Vai trò tạo hắc tố phụ thuộc vào huyết thanh / PDGF trong cấp độ phút của Kinase PAK1 gây ung thư trong tế bào hắc tố đã được chứng minh bằng thử nghiệm Kinase nhạy cảm cao

Tiếp xúc:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Bản tóm tắt:Trước đây chúng tôi đã chứng minh rằng kinase PAK4 gây ung thư, mà cả tế bào hắc tố và tế bào hắc tố bình thường đều biểu hiện ở mức rất cao, rất cần thiết chotạo hắc tố. Trong nghiên cứu này, bằng cách sử dụng xét nghiệm kinase "Macaroni-Western" (IP-ATP-Glo) có độ nhạy cao, chúng tôi đã khảo sát khả năng sinh hắc tố của một tế bào kinase gây ung thư khác PAK1, mà tế bào u ác tính (B16F10) chỉ biểu hiện ở mức độ rất nhỏ. Sau khi chuyển các tế bào u ác tính với PAK 1- shRNA để làm im lặng gen PAK1, hàm lượng melanin,tyrosinasehoạt động và hoạt tính kinase của PAK1 được so sánh giữa các thể hoang dã và thể chuyển gen. Chúng tôi nhận thấy rằng (i) PAK1 được kích hoạt đáng kể bởi các hormone tạo hắc tố như IBMX (3- isobutyl -1- methyl xanthine) và -MSH (hormone kích thích tế bào hắc tố), (ii) làm im lặng gen PAK1 nội sinh trong tế bào hắc tố thông qua PAK 1- shRNA cụ thể làm giảm cả hàm lượng melanin vàtyrosinasehoạt động với sự hiện diện của cả huyết thanh và kích thích tố tạo hắc tố ở mức cơ bản, (iii) PAK1 kiểu hoang dã được bổ sung ngoại sinh trong các tế bào hắc tố làm tăng mức độ melanin cảm ứng -MSH lên một số lần mà không ảnh hưởng đến mức cơ bản, và (iv) - Quá trình hình thành hắc tố do MSH / IBMX hầu như không diễn ra khi không có huyết thanh hoặc PAK1, cho thấy rõ ràng rằng PAK1 chủ yếu cần thiết cho huyết thanh và phụ thuộc -MSH / IBMXtạo hắc tố, nhưng không phải là cơ sở, trong các tế bào u ác tính. Kết quả của nghiên cứu này có thể cung cấp cơ sở khoa học đầu tiên để giải thích tại sao nhiều loại thuốc chẹn PAK 1- thảo dược như CAPE (axit caffeic phenethyl ester), curcumin và shikonin trong mỹ phẩm lại hữu ích choLàm trắng da.

Từ khóa:PAK1,tạo hắc tố, u ác tính,tyrosinase, MITF,Làm trắng da, huyết thanh

sản phẩm dưỡng trắng da cistanche

Giới thiệu

Màu của lông, tròng mắt và da được kiểm soát bởi một họ sắc tố gọi là melanins. Nguồn nội bào của melanin là tyrosine và được chuyển đổi thành melanin thông qua một loạt quá trình oxy hóa enzym (hydroxyl hóa) bao gồmtyrosinase, TRP (protein liên quan đến tyrosinase) 1 và TRP2. Sự biểu hiện của các gen mã hóa cho các enzym tạo hắc tố này đòi hỏi ít nhất hai yếu tố phiên mã gây ung thư / tạo hắc tố (MTF): beta-catenin và MITF (yếu tố phiên mã liên quan đến vi phẫu). Phần lớn các hợp chất thảo mộc trongLàm trắng damỹ phẩm ức chế trực tiếp các enzym tạo hắc tố này hoặc điều chỉnh giảm các MTF. Các chất tương tự tyrosine như axit kojic thuộc loại đầu tiên (tyrosinasechất ức chế), trong khi phần lớn các chất còn lại như CAPE (axit caffeic phenethyl ester), curcumin và shikonin thuộc loại thứ hai (chất điều chỉnh MTF) (1,2). Điều thú vị là nhiều chất điều chỉnh MTF này bao gồm CAPE, curcumin, shikonin và cucurbitacin được biết là có thể ngăn chặn kinase PAK1 gây ung thư / lão hóa (RAC / CDC 42- kinase 1) (3-5). Do đó, rất có thể PAK1 có liên quan đến việc kích hoạt các yếu tố phiên mã tạo hắc tố / gây ung thư này trong các tế bào lông, mống mắt hoặc tế bào hắc tố da. Thật vậy, ít nhất beta-catenin nằm trong số các chất nền trực tiếp của PAK1 (6). PAK1 phosphoryl hóa beta-catenin ở Ser 675 để kích hoạt, dẫn đến biến đổi ác tính. Hơn nữa, beta-catenin cần thiết cho việc kích hoạt MITF, dẫn đếntạo hắc tốhoặc / và ung thư tế bào hắc tố (7).

Tuy nhiên, điều thú vị là gần đây đã tiết lộ rằng việc loại bỏ gen PAK1 trên mỗi con chuột bị nhiễm sắc tố không tạo ra bất kỳ con chuột bạch tạng nào (Hong He et al., Quan sát chưa được công bố), cho thấy rõ ràng rằng ít nhất sự hình thành hắc tố cơ bản ở cả tế bào lông và mắt mống mắt độc lập với PAK1, mặc dù sự đóng góp của PAK1 đối với datạo hắc tốvẫn còn được làm rõ.

Trước đây, chúng tôi đã chỉ ra rằng kinase PAK4 gây ung thư (CDC 42- phụ thuộc kinase 4) được biểu hiện nhiều ở cả dòng tế bào hắc tố và tế bào hắc tố bình thường, và chịu trách nhiệm cho sự hình thành hắc tố của chúng, kích hoạt CREB / beta-catenin-MIFT-tyrosinasecon đường, trong khi PAK2 (RAC / CDC 42- đã kích hoạt kinase 2), một thành viên khác được biểu hiện nhiều của họ PAK, không đóng vai trò gì trong quá trình hình thành hắc tố của chúng (8).

