăn kiêng HiP cũng có liên quan đến sự tăng sinh tế bào nhiều hơn và xu hướng hướng tới tỷ lệ chết rụng thấp hơn, như được mô tả bởi phân tích PCNA và TUNEL, tương ứng. Tuy nhiên, trong mô hình của chúng tôi, không thể xác định được liệu điều này xảy ra do ảnh hưởng trực tiếp của quá tải phốt phát hay do bất thường về mức PTH và FGF -23 gây ra bởi tăng phốt phát trong máu. Phát hiện này cần được xác nhận trong một kịch bản lâm sàng.
Ưu điểm chính của nghiên cứu này là đánh giá tác động của việc hạn chế phosphat trong chế độ ăn ít protein đối với sự tiến triển của bệnh thận mạn tính, bao gồm điều tra về ảnh hưởng của nó đối với các kiểu mô học và kiểu hình phân tử củaquả thậnkhăn giấy. Theo những gì chúng tôi biết, đây là nghiên cứu đầu tiên chứng minh sự điều biến của biểu hiện beclin -1, một dấu hiệu autophagy trên tế bào ống thận, bằng chế độ ăn uống chứa phosphate in vivo. Hạn chế chính là không thể phân biệt ảnh hưởng của tăng phosphat máu với các bất thường khác liên quan đến CKD-MBD, chẳng hạn như tăng PTH và FGF -23. Chúng tôi cũng không thể đánh giá chế độ ăn có hàm lượng phosphate trung bình hoặc biểu hiện Klotho ở thận. Tuy nhiên, mô hình của chúng tôi mô phỏng lại tình trạng thực tế, trong đó chế độ ăn kiêng HiP thường có liên quan đến cường cận giáp và mức FGF cao -23.
4.Kết luận
Tóm lại, nghiên cứu này đã cung cấp bằng chứng cho thấy chế độ ăn nhiều phosphat đóng một vai trò trong sự tiến triển của bệnh thận mạn tính, có thể làm tăng xơ hóa mô kẽ. Hơn nữa, một chế độ ăn giàu phốt phát có thể sửa đổiquả thậnquá trình autophagy. Việc xác định một con đường không phụ thuộc vào protein mà qua đó phosphat làm suy giảm chức năng thận có thể mở ra một con đường quan trọng cho việc phát triển các phương pháp tiếp cận mới nhằm ngăn ngừa hoặc làm giảm sự tiến triển của CKD trong bệnh cảnh lâm sàng.
5. Vật liệu và Phương pháp
Những con chuột Munich-Wistar đực trưởng thành thu được từ một cơ sở địa phương được đưa vào nghiên cứu này. Chuột được duy trì ở 23 ± 1 ◦C, với độ ẩm không khí là 60 ± 5 phần trăm, theo chu kỳ sáng-tối 12: 12- h. Tất cả động vật được sử dụng nước máy miễn phí và được cho ăn chế độ ăn ít protein (12% protein). Hai tháng sau, các con vật được hiến tế khi máu, nước tiểu và mô thận được phân tích. Áp lực vòng bít, độ thanh thải creatinin và sự bài tiết albumin trong nước tiểu hàng ngày được xác định ở tất cả các con chuột. Thiết kế thí nghiệm được trình bày trong Phụ lục A (Hình A1).
5.1. Kỹ thuật phân tích
Sáu mươi ngày sau Nx, động vật được gây mê bằng natri thiopental (50 mg / kg BW), và các mẫu máu được thu thập. Nồng độ creatinin huyết thanh được đánh giá bằng phương pháp so màu. Albumin huyết thanh, phosphat, urê, canxi và hematocrit được đo bằng phương pháp tiêu chuẩn. PTH được đo bằng ELISA (Immutopics, San Clemente, CA, USA). FGF -23 được đo bằng bộ công cụ ELISA (KAINOS, Nhật Bản) theo giao thức của nhà sản xuất. Chúng tôi tính toán độ lọc cầu thận theo độ thanh thải creatinin dựa trên nồng độ creatinin huyết thanh và nước tiểu và biểu thị bằng ml / phút, được tính theo công thức: creatinin nước tiểu (mg / dL) × nước tiểu đồng (mL / phút) / creatinin huyết thanh (mg / dL). Albumin nước tiểu được xác định bằng phương pháp khuếch tán miễn dịch xuyên tâm.
