Đầu đọc RNA M6 A YTHDF2 kiểm soát khả năng chống ung thư và miễn dịch chống vi-rút của tế bào NK Phần 3

YTHDF2 cần thiết cho các chức năng sống sót, tăng sinh và tác động của tế bào NK qua trung gian IL-15

IL-15 là một trong những cytokine quan trọng nhất đối với chức năng đa hướng của tế bào NK. Trước đây, chúng tôi và những người khác đã phát hiện ra rằng IL-15 đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh các chức năng cân bằng nội môi, khả năng sống sót và tác động của tế bào NK (Becknell và Caligiuri, 2005; Carsonet al., 1997; Carson và cộng sự, 1994; Wang và cộng sự, 2019b; Yu và cộng sự, 2013).

Tính đa dạng của tế bào đề cập đến khả năng thực hiện các chức năng khác nhau của chúng trong các môi trường khác nhau. Tính đa dạng của tế bào có liên quan chặt chẽ đến khả năng miễn dịch vì nhiều tế bào trong hệ thống miễn dịch có thể đóng nhiều vai trò khác nhau.

Trong hệ thống miễn dịch, tế bào T là một loại tế bào rất quan trọng. Chúng nhận biết và tấn công mầm bệnh, đồng thời điều chỉnh hoạt động của các tế bào miễn dịch khác. Tính đa năng của tế bào T rất quan trọng vì khi hệ thống miễn dịch gặp mầm bệnh mới, tế bào T cần đóng các vai trò khác nhau trong thời gian ngắn để phản ứng hiệu quả. Ví dụ, khi hệ thống miễn dịch gặp nhiễm trùng do vi khuẩn, tế bào T cần đóng vai trò tiêu diệt vi khuẩn và khi hệ thống miễn dịch gặp nhiễm virus, tế bào T cần đóng vai trò điều hòa các tế bào miễn dịch khác.

Ngoài ra, trong hệ thống miễn dịch, một loại tế bào gọi là đại thực bào cũng có tác dụng đa hướng. Chúng có thể thực bào và phá vỡ các mầm bệnh lạ, đồng thời cũng có thể kích hoạt các tế bào miễn dịch khác để tấn công mầm bệnh. Tính đa dạng của đại thực bào rất quan trọng vì chúng cần đóng những vai trò khác nhau trong các môi trường khác nhau. Ví dụ, trong nhiễm virus, đại thực bào cần tiết ra một số chất để chống lại virus, trong khi trong nhiễm trùng do vi khuẩn, đại thực bào cần nhấn chìm và tiêu hóa vi khuẩn để loại bỏ mầm bệnh.

Tóm lại, có một mối quan hệ chặt chẽ giữa tính đa dạng của tế bào và khả năng miễn dịch. Các tế bào đa năng có thể đóng các vai trò khác nhau trong môi trường bị nhiễm các mầm bệnh khác nhau, do đó tăng cường khả năng đáp ứng của hệ thống miễn dịch và cải thiện khả năng miễn dịch của cơ thể đối với các mầm bệnh khác nhau. Vì vậy, chúng ta nên chú ý đến tính đa năng của tế bào, đồng thời tăng cường nuôi dưỡng khả năng miễn dịch để duy trì sức khỏe con người. Có thể thấy rằng chúng ta cần cải thiện trí nhớ và Cistanche Deserticola có thể cải thiện đáng kể trí nhớ, bởi vì Cistanche Deserticola cũng có thể điều chỉnh sự cân bằng của các chất dẫn truyền thần kinh, chẳng hạn như tăng mức độ acetylcholine và các yếu tố tăng trưởng. Những chất này rất quan trọng cho trí nhớ và học tập. Ngoài ra, Cistanche Deserticola cũng có thể cải thiện lưu lượng máu và thúc đẩy quá trình cung cấp oxy, điều này có thể đảm bảo não nhận đủ chất dinh dưỡng và năng lượng, từ đó cải thiện sức sống và sức bền của não.

Bấm vào biết cách để cải thiện trí nhớ của bạn

Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi chỉ ra rằng IL{0}} đã điều chỉnh tăng mức độ mRNA và protein của YTHDF2 trong tế bào NK (Hình 6 A; và Hình 1, D–F). Do đó, chúng tôi suy đoán rằng YTHDF2 là cần thiết cho chức năng tác động và sống sót qua trung gian IL-15 của tế bào NK.