Trong nghiên cứu này, chúng tôi cung cấp bằng chứng sinh hóa đầu tiên về vai trò cụ thể của một kinase gây ung thư khác được gọi là PAK1 trong datạo hắc tố, mặc dù thực tế là mức độ biểu hiện của nó là phút: sự im lặng do shRNA gây ra của gen PAK1 trong tế bào hắc tố (B16F10) có nguồn gốc từ khối u ác tính của chuột đã làm giảm đáng kể khả năng cảm ứng -MSH / IBMXtạo hắc tốở mức cơ bản, trong khi sự biểu hiện quá mức của gen PAK1 đã thúc đẩy quá trình hình thành hắc tố gây cảm ứng -MSH mà không ảnh hưởng đến mức cơ bản. Hơn nữa, chúng tôi nhận thấy rằng -MSH / IBMXinducible melanogenesis đòi hỏi một yếu tố huyết thanh rất có thể là PDGF (yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu). Trong môi trường không chứa huyết thanh, chỉ có chất nềntạo hắc tốdiễn ra.

cistanchegiảm hoạt động của tyrosinase

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Vật liệu

Tế bào u ác tính B16F10 được mua từ American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). PAK 1- Chắc chắn Plasmid ổn định, chuyển nạp hấp dẫn, bộ kit tối ưu endofree® plasmid đã được mua từ Qiagen (Valencia, CA 91355, Hoa Kỳ). Kháng thể PAK 1- chính, kháng thể thứ cấp được đánh dấu sinh học, thuốc thử signalfireTM ECL thu được từ Công nghệ Tín hiệu Tế bào (Danvers, MA, USA). Thuốc thử Kinase Glo và ATP (ATP _ Glo kinase kit) được mua từ Promega (Madison, Wisconsin, Hoa Kỳ). Lipofectamine và các tế bào có thẩm quyền JM109 đã được mua từ Invitrogen và Life Technology. AG1295 và AG1478 được mua từ Calbiochem (San Diego, CA, Hoa Kỳ). Tất cả các hóa chất khác bao gồm cả PDGF-bb của con người đều được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Hoa Kỳ).

2.2. Làm im lặng gen PAK1 trong tế bào hắc tố chuột (B16F10) bằng cách chuyển nạp ổn định với PAK 1- shRNA cụ thể của chuột

2.2.1. Nuôi cấy tế bào

Tế bào u ác tính B16F10 được nuôi cấy trong DMEM bổ sung 10 phần trăm FBS hoạt hóa bằng nhiệt và 1 phần trăm penicillin / streptomycin (10, 000 U / mL và 100 µg / mL) ở 37 độ trong môi trường ẩm có chứa 5 phần trăm CO2.

2.2.2. Truyền ổn định với PAK 1- shRNA cụ thể của chuột

Quá trình chuyển nạp ShRNA của dòng tế bào B16F10 về cơ bản được thực hiện thông qua quy trình tương tự được mô tả trước đây (9), nhưng với các shRNA cụ thể PAK 1- của chuột (# KM04553, Qiagen). Bốn dòng shRNA riêng biệt sau đây được sử dụng để chuyển gen: dòng 1 (CCAGAGAAGTTGTCAGCTATT), dòng 2 (CATCAAGAGTGACAATATTCT), dòng 3 (GTACACACGGTTCGAGAAGAT) và dòng 4 (GTACCACCAGTGTCAGAAGAT) cũng như shCONTROLTar không có shCONTROLTar . Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, các dòng 1 và 2 hóa ra có hiệu quả hơn các dòng 3 và 4 trong việc làm im lặng gen PAK1 của chuột trong dòng tế bào hắc tố này (dữ liệu không được hiển thị). Các chất truyền nhiễm ổn định đã được chọn với sự hiện diện của G418 (1 mg / mL) giết chết hơn 99 phần trăm tế bào không được truyền nhiễm.

2.2.3. Phân tích Western-blot về mức protein PAK1 và xét nghiệm in vitro đối với hoạt tính kinase của PAK1 trong các thể nhiễm trùng

2.2.3.1. Phân tích Western blot

Để định lượng mức cực kỳ thấp của PAK1 trong cả dòng tế bào kiểm soát (WT) và chất chuyển hóa im lặng PAK 1- (kháng G 418-), bằng cách giảm thiểu mức "tiếng ồn không đặc hiệu", chúng tôi đã tiến hành phương pháp phân tích đốm bằng cách sử dụng kháng thể đa dòng của thỏ chống lại PAK1 (# 2062, Công nghệ tín hiệu tế bào) làm kháng thể chính. Một cách ngắn gọn, mỗi dòng được gieo ở nồng độ 2 × 105 tế bào / giếng trong đĩa 6 giếng, được nuôi cấy trước 48 giờ, và dịch phân bào được đun sôi trong 25 µL dung dịch đệm SDS-PAGE trong 5 phút. Tám µL (chứa 15 µg protein tổng số) của mỗi chất nổi trên mỗi khe đã được sử dụng cho SDS-PAGE. Nitrocellulose được thấm bằng kháng thể IgG kháng PAK1 (pha loãng 1: 1, 000 làm kháng thể chính), và là kháng thể thứ cấp, IgG kháng thỏ liên kết HRP và IgG kháng biotin (# 7074, # 7075, Tín hiệu Tế bào) được sử dụng để phát hiện cả hai dải PAK1 và -actin, cuối cùng đã được hình dung bằng hệ thống ECL của Amersham. Các thử nghiệm Western blot là đại diện của ba thí nghiệm độc lập.