-phần thứ ba bên tráiquả thậndo sự đóng của hai hoặc ba nhánh của động mạch thận trái. Những con chuột được phẫu thuật giả được gây mê và thao tác các cuống thận mà không làm giảm khối lượng thận. Sau khi hồi phục sức khỏe sau khi gây mê, các con vật được đưa trở lại lồng cũ và được sưởi ấm trong 24 giờ sau đó.
Sự bài tiết theo phân đoạn của phosphate (FEP) thu được thông qua nước tiểu và serumphosphate (mg / dL), creatinine nước tiểu và huyết thanh (mg / dL), và được biểu thị bằng phần trăm, với công thức sau: (nước tiểu / phốt phát huyết thanh) / (nước tiểu / huyết thanh creatinin) × 100.
5.2. Nhóm thử nghiệm
Động vật được chia thành hai nhóm theo hàm lượng phốt phát trong chế độ ăn, được xác định dưới đây: Chế độ ăn ít phốt phát (LoP): n=20; động vật nhận được chế độ ăn TD -90016, 12% protein, được cải tiến để có 0. 2% nồng độ photphat. Chế độ ăn có hàm lượng photphat cao (HiP): n=19; động vật nhận được TD -90016, chế độ ăn 12 phần trăm protein, được cải tiến để có 0. 95 phần trăm nồng độ phốt phát.
5.3. Kỹ thuật mô học
Tàn dưquả thậnđược truyền tại chỗ tại MAP quan sát được bằng dung dịch nước muối và sau đó bằng dung dịch Duboscq-Brasil để cố định. Sau khi được cân, hai lát thận giữa thận được cố định trong dung dịch đệm 4% formaldehyde. Mô thận sau đó được nhúng vào parafin và chuẩn bị cho phép đo mô hình học, và hóa mô miễn dịch như đã mô tả trước đây [57].
Tất cả các đánh giá hình thái học được thực hiện trong các phần dày 4- µm bởi một người quan sát duy nhất bị mù trước các nhóm. Đối với mỗi con chuột, mức độ nghiêm trọng của chứng xơ cứng cầu thận (GS) được ước tính, trong các phần được nhuộm bằng axit định kỳ Schiff (PAS), bằng cách ấn định cho mỗi cầu thận (ít nhất 120 mỗi con chuột được kiểm tra) một điểm số để ước tính phần bị xơ cứng của vùng búi , và lấy chỉ số GS (GSI) cho mỗi con chuột như đã mô tả trước đây [58]. Để đánh giá mức độ giãn nở của mô kẽ, người ta ước tính tỷ lệ phần trăm diện tích vỏ thận bị xơ hóa mô kẽ (phần trăm IF) trong các phần được nhuộm Masson bằng kỹ thuật đếm điểm [59].
5.4. Hóa mô miễn dịch
Phần thận nhúng parafin dày 4 µm được gắn trên lam kính phủ 6% silan. Các phần đã được khử khoáng, bù nước, và sau đó được làm nóng trong dung dịch đệm xitrat để tăng cường khả năng thu hồi kháng nguyên. Chúng được ủ trước với 5% huyết thanh thỏ bình thường (đối với ED -1) hoặc ngựa (đối với -actin) trong dung dịch muối đệm Tris (TBS) hoặc dung dịch Khối protein dựa trên casein (Khối Protein; DAKO Corporation, Santa Clara, CA, USA (dành cho PCNA, pSmad vàBeclin)), để ngăn chặn sự liên kết không đặc hiệu. Ủ với kháng thể chính được thực hiện qua đêm ở 4 ◦C. Các đối chứng âm tính được thực hiện bằng cách bỏ qua kháng thể chính.