Trước tiên, chúng tôi đã cố gắng xác định các yếu tố phiên mã tiềm năng ở hạ lưu tín hiệu IL{0}} điều chỉnh trực tiếp biểu hiện YTHDF2. Chúng tôi đã phân tích Bách khoa toàn thư về các thành phần DNA bằng cách sử dụng Cơ sở dữ liệu trình duyệt bộ gen của Đại học California, Santa Cruz (https://genome.ucsc.edu), nơi cung cấp dự đoán về các vị trí liên kết trên toàn bộ bộ gen, kết hợp với JASPAR (http://jaspar.genereg .mạng lưới).

Chúng tôi nhận thấy rằng STAT5, là yếu tố hạ lưu chính của IL-15 trong các ô NK, có bốn vị trí liên kết trong phạm vi 2 kb ngược dòng so với vị trí bắt đầu phiên mã (TSS) của Ythdf2, cho thấy rằng IL-15 có thể tích cực điều chỉnh phiên mã Ythdf2 trong tế bào NK của chuột thông qua STAT5.

Bằng cách sử dụng chất ức chế STAT5 STAT5-IN-1 (Müller và cộng sự, 2008), chúng tôi đã chứng minh rằng sự ức chế STAT5 dẫn đến giảm Ythdf2 ở cả mức mRNA và protein trong tế bào NK ở chuột (Hình S4, A và B). Để xác nhận thêm rằng YTHDF2 là yếu tố hạ nguồn do STAT5 điều chỉnh, chúng tôi đã sử dụng chuột Stat5fl/fl Ncr1-iCre (sau đây gọi là chuột Stat5ΔNK), trong đó STAT5 được xóa cụ thể trong các tế bào NK của chuột (Wiedemann et cộng sự, 2020).

Chúng tôi đã xử lý các tế bào láchNK từ chuột Stat5WT và Stat5ΔNK bằng IL-15. Chúng tôi nhận thấy rằng YTHDF2 giảm đáng kể số lượng tế bào NK từ chuột Stat5ΔNK so với tế bào NK từ chuột Stat5WT ở cả mức RNA và mức protein (Hình 6, B và C; và Hình S4, C và D).

Thử nghiệm của phóng viên Luciferase cho thấy cả STAT5a và STAT5b đều kích hoạt phiên mã gen Ythdf2 trực tiếp (Hình 6, D và E). Kết quả tăng cường miễn dịch nhiễm sắc thể (ChIP) –qPCR cho thấy STAT5 có mức độ làm giàu đáng kể trên bốn vị trí so với kiểm soát IgG thông thường, cho thấy sự liên kết trực tiếp trong tế bào NK của chuột (Hình 6 F). Cùng với nhau, các kết quả của chúng tôi chứng minh rằng biểu hiện YTHDF2 được điều chỉnh bởi STAT5 ở hạ lưu tín hiệu IL-15 trong các tế bào NK.

Sau đó, chúng tôi tự hỏi liệu các tế bào NK thiếu hụt Ythdf{0}}có bị khiếm khuyết trong phản ứng với IL-15 hay không. Chúng tôi đã phân lập các tế bào NK lách từ chuột Ythdf2ΔNK và chuột Ythdf2WT rồi nuôi cấy chúng trong ống nghiệm với sự có mặt của IL-15. Chúng tôi thấy rằng sự tăng trưởng của tế bào NK giảm đáng kể ở chuột Ythdf2ΔNK so với chuột Ythdf2WT (Hình 6 G). Thử nghiệm dán nhãn CellTrace Violet (CTV) cho thấy rằng sự tăng sinh của các tế bào NK bị suy giảm do thiếu hụt Ythdf2 (Hình 6 H).

 Phân tích phân bố chu trình tế bào cho thấy tỷ lệ tế bào NK từ chuột Ythdf2ΔNK tăng lên đáng kể trong pha G0/G1 nhưng tỷ lệ tế bào NK từ chuột Ythdf2ΔNK trong pha S giảm đáng kể (Hình 6 I), cho thấy rằng kết quả là thiếu hụt Ythdf2 trong việc bắt giữ pha G0/G1 trong các tế bào NK.

