Hoạt động của Xanthine Oxidoreductase trong huyết tương nghèo tiểu cầu và giàu tiểu cầu như một chỉ số căng thẳng oxy hóa ở bệnh nhân cần điều trị thay thế thận

Hình nền trừu tượng: Xanthine oxyoreductase(XOR) là một enzyme hydroxylase tham gia vào quá trình chuyển hóa purin. Hoạt tính XOR có thể khác nhau: protein homodimer có thể được chuyển đổi thành hai dạng đồng phân khác nhau XD (chất chống oxy hóa) và XO (chất chống oxy hóa). Căng thẳng oxy hóa và viêm nhiễm đi kèmbệnh thận mãn tính(CKD), lọc máu và ghép thận, dẫn đến kích hoạt tiểu cầu. Nghiên cứu hiện tại nhằm xác định ảnh hưởng của liệu pháp thay thế thận được áp dụng lên xanthine oxyoreductase và hoạt động đồng phân của nó.

Vật liệu và Phương pháp: Nhóm nghiên cứu bao gồm 117 bệnh nhân, được chia thành 4 nhóm: bệnh nhân chạy thận nhân tạo - 30, bệnh nhân lọc màng bụng - 30, bệnh nhân ghép thận - 27 và điều trị bảo tồn {{5} } người bệnh. Nhóm kiểm soát bao gồm 30 tình nguyện viên khỏe mạnh. Kết quả: Đã tìm thấy sự khác biệt đáng kể về hoạt tính XOR ở huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP) trong các nhóm được nghiên cứu (p=0.001). Có mối liên quan giữa loại liệu pháp thay thế thận của tất cả các dạng đồng phân oxidoreductase trong PPP (p<0.001 all isoforms) and XD (p=0.008), XO (p<0.001) in platelet-rich plasma (PRP). A relationship was observed between the activity of all oxidoreductase isoforms in PPP and PRP, the type of renal replacement therapy the duration of dialysis, and the age of patients. Thenguyên nhân bệnh thận mãn tínhcũng được phản ánh qua sự khác biệt trong hoạt động XD và XO trong PPP.

Kết luận: Loại điều trị thay thế thận được sử dụng ở bệnh nhân CKD, tuổi bệnh nhân, thời gian lọc máu, nguyên nhân CKD và giai đoạn tiến triển ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động của XOR và các dạng đồng phân của nó.

Từ khóa: Xanthine oxyoreductase, Tiểu cầu, Liệu pháp thay thế thận,Bệnh thận mãn tính, Enzyme chống oxy hóa

MẤT BAO LÂU ĐỂ CISTANCHE CÓ HOẠT ĐỘNG?

Lý lịch

Xanthine oxyoreductase (XOR) là một enzyme hydroxylase tham gia vào quá trình chuyển hóa purin. Nó xúc tác quá trình oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và xanthine thành axit uric (UA). Hoạt động XOR có thể khác nhau: protein homodimer có thể được chuyển đổi thành hai dạng đồng phân khác nhau. Xanthine dehydrogenase (XD) được biểu hiện chủ yếu ở các mô khỏe mạnh và xanthine oxyase (XO) được tạo ra bằng cách biến đổi XD sau dịch mã, dư lượng cysteine ​​oxy hóa cũng như sự phân giải protein hạn chế, đóng vai trò chủ đạo trong tế bào và mô khi bị thương [1–3 ]. Hoạt động của các đồng phân được đề cập đối lập nhau [4]. XOR hoạt động với sự có mặt của NAD+ dưới dạng dehydrogenase và với oxy phân tử dưới dạng oxydase. Khả năng XOR chuyển đổi nhanh chóng từ chất chống oxy hóa sang chất oxy hóa, trong các loại tổn thương mô khác nhau, là một yếu tố thiết yếu cho phản ứng miễn dịch bẩm sinh nhanh chóng, có lợi, chẳng hạn như nhiễm trùng do vi khuẩn hoặc nấm [5].

Một chất trung gian phản ứng của xanthine dehydrogenase (XDO) và oxy có thể phản ứng với cả NAD+ và O2 nhưng có ái lực cao hơn với NAD+ [6]. Đồng dạng trung gian này chưa được phân lập nhưng việc xác định hoạt tính của nó tạo điều kiện thuận lợi cho việc theo dõi quá trình chuyển đổi XD thành XO [7].