Các kháng thể chính sau đây đã được sử dụng: kháng thể đơn dòng chống chuột ED -1 (Serotec, Oxford, Vương quốc Anh), để phát hiện đại thực bào; chuột đơn dòng chống alpha trơn (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA), để phát hiện -actin; kháng thể đa dòng kháng Beclin 1 (Boster, Pleasanton, CA, USA), để phân tích tự động. Sau khi rửa sạch, các phần được ủ với IgG chống chuột đánh dấu biotin (H cộng với L), (Vector, Burlingame, CA, USA) trong 45 phút, tiếp theo là VECTASTAIN® ABC-AP Kit, Vector® Red (Vector, Burlingame, CA , Hoa Kỳ) trong 30 phút. Các phần sau đó được phát triển bằng dung dịch thuốc nhuộm màu đỏ nhanh.
Đối với kháng nguyên nhân tế bào chống tăng sinh đơn dòng của chuột (Dako, Đan Mạch) và kháng thể phosphor-smad2 (Ser465 / 467) (Tín hiệu tế bào, Danvers, MA, Hoa Kỳ), sự ức chế peroxidase nội sinh được thực hiện với dung dịch hydrogen peroxide 3% và methanol trong 30 tối thiểu Sau đó, các phần này được ủ qua đêm với kháng thể chính trong một buồng được làm ẩm ở 4 ◦C. Ngày hôm sau, các phần được ủ với IgG chống chuột được đánh dấu sinh học (H cộng với L) hoặc IgG chống chuột được đánh dấu sinh học (H cộng với L) (Vector, Burlingame, CA, USA) trong 45 phút, tiếp theo là ủ với VECTASTAIN® ABC- HRP Kit (Vector, Burlingame, CA, USA) trong 30 phút. Sau đó, các phần được phát triển bằng cách sử dụng chromogen cơ chất 3- amino -9- ethyl carbazole (AEC) (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Tất cả các phần được rửa trong nước cất, được pha bằng dung dịch Hemalum của Mayer (Merck, Darmstadt, Đức) được phủ bằng glycerin-gelatin của Kaiser (Merck, Darmstadt, Đức).
Để ước tính mật độ thận mô kẽ của ED -1, p-Smad, Beclin và PCNA, số lượng tế bào dương tính / mm2 được đánh giá theo cách làm mù ở độ phóng đại 400 lần. Để đánh giá -actin, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật đếm điểm, sử dụng kính hiển vi có mắt điểm 100- được kết nối với màn hình video. Chúng tôi đã phân tích 25 trường dưới độ phóng đại 3200. Kết quả được biểu thị bằng tỷ lệ phần trăm khi xét trên tổng diện tích.
5.5. Sự chết tế bào
Apoptosis được xác định trong các tế bào ống thận bằng kỹ thuật TUNEL (ghi nhãn cuối X-dUTP Nick qua trung gian TdT) sử dụng các hướng dẫn được cung cấp bởi Apoptag plusPeroxidase trong Situ Apoptosis Detection Kit (S7101, Millipore Sigma, MA, USA). Các tế bào apoptotic được phân tích trong 25 trường, với độ phóng đại 1000 ×, để thu được giá trị cuối cùng được biểu thị bằng ô / mm2.
5.6. Phân tích thống kê
Sự khác biệt giữa các nhóm LoP và HiP đã được kiểm tra bằng cách sử dụng bài kiểm tra của Học sinh độc lập hoặc bài kiểm tra Mann-Whitney cho phù hợp. Mối quan hệ giữa các biến được kiểm tra bằng hệ số tương quan Spearman. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SE trừ khi có chỉ định khác. Giá trị p của<0.05 was="" considered="" significant.="" analyses="" were="" performed="" using="" ibm="" spss="" statistics,="" version="" 20.0.1="" (ibm="" corp.,="" armonk,="" ny,="" usa)="" and="" graphpad="" prism9.1.2="" statistical="" software="" (graphpad,="" san="" diego,="" ca,="">
Kinh phí:Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi Quỹ Nghiên cứu Sáo Paulo (FAPESP — Grant #. 2010 / 05409-6). Moyses, Jorgetti, Zatz và Elias được hỗ trợ bởi CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnol6gico), nhưng sự hỗ trợ tài chính này không có vai trò gì trong việc viết bài báo này.