Ngoài ra, số lượng tế bào NK apoptotic (annexin V+Sytox-Blue+/−) tăng gấp hai đến ba lần từ chuột Ythdf2ΔNK so với các tế bào từ chuột Ythdf2WT (Hình 6 J), cho thấy khả năng sống sót bị khiếm khuyết của các tế bào NK sau khi mất Ythdf2. Những kết quả này cho thấy YTHDF2 điều chỉnh khả năng đáp ứng của tế bào NK với IL-15 trong ống nghiệm. Vì IL{10}} được dịch mã kém và được bài tiết in vivo ở trạng thái ổn định (Corbel và cộng sự, 1996; Fehniger và cộng sự, 2001), để khám phá xem liệu các tế bào NK thiếu hụt Ythdf2-có bị khiếm khuyết trong phản ứng của chúng hay không đến IL-15 in vivo, chúng tôi đã xử lý chuột bằng IL-15.

Chúng tôi nhận thấy rằng các tế bào thiếu hụt Ythdf2- so với WT NK cho thấy sự tăng sinh tế bào giảm đáng kể và sự tự chết của tế bào tăng lên khi chuột được điều trị bằng IL-15 (Hình 6 K; và Hình S4, E–J). Những dữ liệu này gợi ý rằng YTHDF2 điều chỉnh khả năng phản hồi của tế bào NK đối với IL-15, đặc biệt là trong một số điều kiện có mức IL-15 cao. Chúng tôi cũng nhận thấy rằng mức độ mRNA và protein của IFN-, granzyme B và perforin đã giảm đáng kể trong các tế bào Ythdf2ΔNK NK so với các tế bào NK Ythdf2WT khi phản ứng với IL-15 (Hình 6, L–N), cho thấy rằng YTHDF2 cũng góp phần vào chức năng tác động của tế bào NK qua trung gian IL{13}} trong ống nghiệm.

Nói chung, dữ liệu của chúng tôi chứng minh rằng YTHDF2 cần thiết cho sự tồn tại, tăng sinh và chức năng tác động của tế bào NK qua trung gian IL-15. Tiếp theo, chúng tôi đã nghiên cứu các cơ chế xuôi dòng mà qua đó YTHDF2 điều chỉnh chức năng sống sót, tăng sinh và tác động của NK qua trung gian IL-15. Chúng tôi nhận thấy rằng các tế bào NK từ chuột Ythdf2ΔNK và chuột Ythdf2WT có mức độ tương tự của thụ thể IL-15 CD122 (IL-15R ) và CD132 (IL-15R c; Hình S4 K). Tín hiệu IL{12}} được trung gian bởi ít nhất ba đường dẫn tín hiệu xuôi dòng trong các tế bào NK: Ras–Raf–MEK–ERK, PI3K–AKT–mTOR và JAK1/3–STAT3/5 (Mishra et al., 2014).

Để tìm hiểu đường truyền tín hiệu nào được điều chỉnh bởi YTHDF2 trong các tế bào NK, chúng tôi đã kiểm tra mức độ phosphoryl hóa của các tế bào ERK, AKT, S6, STAT3 và STAT5 trong NK từ chuột Ythdf2ΔNK hoặc chuột Ythdf2WT sau khi kích thích bằng IL-15.

Kết quả cho thấy sự thiếu hụt Ythdf2 không ảnh hưởng đến quá trình phosphoryl hóa ERK, AKT, S6 và STAT3 khi kích thích IL-15 (Hình S4, L và M) nhưng ức chế đáng kể quá trình kích hoạt STAT5, bằng chứng là mức độ phosphoryl hóa STAT5 giảm trong Ythdf{{ 7}}các tế bào NK bị thiếu hụt so với các tế bào NK từ chuột Ythdf2WT (Hình 6 O), cho thấy rằng YTHDF2 là cần thiết để truyền tín hiệu IL{11}}/STAT5 tối ưu trong các tế bào NK được kích hoạt.

Bởi vì chúng tôi đã chỉ ra rằng STAT5 được phosphoryl hóa ở hạ lưu IL{1}}liên kết với chất xúc tiến của Ythdf2 (Hình 6, D–F) và ở đây chúng tôi đã chứng minh rằng YTHDF2 cần thiết cho quá trình phosphoryl hóa STAT5 tối ưu, dữ liệu của chúng tôi đề xuất một vòng phản hồi tích cực STAT5–YTHDF2 ở hạ lưu của IL-15 có thể kiểm soát các chức năng sống sót, tăng sinh và tác động của tế bào NK.