2.2.3.2. Xét nghiệm kinase "Macaroni-Western" (IP- ATP _ Glo) cho PAK1 trong tế bào u ác tính

Hoạt động kinase của PAK1 trong tế bào hắc tố WT và các chất chuyển gen shRNA (SH) được đo bằng một sửa đổi đáng kể (5) của một phương pháp có tuổi đời hàng thập kỷ (mà chúng tôi đặt ra là "Macaroni-Western") được phát triển bởi một nhóm người Ý (1 {{39 }}). Tóm lại, các dòng tế bào u ác tính B16F10 (WT hoặc SH, 2 × 105 tế bào / mL) đã được nuôi cấy trước trên đĩa 6- giếng trong 24 giờ. Sau đó, các tế bào được xử lý với 100 nM -MSH hoặc 100 µM IBMX trong 48 giờ. Tế bào bị phá vỡ bởi đệm ly giải chứa 50 mM Tris HCl pH 7,5 và 150 mM NaCl và 1% Triton-X. Để tạo kết tủa miễn dịch (IP) của PAK1, các dịch phân ly của tế bào đã làm sạch được ủ với kháng PAK1 IgG (pha loãng 1:50) và hạt protein A-agarose trong 1-2 giờ trong phòng lạnh với lắc liên tục bằng máy trộn quay (Nissin, Suginami-ku, Tokyo, Nhật Bản). IP thu được (PAK1) từ mỗi lysate được ủ với bộ xét nghiệm ATP Glo kinase (Promega) với sự hiện diện của ATP và MBP (protein cơ bản myelin) trong 1 giờ ở 37 độ, và mức ATP còn lại được đo bằng ATP- phản ứng Luciferin-Luciferase phụ thuộc mà cuối cùng tạo ra sự phát quang (10). Hỗn dịch cuối cùng được ly tâm, và phần nổi phía trên được chuyển vào một đĩa giếng 96- để đọc. Sự phát quang đã được ghi lại bằng đầu đọc vi tấm của MTP -880 Lab (Corona, Hitachinaka-ku, Ibaraki, Japan) với thời gian tích hợp là 0,5 giây cho mỗi giếng.

2.3. Đo hàm lượng melanin và hoạt động của tyrosinase trong chất truyền nhiễm

2.3.1. Đo hàm lượng melanin

Hàm lượng melanin được xác định như đã mô tả trước đây (11). Nói tóm lại, các tế bào B16F10 (kiểu chuyển gen hoang dại hoặc PAK 1- shRNA cụ thể) được mạ ở mật độ 2 × 104 tế bào / giếng trong một đĩa giếng 24-. Sau 24 giờ nuôi cấy, 100 µM isobutyl -1- metylxanthine (IBMX) hoặc 100 nM -MSH được thêm vào và ủ thêm 72 giờ ở 37 độ. Tế bào được rửa hai lần bằng đệm photphat, sau đó được ly giải bằng 500 µL dung dịch chứa NaOH 1 M và 10% DMSO và ủ ở 80 độ trong 1 giờ, để hòa tan hắc tố, và hàm lượng hắc tố được đo ở bước sóng 490 nm. Để so sánh hàm lượng melanin trong tế bào loại hoang dã và tế bào được chuyển gen, tổng lượng melanin được tạo ra bởi tế bào hắc tố loại hoang dã được coi là đối chứng (100%), và lượng melanin của tế bào chuyển gen được tính toán tương ứng.

2.3.2. Thử nghiệm cho hoạt động tyrosinase nội bào

Tyrosinasehoạt động được xác định như đã mô tả trước đây (12), với một chút sửa đổi. Tế bào B16F10 (kiểu hoang dã hoặc tế bào chuyển nhiễm) được mạ ở mật độ 2 × 104 tế bào / giếng, và sau 24 giờ nuôi cấy, 100 µM IBMX hoặc 100 nM -MSH được thêm vào và ủ thêm 72 giờ ở 37 độ . Sau đó, các tế bào được rửa sạch bằng đệm phosphat lạnh băng và được ly giải bằng đệm phosphat (pH 6,8) có chứa 1% Triton-X (500 µL / giếng). Các đĩa được đông lạnh ở -80 độ trong 30 phút. Sau khi rã đông, 100 µL 1% L-DOPA được thêm vào mỗi giếng. Sau khi ủ ở 37 độ trong 2 giờ, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 490 nm.

2.4. Đo hàm lượng melanin trong tế bào hắc tố dạng hoang dã và PAK 1- biểu hiện quá mức sau khi điều trị -MSH

Sử dụng vectơ Myc (2 µg), các tế bào hắc tố (B16F10) đã được chuyển nhiễm nhất thời với PAK1 kiểu hoang dã (WT) hoặc cái gọi là PAK1 "được kích hoạt cấu thành" (CA) mang đột biến T423E. Sau 3 ngày nuôi cấy, mỗi dòng đã nhiễm được thu hoạch để làm thí nghiệm thêm. Ảnh hưởng của sự biểu hiện quá mức của PAK 1- lên hàm lượng melanin được đo lường thông qua các quy trình tương tự được mô tả trước đây (8). Tóm lại, các tế bào hắc tố, biểu hiện quá mức kiểu hoang dã hoặc PAK 1- biểu hiện PAK1 kiểu hoang dã hoặc đột biến CA của nó, được ủ với 100 nM -MSH trong 3 ngày. Tế bào được ly giải bằng dung dịch chứa NaOH 1 M và 20% DMSO để hòa tan hắc tố, và hàm lượng của nó được xác định ở bước sóng 405 nm.

2.5. Tạo hắc tố trong môi trường không chứa huyết thanh

Tế bào B16F10 (chất chuyển gen shRNA kiểu dại hoặc PAK 1- cụ thể) được mạ ở mật độ 2 × 104 tế bào / giếng trong đĩa 24- giếng với sự hiện diện của 10 phần trăm FBS. Sau 24 giờ ủ, môi trường nuôi cấy được thay thế bằng môi trường không chứa huyết thanh và được nuôi cấy thêm 72 giờ có hoặc không có 100 µM IBMX hoặc 100 nM -MSH để đo hàm lượng melanin.

2.6. Ảnh hưởng của các chất ức chế thụ thể PDGF / EGF lên quá trình hình thành hắc tố phụ thuộc vào huyết thanh

2 × 104 tế bào B16F10 được gieo vào mỗi giếng trong 24 giờ trong môi trường chứa 10% FBS, và sau đó được nuôi cấy thêm 72 giờ trong môi trường tươi có chứa 100 nM -MSH và như sau: (1) không có huyết thanh, (2) 10 phần trăm FBS một mình, (3) 10 phần trăm FBS cộng với 2 µM AG1295 (chất ức chế thụ thể PDGF), và (4) 10 phần trăm FBS cộng với 400 nM AG1478 (chất ức chế thụ thể EGF), để đo hàm lượng melanin.