Tuyên bố của Hội đồng Rà soát Thể chế:Nghiên cứu này được thực hiện theo khuyến nghị của hội đồng xét duyệt đạo đức địa phương. Quy trình đã được Comite detica em Pesquisa do Bệnh viện das Clinicas da Faculdade de Medicina da USP phê duyệt (CEUA, quy trình số 090/10 và ngày phê duyệt 10 tháng 8 năm 2010). Tất cả các quy trình thí nghiệm đều tuân thủ nghiêm ngặt các tiêu chuẩn quốc tế về thao tác và chăm sóc động vật thí nghiệm.
Tuyên bố về tính sẵn có của dữ liệu:Dữ liệu được trình bày trong nghiên cứu này có sẵn theo yêu cầu của tác giả tương ứng.
Sự nhìn nhận:Các tác giả cảm ơn Wagner Dominguez về sự hỗ trợ kỹ thuật của chuyên gia. Các vấn đề lợi ích: Các tác giả tuyên bố không có xung đột lợi ích.
Người giới thiệu
1. Đồi, KBT; Fatoba, ST; Oke, JL; Hirst, JA; O'Callaghan, CA; Lasserson, DS; Hobbs, FD Tỷ lệ mắc bệnh mãn tính trên toàn cầuquả thậnbệnh — Một đánh giá có hệ thống và phân tích tổng hợp. PLoS ONE 2016, 11, e0158765.
2. Ôn, CP; Chang, CH; Tsai, MK; Lee, JH; Lu, PJ; Tsai, SP; Ôn, C.; Chen, CH; Kao, CW; Tsao, CK; et al. Bệnh tiểu đường sớmquả thậntham gia có thể rút ngắn tuổi thọ 16 năm. Thận Int. 2017, 92, 388–396.
3. Kakinuma, Y. Kawamura, T.; Hối phiếu, T.; Yoshioka, T.; Ichikawa, tôi; Fogo, A. Tác dụng ức chế angiotensin không phụ thuộc vào huyết áp trên tổn thương mạch máu của suy thận mạn.Quả thậnInt. Năm 1992, 42, 46–55.
4. Chiên, LF; Orchard, TJ; Kasiske, BL Ảnh hưởng của giảm lipid đối với sự tiến triển của bệnh thận: Một phân tích tổng hợp.Quả thậnInt. 2001, 59, 260–269.
5. Ishidoya, S.; Morrissey, J .; McCracken, R .; Reyes, A. .; Thuốc đối kháng thụ thể Klahr, S. Angiotensin II cải thiện tình trạng tắc nghẽn ống thận do tắc nghẽn niệu quản một bên.Quả thậnInt. 1995, 47, 1285–1294.
6. Audigier, JC; Kanjanbuch, T.; Ma, LJ; Màu nâu, NJ; Fogo, AB Sự thoái lui của bệnh xơ cứng cầu thận hiện có bằng cách ức chế aldosterone. Mứt. Soc. Nephrol. 2005, 16, 3306–3314.
7. Nath, KA; Kren, SM; Hostetter, TH Hạn chế protein trong chế độ ăn ở chuột đã bị tổn thương thận. Vai trò chọn lọc của áp lực mao mạch cầu thận trong rối loạn chức năng cầu thận tiến triển. J. Clin. Điều tra. 1986, 78, 1199–1205.
8. Brenner, BM; Meyer, TW; Hostetter, TH Lượng protein trong chế độ ăn uống và bản chất tiến triển củaquả thậnBệnh tật: Vai trò của tổn thương cầu thận qua trung gian huyết động trong cơ chế bệnh sinh của bệnh xơ cứng cầu thận tiến triển trong lão hóa, cắt bỏ thận và bệnh thận nội tại. N. Engl. J. Med. 1982, 307, 652–659.
9. Bellizzi, V. Chế độ ăn ít protein hoặc liệu pháp dinh dưỡng trong bệnh mãn tínhquả thậndịch bệnh? Máu Purif. 2013, 36, 41–46.
