Đầu đọc RNA M6 A YTHDF2 kiểm soát khả năng chống ung thư và miễn dịch chống vi-rút của tế bào NK Phần 2
Feb 21, 2024
YTHDF2 cần thiết cho chức năng chống virus của tế bào NK
Để xác định xem sự thiếu hụt Ythdf2 có ảnh hưởng đến khả năng chống vi rút của tế bào NK hay không, chúng tôi đã tiêm 2,5 × 104 PFU MCMV vào chuột Ythdf2WT và chuột Ythdf2ΔNK.
Kết quả cho thấy chuột Ythdf2ΔNK dễ bị nhiễm MCMV hơn, được biểu hiện bằng việc giảm cân đáng kể và tăng nồng độ virus trong máu, lá lách và gan so với chuột Ythdf2WT (Hình 3, A và B; và Hình S2, A và B) .
Chúng tôi cũng quan sát thấy sự giảm đáng kể về tỷ lệ phần trăm và số lượng tuyệt đối của tổng số tế bào NK trong lá lách và máu của chuột Ythdf2ΔNK so với tỷ lệ ở chuột Ythdf2WT sau khi bị nhiễm bệnh (Hình 3, C và D; và Hình S2, C và D). Phân tích sâu hơn cho thấy các tế bào NK từ chuột Ythdf2ΔNK có biểu hiện Ki67 thấp hơn đáng kể so với chuột Ythdf2WT (Hình 3, E–G).
Tuy nhiên, khả năng tồn tại của tế bào NK là tương tự giữa chuột Ythdf2WT và chuột Ythdf2ΔNK, như được thể hiện bằng nhuộm byannexin V (Hình S2 E). Những dữ liệu này chỉ ra rằng sự thiếu hụt YTHDF2 trong các tế bào NK dẫn đến khiếm khuyết trong quá trình tăng sinh tế bào hơn là sự sống sót của tế bào trong quá trình nhiễm virus. Tế bào NK ức chế sự lây nhiễm MCMV thông qua các thụ thể kích hoạt Ly49H và Ly49D, và quá trình này được đặc trưng bởi phản ứng kháng virus qua trung gian perforin hoặc IFN- (Arase và cộng sự, 2002; Lee và cộng sự, 2009; Loh và cộng sự, 2005; Orr và cộng sự, 2010; Sumaria và cộng sự, 2009).
Chúng tôi thấy rằng chuột Ythdf2ΔNK đã giảm đáng kể các tế bào Ly49H+ và Ly49D+ NK trong lá lách và máu so với chuột Ythdf2WT sau khi bị nhiễm bệnh (Hình 3, H–J; và Hình S2, F–K).
Phân tích sâu hơn đã chứng minh rằng mặc dù trên mỗi phần trăm, chỉ có các tế bào Ly49D+Ly49H+ cho thấy sự khác biệt ở chuột Ythdf2ΔNK so với chuột Ythdf2WT, số lượng tế bào tuyệt đối của các tế bào Ly49D−Ly49H+ NK, tế bào Ly49D+Ly49H− NK và tế bào Ly49D+Ly49H+ NK trong lá lách và máu đều giảm đáng kể ở chuột Ythdf2ΔNK so với chuột Ythdf2WT sau khi bị nhiễm bệnh (Hình S2, L hè W).
Dữ liệu của chúng tôi cho thấy rằng việc kiểm soát nhiễm MCMV bằng YTHDF2 dường như chủ yếu được thực hiện qua trung gian bởi các tế bào Ly49D+Ly49H+ NK. Khả năng sản xuất granzyme B và IFN- của các tế bào NK ở chuột Ythdf2ΔNK tương đương với chuột Ythdf2WT (Hình S2, X và Y).
Chúng tôi nhận thấy việc sản xuất perforin ở chuột Ythdf2ΔNK giảm đáng kể so với chuột Ythdf2WT ở cả lách và máu 7 ngày sau khi bị nhiễm bệnh (Hình 3, K–M), cho thấy YTHDF2 chủ yếu ảnh hưởng đến hoạt động chống vi-rút qua trung gian perforin chống lại MCMV trong tế bào NK. Những dữ liệu này gợi ý rằng YTHDF2 rất quan trọng đối với chức năng tác động và mở rộng tế bào NK trong quá trình nhiễm MCMV.