Phân tích trên toàn bộ bản phiên mã xác định Tardbp là mục tiêu YTHDF2 trong các ô NK

Để giải quyết cơ chế phân tử mà YTHDF2 sử dụng để điều chỉnh các tế bào NK, trước tiên chúng tôi thực hiện giải trình tự RNA (seq) trong các tế bào Ythdf2WT và Ythdf2ΔNK NK được mở rộng của IL-2. Việc xóa Ythdf2 trong các tế bào NK dẫn đến 617 gen biểu hiện khác nhau, bao gồm 252 gen được điều hòa và 365 gen bị điều hòa quá mức (Hình. S5 A).

Phân tích bản thể gen (GO) cho thấy các gen biểu hiện khác nhau đã được làm phong phú đáng kể trong các quá trình liên quan đến chu kỳ tế bào, phân chia tế bào và phân chia tế bào, bao gồm quá trình phân bào, phân ly nhiễm sắc thể, trục chính, nhiễm sắc thể, thể giữa và nhiễm sắc thể (Hình 7). MỘT).

Phân tích làm giàu bộ gen (GSEA) đã chứng minh sự làm giàu đáng kể các mục tiêu E2F, G2 / Mcheckpoint và bộ gen đặc trưng trục chính phân bào trong các tế bào Ythdf2ΔNKNK (Hình S5 B). Các gen liên quan đến chu trình tế bào và phân chia tế bào, bao gồm Aurka, Aurkb, Cdc20, Cdc25b, Cdc25c, Cdk1, E2f2 và Plk1 (Bertoli et al., 2013), đã giảm đáng kể trong các tế bào NK từ chuột Ythdf2ΔNK (Hình 7 B) ).

Các gen phân tách trục chính và nhiễm sắc thể như Anln, Aspm, Birc5, Bublb, Cenpe, Esco2, Ska1, Ska3 và Tpx2 (Gorbsky, 2015) cũng được điều hòa giảm đáng kể trong các tế bào NK từ chuột Ythdf2ΔNK so với các tế bào NK từ chuột Ythdf2WT (Hình 7 C).

Ngoài ra, các gen sống sót của tế bào, bao gồm Birc5 (Niu và cộng sự, 2010), Septin4 (Larisch và cộng sự, 2000) và Rffl (Yanget al., 2007), đã giảm đáng kể trong các tế bào NK từ chuột Ythdf2ΔNK (Hình 2). 7D). Các gen chức năng tác động của tế bào NK, bao gồm Klrk1, Ncr1, CD226 và Gzma (Bezman và cộng sự, 2012), cũng được điều hòa giảm đáng kể trong các tế bào NK từ chuột Ythdf2ΔNK (Hình 7 D).

Những dữ liệu này hỗ trợ vai trò đặc trưng của chúng tôi về YTHDF2in trong việc điều chỉnh các chức năng tăng sinh, sinh tồn và tác động của tế bào NK. Sau đó, chúng tôi đã thực hiện m6A-seq trong các tế bào NK được mở rộng IL-2 từ chuột Ythdf2WT và Ythdf2ΔNK. Phân tích thành phần chính cho thấy ba bản sao sinh học của từng kiểu gen được nhóm lại với nhau (dữ liệu không được hiển thị), cho thấy khả năng lặp lại tốt của các mẫu m6A-seq.

Phân tích tối ưu hóa siêu hình học của mô-đun làm giàu mô-đun (HOMER) đã xác định mô-đun đồng thuận m6A (GGAC), cho thấy việc làm giàu thành công các bản phiên mã được sửa đổi m6A (Hình 7 E). Các sửa đổi m6A chủ yếu nằm ở các bản phiên mã mã hóa protein và các đỉnh được làm phong phú ở 59 vùng chưa được dịch (UTR) và 39UTR, đặc biệt là xung quanh các codon khởi đầu và dừng (Hình 7 F và Hình. S5 C).

Phân tích làm giàu GO của các gen có đỉnh m6A cho thấy hầu hết các bản phiên mã được đánh dấu m6A trong các tế bào NK đã được làm giàu trong các con đường liên quan đến chu kỳ tế bào và tăng sinh tế bào (Hình. S5 D).

For more information:1950477648nn@gmail.com