2.7. Phân tích thống kê

Dữ liệu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình với sai số tiêu chuẩn của chúng. So sánh thống kê được thực hiện bởi ANOVA một chiều, sau đó là thử nghiệm nhiều dải của Duncan. Phân tích thống kê được thực hiện bằng SAS (bản phát hành 9.2; Viện SAS, Cary, NC, Hoa Kỳ) và p Nhỏ hơn hoặc bằng 0. 05 được coi là đáng kể.

sâm maca cistanche

3. Kết quả

3.1. Kích hoạt PAK1 trong một dòng tế bào hắc tố (B16F10) bởi các hormone tạo hắc tố

Hai hormone tạo hắc tố, -MSH (hormone kích thích tế bào hắc tố) và IBMX (3- isobutyl -1- methyl xanthine) thường được sử dụng để kích thíchtạo hắc tốtrong tế bào hắc tố như dòng tế bào hắc tố B16F10. Vì vậy, trước tiên, chúng tôi kiểm tra xem các hormone này có thể kích hoạt PAK1 trong dòng tế bào này hay không, mặc dù mức độ protein của PAK1 ở đó rất thấp, so với mức PAK2 và PAK4 (8). Để theo dõi những thay đổi trong hoạt động kinase của PAK1 trong tế bào, gần đây chúng tôi đã phát triển một xét nghiệm kinase có độ nhạy cao / đặc hiệu được gọi là quy trình xét nghiệm kinase "Macaroni-Western" (IP ATP-Glo) bằng cách kết hợp kết tủa miễn dịch (IP) của PAK1 từ tế bào ly giải và bộ ATP _ Glo kinase của Promega (5). Sử dụng xét nghiệm kinase này, chúng tôi nhận thấy rằng cả -MSH (100 nM) và IBMX (100 µM) đều kích hoạt PAK1 trong tế bào u ác tính, với -MSH mạnh hơn IBMX (xem trong Hình 1). Tuy nhiên, chúng tôi nên nhắc nhở người đọc rằng sự kích hoạt lần lượt của PAK1 được trình bày ở đây chỉ là rõ ràng, bởi vì trong quá trình thử nghiệm IP và kinase trong ống nghiệm tốn thời gian này (tổng cộng hơn 3 giờ) diễn ra mà không có các hormone tạo hắc tố này, PAK1 sẽ dần dần được bình thường hóa. thời gian. Nói cách khác, chúng ta không thể đóng băng trạng thái kinase chính xác của PAK1 vào cuối quá trình nuôi cấy tế bào được xử lý bằng các chất kích thích này, và sự kích hoạt nếp gấp chỉ là sự phản ánh chưa được ước tính của việc kích hoạt PAK1 diễn ra trong quá trình nuôi cấy tế bào bằng các thiết bị mô phỏng này.

3.2. Sự im lặng của gen PAK1 bởi các shRNA trong dòng tế bào u ác tính của chuột

Để điều tra thêm về mặt hóa sinh nếu PAK1 góp phần vàotạo hắc tốtrong tế bào da (tế bào hắc tố), chúng tôi đã chuyển dòng tế bào hắc tố B16F10 một cách ổn định với shRNA đặc hiệu PAK 1- của chuột để ngăn chặn gen PAK1 một cách chọn lọc.

3.2.1. Gien PAK1 im lặng trong tế bào hắc tố

Phân tích Western blot sơ bộ của chúng tôi gợi ý rằng trong hai dòng vô tính PAK 1- khác biệt (SH1 và 2), mức protein PAK1 giảm đáng kể (khoảng 75 phần trăm), nhưng tốc độ phát triển của dòng tế bào hắc tố này trên mỗi dòng thì không. bị ảnh hưởng đáng kể bởi sự im lặng của PAK1 (dữ liệu không được hiển thị). Tuy nhiên, việc định lượng chính xác mức độ protein PAK1 bằng cách quét vệt phía tây này khá khó khăn, chủ yếu là do nhiễu nền cao xung quanh dải PAK1 trong nỗ lực hình dung mức độ biểu hiện cực thấp của nó. Thay vào đó, bằng cách sử dụng xét nghiệm kinase "Macaroni-Western" (5,10), chúng tôi đã xác minh rằng hoạt động kinase của PAK1 ở cả SH1 và 2 dòng vô tính chỉ chiếm khoảng 25-30 phần trăm so với hoạt động trong các ô đối chứng (WT) ( xem Hình 2A).

3.2.2. Giảm sự hình thành hắc tố bằng cách làm im lặng gen PAK1

Câu hỏi quan trọng tiếp theo của chúng tôi là nếu sự giảm hoạt động kinase của PAK1 như vậy có ảnh hưởng đếntạo hắc tố. Do đó, hàm lượng melanin trong các tế bào nhân bản này (SH1 và 2) được so sánh với các tế bào hắc tố loại hoang dã (WT), sau khi xử lý tất cả các tế bào này với -MSH, một chất cảm ứng tạo hắc tố, trong 72 giờ. Như thể hiện trong Hình 2B, hàm lượng melanin trong các tế bào hắc tố bị thiếu PAK 1- này (SH1 và 2) giảm khoảng 50 phần trăm (51-55 phần trăm), đạt mức cơ bản trong WT không có hormone tạo hắc tố. Để xem liệu sự giảm hàm lượng melanin này có liên quan đến việc ức chế hoạt động của tyrosinase hay không, chúng tôi đã đotyrosinasehoạt động trong các tế bào bị thiếu PAK 1- (dòng SH1 và 2), so với WT. Như được minh họa trong Hình 2C, hoạt động tyrosinase trong các tế bào bị thiếu PAK 1- chỉ khoảng 45 phần trăm (33-58 phần trăm) trong WT, một lần nữa đạt đến mức cơ bản (không được kích thích), cho thấy rõ ràng rằng PAK1 cần thiết cho việc sản xuất melanin do -MSH gây ra bởityrosinasetrong tế bào hắc tố. Hơn nữa, theo cách tương tự, quá trình hình thành hắc tố do IBMX gây ra cũng bị giảm bằng cách làm im lặng gen PAK1 trong dòng tế bào hắc tố này (dữ liệu không được hiển thị). Tuy nhiên, nếu tính đến hai yếu tố sau, rất có thể chỉ một nửa trong sốtạo hắc tốtrong tế bào hắc tố phụ thuộc PAK 1- và phần còn lại (phần lớn là "cơ bản") phụ thuộc PAK 4-: (i) PAK4 cũng cần thiết cho sự hình thành hắc tố do -MSH gây ra trong tế bào hắc tố (8), và (ii) khoảng 25% gen PAK1 dường như vẫn được biểu hiện trong các thể chuyển gen này (SH1 và 2). Tuy nhiên, vẫn còn cần được làm rõ liệu PAK1 có phải chịu trách nhiệm cho việc kích thích hormone hay cơ bảntạo hắc tố.