10. Kusano, K.; Segawa, H.; Ohnishi, R .; Fukushima, N.; Miyamoto, K. Vai trò của chế độ ăn ít protein và ít phốt pho trong quá trình tiến triển của bệnh mãn tínhquả thậnbệnh ở chuột urê huyết. J. Nutr. Khoa học. Vitam. 2008, 54, 237–243.
11. Neves, KR; Graciolli, FG; dos Reis, LM; Pasqualucci, CA; Moyses, RM; Jorgetti, V. Tác dụng có hại của tăng phosphat máu đối với phì đại cơ tim, chức năng thận và xương ở chuột bị suy thận.Quả thậnInt. 2004, 66, 2237–2244. [CrossRef] [PubMed]
12. Finch, JL; Lee, DH; Liapis, H.; Ritter, C.; Zhang, S.; Suarez, E.; Ferder, L.; Slatopolsky, E. Hạn chế photphat đáng kể không thể làm giảm tỷ lệ tử vong ở chuột tăng urê huyết có calci mạch máu đã được hình thành. Thận Int. 2013, 84, 1145–1153.
13. Cupisti, A.; Blasco, P.; D'Alessandro, C.; Giannese, D.; Sabatino, A. .; Fiaccadori, E. Bảo vệ chức năng thận còn sót lại và điều trị dinh dưỡng: Chiến lược bước đầu để giảm độc tố urê huyết ở bệnh nhân bệnh thận giai đoạn cuối. Độc tố 2021, 13, 289.
14. Yan, B.; Su, X.; Xu, B.; Qiao, X. .; Wang, L. Ảnh hưởng của việc hạn chế protein trong chế độ ăn uống đối với sự tiến triển của bệnh mãn tínhquả thậnbệnh: Một đánh giá có hệ thống và phân tích tổng hợp. PLoS ONE 2018, 13, e0206134. [CrossRef] [PubMed]
15. Klahr, S.; Levey, AS; Beck, GJ; Caggiula, AW; Hunsicker, L.; Kusek, JW; Striker, G. Ảnh hưởng của chế độ ăn hạn chế protein và kiểm soát huyết áp đối với sự tiến triển của bệnh thận mãn tính. Chế độ ăn kiêng trong nhóm nghiên cứu bệnh thận. N. Engl.
J. Med. 1994, 330, 877–884. [CrossRef]
16. Hơ, MC; Shi, M.; Cho, HJ; Adams-Huet, B.; Paek, J .; Hill, K .; Shelton, J.; Amaral, AP; Faul, C.; Taniguchi, M.; et al. Klotho và phosphat là những chất điều chỉnh của quá trình tái tạo lại tim mạch urê huyết bệnh lý. Mứt. Soc. Nephrol. 2015, 26, 1290–1302.
17. Hu, MC; Shi, M.; Cho, HJ; Zhang, J .; Pavlenco, A. .; Liu, S.; Sidhu, S .; Hoàng, LJ; Moe, OW Thụ thể erythropoietin là tác nhân cuối cùng của quá trình bảo vệ tế bào do Klotho gây ra. Thận Int. 2013, 84, 468–481.
18. Shi, M.; Flores, B.; Mang, N.; Bian, A.; Cho, HJ; Yan, S .; Liu, Y. Levine, B.; Moe, OW; Hu, MC alphaKlotho làm giảm sự tiến triển của AKI thành CKD thông qua việc kích hoạt autophagy. Mứt. Soc. Nephrol. 2016, 27, 2331–2345.
19. Ding, Y. Kim, S.; Lee, SY; Koo, JK; Wang, Z .; Choi, ME Autophagy điều chỉnh sự biểu hiện TGF-beta và ngăn chặnquả thậnxơ hóa do tắc nghẽn niệu quản một bên. Mứt. Soc. Nephrol. 2014, 25, 2835–2846.
20. Moustakas, A.; Souchelnytskyi, S .; Heldin, CH Smad điều hòa trong dẫn truyền tín hiệu TGF-beta. J. Cell Sci. 2001, 114, 4359–4369.