YTHDF2 kiểm soát cân bằng nội môi tế bào NK và sự trưởng thành cuối cùng ở trạng thái ổn định
Những phát hiện trên cho thấy sự thiếu hụt Ythdf2 trong tế bào NK đã tăng cường di căn khối u và suy giảm khả năng kiểm soát nhiễm MCMV của tế bào NK đã khuyến khích chúng tôi điều tra xem liệu YTHDF2 có cần thiết để duy trì tế bào NK ở trạng thái ổn định hay không.
Như được hiển thị trong Hình 4 A, tần số và số lượng tế bào NK tuyệt đối đã giảm đáng kể ở máu ngoại vi, lá lách, gan và phổi nhưng không giảm ở tủy xương (BM) của chuột Ythdf2ΔNK so với chuột Ythdf2WT.
Tuy nhiên, không có thay đổi đáng kể nào giữa tế bào tiền thân bạch huyết thông thường, tiền thân tế bào NK và tế bào tiền thân NK tinh chế (NKP) trong BM (Fathman et al., 2011) giữa chuột Ythdf2WT và Ythdf2ΔNK (Hình S3 A), chỉ ra rằng YTHDF2 có thể không ảnh hưởng đến sự phát triển ban đầu của tế bào NK trong mô hình của chúng tôi.
Để khám phá các cơ chế tiềm ẩn gây ra sự suy giảm tế bào NK ở chuột Ythdf2ΔNK, chúng tôi đã nghiên cứu khả năng tăng sinh tế bào, khả năng sống sót và khả năng buôn bán của tế bào NK sau khi xóa Ythdf2 ở trạng thái ổn định. Tỷ lệ tế bào NK tăng sinh tương đương giữa chuột Ythdf2WT và Ythdf2ΔNK, bằng chứng là nhuộm Ki67 (Hình S3 B).
Khả năng tồn tại của tế bào NK cũng tương đương giữa chuột Ythdf2WT và Ythdf2ΔNK, như được thể hiện bằng nhuộm phụ lục V (Hình S3 C). Để kiểm tra xem YTHDF2 có ảnh hưởng đến sự đi ra của các tế bào NK từ BM đến ngoại vi hay không, chuột Ythdf2WT và Ythdf2ΔNK đã được tiêm iv một kháng thể kháng CD45 để đánh dấu các tế bào miễn dịch và hy sinh sau 2 phút, và các tế bào BM của chúng đã được phân tích.
Điều này cho phép chúng tôi định lượng số lượng tế bào NK ở vùng hình sin so với vùng nhu mô của BM, một chỉ số về sự di chuyển tế bào NK từ BM sang máu ngoại vi ở trạng thái ổn định (Leong và cộng sự, 2015). Kết quả cho thấy tần số tế bào CD45+ NK ở chuột Ythdf2ΔNK giảm đáng kể so với chuột Ythdf2WT trong các hình sin (Hình 4 B), cho thấy sự thiếu hụt Ythdf2 làm suy yếu khả năng đi ra của các tế bào NK từ BM đến hệ thống tuần hoàn in vivo .
Các tế bào miễn dịch trải qua quá trình tăng sinh cân bằng nội môi trong quá trình giảm bạch cầu do một số bệnh nhiễm trùng do virus gây ra hoặc do hóa trị liệu (Sun và cộng sự, 2011). Mặc dù chúng tôi nhận thấy rằng YTHDF2 có thể được phân phối để tăng sinh tế bào NK ở trạng thái ổn định, nhưng chúng tôi đã quan sát thấy sự giảm tăng sinh tế bào đáng kể trong quá trình nhiễm MCMV (Hình 3, E–G). Do đó, chúng tôi đã nghiên cứu vai trò của YTHDF2 trong việc điều chỉnh quá trình tăng sinh cân bằng nội môi của tế bào NK trong môi trường giảm bạch cầu in vivo.
Chúng tôi đã chuyển một số lượng tế bào NK lách bằng nhau từ chuột CD45.2 Ythdf2ΔNK hoặc chuột bẩm sinh CD45.1 sang chuột Rag2-/− Il2rg-/− bị thiếu tế bào lympho. Kết quả cho thấy tỷ lệ tế bào NK được lấy từ chuột điều khiển CD45.1WT lớn hơn so với chuột CD45.2 Ythdf2ΔNK vào ngày thứ 3 sau khi chuyển tế bào (Hình S3 D).