Hơn nữa, chúng tôi đã xác nhận rằng PAK1 nội sinh được kích hoạt đáng kể bởi các chất cảm ứng tạo hắc tố như IBMX và -MSH trong dòng tế bào u ác tính này (xem Hình 1), nhưng không có bất kỳ thay đổi đáng kể nào trong quá trình tự phosphoryl hóa của nó ở Thr 423 như được đánh giá bởi anti-pPAK1 kháng thể (dữ liệu không được hiển thị).

3.3. Tăng sự hình thành hắc tố cảm ứng -MSH bằng cách biểu hiện quá mức PAK1

Bằng cách biểu hiện quá mức của gen PAK1 kiểu hoang dã (WT) trong tế bào hắc tố (dòng tế bào B16F10) bằng cách chuyển gen, chúng tôi tiết lộ rằng gen PAK1 được bổ sung ngoại sinh làm tăng mức độ melanin cảm ứng -MSH lên một số lần (xem bên trái của Hình 3, so sánh làn 2 và 4), mặc dù nó hầu như không ảnh hưởng đến mức độ melanin "cơ bản" độc lập theo mỗi lần (so sánh làn 1 và 3 trong bảng điều khiển bên trái của Hình 3), cho thấy rằng PAK1 đóng góp chủ yếu vào phụ thuộc -MSH / IBMXtạo hắc tố, và không phải là quá trình hình thành hắc tố cơ bản mà không có (các) tác nhân kích thích ngoại sinh.

3.4. Tác dụng của huyết thanh đối với sự hình thành hắc tố gây cảm ứng -MSH / IBMX

Thú vị hơn, chúng tôi phát hiện ra rằng việc cảm ứng hình thành hắc tố bằng -MSH / IBMX yêu cầu 10% FBS (huyết thanh bò thai) cùng với PAK1. Như thể hiện trong Hình 4A, trong môi trường không có huyết thanh, -MSH hoặc IBMX hầu như không gây ratạo hắc tốtrong các ô WT, mặc dù chỉ có 10% FBS (không có -MSH / IBMX) đã gây ratạo hắc tốđáng kể (khoảng 60 phần trăm). Điều thú vị là sự hình thành hắc tố ở các tế bào chuyển nhiễm SH (tế bào thiếu PAK 1-) khi có hoặc không có huyết thanh cũng giống như ở các tế bào WT khi không có huyết thanh (xem Hình 4B), cho thấy rằng sự hình thành hắc tố phụ thuộc vào huyết thanh cũng yêu cầu PAK1. Để ủng hộ quan điểm này, chỉ riêng huyết thanh đã kích hoạt đáng kể hoạt động kinase của PAK1 trong tế bào WT, nhưng hoạt động phụ thuộc -MSH của PAK1 trong tế bào WT cần có huyết thanh (xem Hình 4C).

Về bản chất hóa học của yếu tố huyết thanh tạo hắc tố chỉ kích hoạt PAK1, chúng tôi suy đoán rằng đó là PDGF (yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu) vì những lý do sau: (i) hơn một thập kỷ trước, chúng tôi đã chỉ ra rằng PDGF là yếu tố tăng trưởng duy nhất trong huyết thanh kích hoạt PAK1 thông qua sự chuyển hóa của thụ thể EGF (yếu tố tăng trưởng biểu bì) bởi thụ thể PDGF (13,14), và gần đây những người khác đã chứng minh rằng chỉ PDGF hoặc EGF thực sự kích thíchtạo hắc tốtế bào hắc tố (15,16).

3.5. Sự hình thành hắc tố phụ thuộc vào huyết thanh / PDGF yêu cầu thụ thể EGF

Trong nỗ lực xác định bản chất hóa học cụ thể của yếu tố huyết thanh sinh hắc tố này, chúng tôi đã kiểm tra tác động của AG1295 (chất ức chế đặc hiệu đối với thụ thể PDGF) hoặc AG1478 (chất ức chế đặc hiệu đối với thụ thể EGF) trên huyết thanh phụ thuộc.tạo hắc tốtrong tế bào hắc tố. Như thể hiện trong Hình 5, 2 µM AG1295 hoặc 400 nM AG1478 làm giảm mạnh sự phụ thuộc vào huyết thanhtạo hắc tốđến mức tương đương với sự hình thành hắc tố cơ bản (không có huyết thanh). Vì PDGF có nhiều trong huyết thanh, nhưng không phải EGF và AG1295 không ức chế thụ thể EGF, trong khi AG1478 không ức chế thụ thể PDGF (13), rất có thể PDGF trong huyết thanh sẽ kích hoạt thụ thể của nó, từ đó kích hoạt thụ thể EGF chuyển hóa cuối cùng kích hoạt PAK1 cần thiết cho quá trình hình thành hắc tố phụ thuộc vào huyết thanh (chi tiết xem Hình 6). Dựa trên giả định này, chúng ta sẽ thảo luận sau về cơ chế có khả năng nhất làm cơ sở cho sức mạnh tổng hợp rõ ràng giữa -MSH và huyết thanh / PDGF để kích hoạt PAK1, dẫn đến hình thành hắc tố mạnh mẽ.

Cuối cùng, cần chỉ ra rằng hàm lượng melanin "cơ bản" không có -MSH không bị thay đổi đáng kể bởi đột biến CA (cấu thành hoạt động) biểu hiện quá mức của PAK1 mang đột biến T423E (xem bảng điều khiển bên trái của Hình 3, làn 5) như nếu đó là DN (âm tính trội) hoặc đột biến không hoạt động. Trên thực tế, -MSH hoàn toàn không gây ra sự phosphoryl hóa WT PAK1 ở Thr 423 (dữ liệu không được hiển thị). Do đó, có thể kết luận rằng quá trình tự động phosphoryl hóa PAK1 ở Thr 423 không liên quan gì đến sự kích hoạt PAK1 do -MSH gây ra, dẫn đến sự mạnh mẽtạo hắc tốtrong tế bào u ác tính. Vì đột biến T423E của PAK1 được biết đến là có khả năng gây ung thư cao (6), có lẽ quá trình tự động phosphoryl hóa ở Thr 423 có thể phục vụ cho việc chuyển từ tín hiệu "melanogenic" sang "oncogenic".

4. Thảo luận

Từ quan sát của chúng tôi về cả quá trình hình thành hắc tố phụ thuộc PAK 1- và PAK 4- trong tế bào hắc tố / tế bào hắc tố, có hai vấn đề tiềm ẩn thú vị cần được chỉ ra: (i) Hoạt động tạo hắc tố "cụ thể" của PAK1 ( chỉ biểu hiện nhỏ) phải cao hơn nhiều so với PAK4 (biểu hiện cao) trong tế bào u ác tính. (ii) Có vẻ như PAK1 chịu trách nhiệm chính cho quá trình hình thành hắc tố do huyết thanh gây ra, trong khi PAK4 chịu trách nhiệm chính cho nội tại (cơ bản)tạo hắc tố. Nói cách khác, mặc dù sự thiếu hụt PAK 4- có thể gây chết phôi ở chuột, trong khi chỉ riêng sự thiếu hụt PAK 1- không tạo ra chuột "bạch tạng", sự khác biệt rõ ràng về màu da ban đầu (cơ bảntạo hắc tố) chẳng hạn giữa người da đen và người da trắng ít nhất có thể phản ánh một phần sự khác biệt về mức độ biểu hiện của PAK4, cũng như sự khác biệt về mức độ sinh hắc tốtyrosinases.

In vivo, sử dụng HRM -2 (chuột có sắc tố nhưng không có lông), gần đây chúng tôi đã chỉ ra rằng một loại kem có chứa 10 μM PF3758309 (chất ức chế PAK1 / PAK 4-) làm giảm quá trình hình thành hắc tố do tia UV gây ra trong da của chúng để mức cơ bản, mặc dù vẫn chưa được làm rõ liệu PAK4 hay PAK1 chịu trách nhiệm cho sự cảm ứng tia cực tím của quá trình hình thành hắc tố (8). Vì PAK1 chịu trách nhiệm cho sự hình thành hắc tố cảm ứng, nhưng không cơ bản, nên sẽ đáng thử nghiệm nếu PAK1 góp phần đáng kể vào việc cảm ứng tia cực tímtạo hắc tố(phơi nắng) cũng như sử dụng đột biến PAK1 KO (knock out) hiếm có nguồn gốc từ dòng C57B16 của chuột mang lông và mắt sẫm màu (Hong He et al., quan sát chưa được công bố), trong nỗ lực tìm hiểu xem có nhiều loại thảo dược PAK1 chất chẹn trong mỹ phẩm có ích cho các chất chống nắng hay không. Điều thú vị là PAK1 đã được báo cáo là được kích hoạt bằng cách chiếu tia UV và các tác nhân gây hại DNA khác (17).

Nó đã được chứng minh rằng -MSH kích hoạt Tyr kinase JAK2 (18), đến lượt nó kích hoạt PAK1 bằng cách phosphoryl hóa ở Tyr 285, (thay vì Thr 423), dẫn đến tương tác PIX-PAK1 (19). Điều này có thể giải thích tại sao sự kích hoạt PAK1 phụ thuộc -MSH hay quá trình hình thành hắc tố đều không liên quan đến quá trình tự sản sinh PAK1 ở Thr 423. Vì vậy, gần đây chúng tôi đã điều tra xem liệu sự hình thành hắc tố phụ thuộc PAK 1- có bị chặn bởi một loại thảo dược mạnh JAK 2- hay không chất ức chế được gọi là cucurbitacin I (CBI) từ mướp đắng (Goya) ức chế trực tiếp JAK2 (20), và phát hiện ra rằng CBI ức chếtạo hắc tốvới sự hiện diện của hơn 70% kích thích tố tạo hắc tố, cho thấy khả năng CBI ngăn chặn không chỉ PAK1 mà còn cả PAK4 (5). Trong bối cảnh này, cần lưu ý rằng các chất chẹn PAK 1- thảo dược như CAPE, curcumin, shikonin và FTY 720 có thể ức chế sự hình thành hắc tố do -MSH gây ra trong các tế bào da của chuột hoặc người chỉ xung quanh 50% ngay cả ở nồng độ của chúng trong đó PAK1 gần như bị chặn hoàn toàn (1,2), trong khi chất chặn PAK tổng hợp PF3758309, ức chế cả PAK1 và PAK4, loại bỏtạo hắc tốtrong tế bào da khoảng 90% ở 300 nM (8). Nói cách khác, hệ thống tạo hắc tố do -MSH gây ra trong tế bào hắc tố có thể phân biệt các chất chẹn PAK 1- cụ thể với các chất chẹn PAK chảo. Cho đến nay chưa có thuốc chẹn cụ thể PAK 4- thảo dược nào (ngoài siRNA cụ thể PAK 4-) ​​được xác định. Tuy nhiên, một loại quassinoid rất mạnh được gọi là glaucarubinone có nguồn gốc từ một loại cây đắng trồng ở rừng rậm Amazon gần đây đã được chứng minh là có thể ngăn chặn cả PAK1 và PAK4, ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư tuyến tụy cả in vitro và in vivo (21). Vì vậy, sẽ rất thú vị khi kiểm tra xem liệu chất chặn PAK thảo dược này có ngăn chặn sự hình thành hắc tố của tế bào da gần như hoàn toàn như PF3758309 hay không.