Phân tích sâu hơn đã chứng minh rằng việc giảm số lượng tế bào NK từ chuột Ythdf2ΔNK là do sự tăng sinh tế bào bị suy giảm (Hình S3 E) nhưng không phải do apoptosis của tế bào (Hình S3 F), cho thấy rằng YTHDF2 thúc đẩy quá trình tăng sinh cân bằng nội môi của tế bào NK in vivo trong điều kiện thiếu bạch huyết.
Sự biệt hóa sâu hơn của tế bào NK ở chuột có thể được phân loại thành các giai đoạn chưa trưởng thành (CD11b−CD27+), trưởng thành trung gian (CD11b+CD27+) và giai đoạn trưởng thành cuối cùng (CD11b+CD27−) dựa trên mức độ CD11b và CD27 ( Chiossone và cộng sự, 2009; Geiger và Sun, 2016).
Chúng tôi nhận thấy rằng biểu thức Ythdf2 tăng lên khi trưởng thành và CD11b−CD27+, CD11b+CD27+, CD11b+CD27− lần lượt hiển thị các mức biểu thức thấp nhất, trung bình và cao nhất của Ythdf2 (Hình S3 G), chỉ ra rằng YTHDF2 có thể liên quan đến quá trình trưởng thành tế bào NK. Do đó, chúng tôi đã nghiên cứu vai trò của YTHDF2 trong quá trình trưởng thành của tế bào NK được xác định bởi các dấu hiệu bề mặt tế bào CD11b và CD27.
Chúng tôi nhận thấy rằng sự mất Ythdf2 trong các tế bào NK dẫn đến giảm đáng kể tần số của các tế bào NK trưởng thành giai đoạn cuối và/hoặc tăng các tế bào NK trưởng thành chưa trưởng thành và trung gian ở lá lách, gan, phổi và máu nhưng không xảy ra ở BM (Hình 4 C và Hình S3 H), chỉ ra rằng YTHDF2 điều chỉnh tích cực sự trưởng thành của tế bào NK giai đoạn cuối. Phù hợp với những dữ liệu này, mức độ KLRG1, là dấu hiệu trưởng thành tế bào NK ở giai đoạn cuối, đã thấp hơn đáng kể ở chuột Ythdf2ΔNK ở lá lách, gan và phổi nhưng không BM so với của chuột Ythdf2WT trong các cơ quan hoặc ngăn mô tương ứng (Hình 4 D).
Để xác định xem liệu số lượng tế bào NK trưởng thành có giảm do thiếu tế bào nội tại của Ythdf2 hay không, chúng tôi đã tạo ra các thể khảm ở chuột Rag2−/−Il2rg-/− bằng cách tiêm tế bào BM từ chuột CD45.1 WT và CD45.2 Ythdf2ΔNK, trộn với tỷ lệ 1:1 tỉ lệ. Như được thể hiện bằng phương pháp tế bào học dòng chảy ở thời điểm 8 tuần sau khi cấy ghép, tỷ lệ tế bào NK trưởng thành cuối cùng được lấy từ tế bào CD45.2 Ythdf2ΔNK BM giảm so với tế bào từ tế bào đối chứng CD45.1 WT (Hình 4 E), cho thấy rằng sự trưởng thành của đầu tế bào NK được kiểm soát bởi YTHDF2 là nội tại của tế bào.
Các yếu tố phiên mã hộp T Eomes và Tbet rất quan trọng cho sự trưởng thành của tế bào NK (Daussy và cộng sự, 2014; Gordon và cộng sự, 2012). Nhuộm nội bào cho thấy nồng độ Eomes giảm đáng kể trong tế bào NK từ chuột Ythdf2ΔNK so với chuột Ythdf2WT (Hình S3 I). Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy rằng việc giảm mức độ protein và mRNA của Eomes đặc biệt xảy ra ở các tế bào NK trưởng thành cuối cùng (CD11b + CD27−) (Hình S3, J-L).
Tuy nhiên, trái ngược với Eomes, biểu hiện của Tbet tương đương trong các tế bào NK giữa chuột Ythdf2ΔNK và Ythdf2WT (Hình S3, I và K), cho thấy YTHDF2 có thể điều chỉnh quá trình trưởng thành của thiết bị đầu cuối NKcell bằng cách nhắm mục tiêu vào Eomes.