Mục đích chính của nghiên cứu này là tập trung vào vai trò tạo hắc tố cụ thể của PAK1, và không điều tra chi tiết cách PAK1 kích hoạt con đường tín hiệu tạo hắc tố bao gồm các enzym tạo hắc tố và MTF. Tuy nhiên, có nhiều khả năng PAK1 hoạt hóa trực tiếp beta-catenin bằng cách phosphoryl hóa ở Ser 675, dẫn đến việc kích hoạt MITF, chất cần thiết cho sự biểu hiện của các gen mã hóa cho các enzym tạo hắc tố nhưtyrosinase(Tyr).

Gần đây, chúng tôi nhận thấy rằng PAK4 (CDC 42- phụ thuộc kinase 4) cũng tham gia vàotạo hắc tốcủa cùng một dòng tế bào hắc tố bằng cách kích hoạt hai yếu tố phiên mã, CREB và beta-catenin, cả hai yếu tố này đều cần thiết cho việc kích hoạt MIFT (8). Vì CREB được biết là được kích hoạt bởi LIM kinase (22,23) giống như beta-catenin, nằm trong số các chất nền trực tiếp phổ biến của cả PAK1 và PAK4 (6,18), nên rất có thể PAK1 và PAK4 chia sẻ cùng một CREB / Con đường tín hiệu beta-catenin-MITF để kích hoạt các gen enzyme tạo hắc tố.

Tuy nhiên, các con đường tín hiệu chi tiết dẫn đến sự kích hoạt PAK1 phụ thuộc -MSH / IBMX có thể khác biệt đáng kể với các con đường dẫn đến sự kích hoạt PAK4, chủ yếu là do trước đây liên quan đến yếu tố huyết thanh (PDGF). Chỉ riêng huyết thanh có khả năng kích hoạt PAK1 (13) và tăng cường kích hoạt -MSH / IBMXdependent của PAK1. Nói cách khác, có một sức mạnh tổng hợp rõ ràng giữa huyết thanh và các hormone tạo hắc tố này trong cả quá trình kích hoạt PAK1 vàtạo hắc tố.

Sau đây là giả thuyết hoạt động của chúng tôi về cách thức mà sức mạnh tổng hợp này có thể diễn ra. Con đường tín hiệu chính dẫn đến sự hoạt hóa PAK1 là EGFR (thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì) gây ung thư -RAS-PI 3 kinase-RAC / CDC 42- PAK1. Tuy nhiên, chỉ riêng dòng thác này là không đủ để kích hoạt toàn bộ. Nó cần một yếu tố khác gọi là PIX, một protein tiếp hợp SH3 liên kết trực tiếp với PAK1 thông qua mô-típ giàu Pro gồm 18 axit amin được gọi là PAK18. Tương tác PIX-PAK1 cần một protein thứ ba gọi là JAK2, một Tyr-kinase, phosphoryl hóa PAK1 ở Tyr 285. RAS điều chỉnh JAK2 thông qua prolactin. Theo một vài phát hiện trước đây của chúng tôi và những người khác (13-16), PDGF (yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu) là (các) yếu tố huyết thanh sinh hắc tố chính cần thiết cho -MSH / IBMX gây ratạo hắc tố, bởi vì nó kích hoạt thụ thể (PDGFR) Tyr-kinase của nó, lần lượt kích hoạt EGFR (thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì=ErbB1) Tyr-kinase, dẫn đến việc kích hoạt PAK1 thông qua RAS-PI3 kinase-RAC gây ung thư / Đường dẫn CDC42 (13). Do đó, chỉ riêng PDGF trong huyết thanh có thể kích hoạt PAK1 và gây ra quá trình hình thành hắc tố lên đến một nửa. Tuy nhiên, để kích hoạt đầy đủ quá trình hình thành hắc tố phụ thuộc PAK 1-, -MSH / IBMX là cần thiết để kích hoạt JAK2 thông qua một con đường phụ thuộc cAMP (có thể liên quan đến PKA) mà cuối cùng đảm bảo tương tác PIX-PAK1 (để biết chi tiết, xem Hình 6).

Tóm lại, ở đây chúng tôi trình bày bằng chứng sinh hóa đầu tiên có thể giải thích cách một loạt các chất chẹn PAK 1- thảo dược như CAPE, curcumin và shikonin trong các loại kem mỹ phẩm có thể góp phần vào việc "Làm trắng daMột loạt các nghiên cứu tương tự với tế bào hắc tố ở người đang được chờ đợi để chứng minh hoặc xác nhận thêm.

sâm maca cistanche

Người giới thiệu

1. Lee JH, Jang JY, Park C, Kim BW, Choi YH, Choi BT. Curcumin ngăn chặn quá trình hình thành hắc tố kích thích hormone alpha-melanocyte trong các tế bào B16F10. Int J Mol Med. Năm 2010; 26: 101-106.

2. Lee JY, Choi HJ, Chung TW, Kim CH, Jeong HS, Ha KT. Caffeic acid phenethyl ester ức chế tổng hợp hắc tố kích thích alpha-melanocyte gây ra sự tổng hợp melanin thông qua việc ngăn chặn hoạt động chuyển đổi của yếu tố phiên mã liên quan đến vi phẫu. J Nat Prod. 2013; 76: 1399-1405.

3. Maruta H. Liệu pháp điều trị bằng thảo dược ngăn chặn kinase gây ung thư PAK1: Một cách tiếp cận thiết thực đối với các bệnh phụ thuộc PAK 1- và tuổi thọ. Phytother Res. 2014; 28: 656-672.

4. Nguyen BCQ, Taira N, Tawata S. Một số hợp chất thảo dược trong cây Okinawa ức chế trực tiếp kinase PAK1 gây ung thư / lão hóa. Thuốc Discov Ther. 2014; 8: 238-244.

5. Nguyễn BCQ, Be Tu PT, Tawata S, Maruta H. Sự kết hợp của immunoprecipitation (IP) -ATP _ xét nghiệm Glo kinase và tạo hắc tố để đánh giá chất chẹn PAK 1- mạnh và an toàn trong nuôi cấy tế bào . Thuốc Discov Ther. Năm 2015; 9: 289-295.

6. He H, Maruta H. Sự độc lập của PAK và chất nền của chúng. Trong: PAKs, RAC / CDC42 (p21) kinase kích hoạt: Hướng tới việc chữa khỏi bệnh ung thư và các bệnh phụ thuộc PAK khác (Maruta H, ed.). Elsevier, Oxford, 2013; tr. 23-51.

7. Widlund HR, Horstmann MA, Price ER, Cui J, Lessnick SL, Wu M, He X, Fisher DE. -Phát triển khối u ác tính doatenin gây ra đòi hỏi yếu tố phiên mã liên quan đến Microphthalmia. J Cell Biol. Năm 2002; 158: 1079-1087.

8. Yun CY, You ST, Kim JH, Chung JH, Han SB, Shin EY, Kim EG. p 21- kinase 4 được kích hoạt điều chỉnh quan trọng sự hình thành hắc tố thông qua việc kích hoạt các con đường CREB / MITF và -catenin / MITF. J Đầu tư Dermatol. Năm 2015; 135: 1385-1394.

9. Huỳnh N, Liu KH, Baldwin GS, He H. P 21- kinase 1 được kích hoạt kích thích sự phát triển và di chuyển / xâm lấn của tế bào ung thư ruột kết thông qua các con đường phụ thuộc ERK và AKT. Biochim Biophys Acta. Năm 2010; 1803: 1106-1113.

10. Tagliati F, Bottoni A, Bosetti A, Zatelli MC, degli Uberti EC. Sử dụng công nghệ phát quang để phát triển xét nghiệm kinase: Cdk4 như một hệ thống mô hình. J Pharm Biomed Hậu môn. Năm 2005; 39: 811-814. 11. Yoon NY, Eom TK, Kim MM, Kim SK. Tác dụng ức chế của phlorotannin được phân lập từ Ecklonia cava đối với hoạt động tyrosinase của nấm và sự hình thành melanin trong tế bào u ác tính B16F10 của chuột. J Thực phẩm Nông nghiệp Chem. Năm 2009; 57: 4124-4129.

12. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Baicalein ức chế sự hình thành hắc tố thông qua việc kích hoạt con đường tín hiệu ERK. Int J Mol Med. Năm 2010; 25: 923-927.

13. He H, Levitzki A, Zhu HJ, Walker F, Burgess A, Maruta H. Yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu yêu cầu thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì để kích hoạt p 21- kinase họ kinase hoạt hóa. J Biol Chem. Năm 2001; 276: 26741-26744.

14. Saito Y, Haendeler J, Hojo Y, Yamamoto K, Berk BC. Phản ứng đồng phân hóa thụ thể: Cơ chế cần thiết cho quá trình vận chuyển thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì do yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu gây ra. Mol Cell Biol. Năm 2001; 21: 6387-6394.

15. Hirobe T, Shibata T, Fujiwara R, Sato K. Yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu điều chỉnh sự tăng sinh và biệt hóa của các tế bào hắc tố ở người theo cách thức đặc trưng cho từng giai đoạn biệt hóa. J Dermatol Khoa học viễn tưởng. 2016; 83: 200-209.

16. Garcez RC, Teixeira BL, Schmitt Sdos S, Alvarez-Silva M, Trentin AG. Yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF) thúc đẩy sự biệt hóa trong ống nghiệm của tế bào mào thần kinh thành tế bào thần kinh và tế bào hắc tố. Tế bào Mol Neurobiol. Năm 2009; 29: 1087-1091.

17. Roig J, Traugh JA. p 21- protein kinase gamma hoạt hóa PAK được kích hoạt bằng bức xạ ion hóa và các tác nhân gây hại DNA khác. Điểm tương đồng và khác biệt đối với alpha PAK. J Biol Chem. Năm 1999; 274: 31119-31122.

18. Buggy JJ. Sự gắn kết của hormone kích thích tế bào hắc tố alpha với thụ thể kết hợp với protein G của nó trên tế bào lympho B sẽ kích hoạt con đường Jak / STAT. Biochem J. 1998; 331: 211-216.

19. Hammer A, Oladimeji P, De Las Casas LE, Diakonova M. Phosphoryl hóa tyrosine 285 của PAK1 tạo điều kiện cho PIX / GIT1 liên kết và luân chuyển kết dính. FASEB J. 2015; 29: 943-959.

20. Blaskovich MA, Sun J, Cantor A, Turkson J, Jove R, Sebti SM. Khám phá JSI -124 (cucurbitacin I), một bộ chuyển đổi tín hiệu / Janus kinase chọn lọc và chất kích hoạt chất ức chế con đường truyền tín hiệu phiên mã 3 có hoạt tính kháng u mạnh chống lại các tế bào ung thư ở người và chuột ở chuột. Ung thư Res. Năm 2003; 63: 1270-1279.

21. Yeo D, Huynh N, Beutler JA, Christophi C, Shulkes A, Baldwin GS, Nikfarjam M, He H. Glaucarubinone và gemcitabine đồng thời làm giảm sự phát triển của ung thư tuyến tụy thông qua việc điều hòa giảm p 21- kinase hoạt hóa. Chữ cái ung thư. 2014; 346: 264-272.

22. Dan C, Kelly A, Bernard O, Minden A. Những thay đổi tế bào xương được điều hòa bởi PAK4 serine / threonine kinase được trung gian bởi LIM kinase 1 và cofilin. J Biol Chem. Năm 2001; 276: 32115-32121.

23. Yang EJ, Yoon JH, Min DS, Chung KC. LIM kinase 1 kích hoạt protein liên kết yếu tố đáp ứng cAMP trong quá trình biệt hóa tế bào thần kinh của các tế bào tiền thân hồi hải mã bất tử. J Biol Chem. Năm 2004; 279: 8903-8910.