Hoạt tính XOR huyết thanh trong các bệnh khác nhau đã được nghiên cứu rộng rãi. Lý do khiến người ta quan tâm đến enzyme này là do tính nhị nguyên trong hoạt động của nó: khả năng tạo ra chất chống oxy hóa và mặt khác là tạo ra các loại oxy phản ứng. Sự gia tăng hoạt động XOR xảy ra trong các tình trạng bệnh lý như viêm gan siêu vi, bệnh bạch cầu đơn nhân nhiễm trùng, bệnh tự miễn, viêm phổi, tâm thần phân liệt và tiểu đường loại II. Sự gia tăng hoạt động XOR cũng được quan sát thấy trong huyết thanh của bệnh nhân sau ghép thận hoặc gan [8]. Người ta đã chứng minh rằng gen mã hóa XOR có thể chịu trách nhiệm cho sự trưởng thành của thận và quá trình tạo mỡ ở thận và có thể ngăn chặn sự biến đổi của các tế bào biểu mô thành mô trung mô [9]. Tuy nhiên, do hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, không có báo cáo nào được công bố nghiên cứu hoạt động XOR trong huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP) và huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) ở những bệnh nhân đang điều trị thay thế thận. Tầm quan trọng của hoạt động XOR ở nhóm bệnh nhân này có liên quan đến việc tăng kích hoạt tiểu cầu, nguyên nhân là do stress oxy hóa và viêm nhiễm đi kèm với bệnh thận mãn tính (CKD), lọc máu và ghép thận. Ngoài ra, trong quá trình lọc máu và ghép tạng, các mô và mạch máu bị tổn thương, tiểu cầu là tế bào đầu tiên tiếp cận vị trí tổn thương mô, tham gia tích cực vào giai đoạn đầu của quá trình viêm và chữa lành [10].

PRP và PPP là các phần huyết tương có nồng độ tiểu cầu khác nhau. Hàm lượng tiểu cầu của PRP và PPP lần lượt là tiểu cầu/ml và tiểu cầu/ml. PPP và PRP thu được bằng cách ly tâm nhiều lần và rửa toàn bộ máu người ở các tốc độ ly tâm khác nhau [11, 12].

PPP, là sản phẩm phụ của quá trình ly tâm của máu chống đông, có nồng độ tiểu cầu thấp hơn máu bình thường. Các thành phần chính của PPP là fibrinogen, fibronectin và trombin. Tác dụng sinh học của PPP là tham gia vào quá trình cầm máu và đông máu, hoạt động như một vectơ gắn tế bào và thúc đẩy quá trình nguyên phân của nguyên bào sợi và tế bào biểu mô [13]. Mặc dù PPP không tập trung ở tiểu cầu như PRP, nhưng người ta đã chứng minh rằng PPP cũng có thể duy trì sự phát triển và tồn tại của tế bào. PPP thúc đẩy các chức năng tế bào liên quan đến chữa lành vết thương và đẩy nhanh quá trình di chuyển tế bào và tăng sinh nguyên bào sợi [14, 15]. Huyết tương giàu tiểu cầu có lượng tiểu cầu đậm đặc hơn huyết tương bình thường (khoảng 150–400×103 tế bào/dL). Đây là một trong những định nghĩa phổ biến nhất về PRP trong tài liệu [16]. Cho đến nay, các nghiên cứu hạn chế đã mô tả XOR và hoạt động đồng phân của nó trong huyết tương giàu hoặc nghèo tiểu cầu ở những bệnh nhân mắc bệnh thận mãn tính. Tân và cộng sự. cho thấy các tế bào bị tổn thương bởi các loại oxy phản ứng (ROS) (trong trường hợp điều trị thay thế thận mãn tính) "rò rỉ" các dạng đồng phân XOR, dẫn đến sự gia tăng nồng độ enzyme trong huyết tương [17]. Cơ chế này giải thích hoạt động của XOR và các dạng đồng phân của nó trong tiểu cầu thấp hơn so với PPP. Do đó, hoạt tính của oxidoreductase trong PPP và PRP rất được quan tâm, vì chúng có thể giúp khám phá các quá trình tế bào diễn ra hàng ngày, chị ạ. Những cuộc điều tra như vậy cũng có thể gián tiếp làm nổi bật mức độ nghiêm trọng của stress oxy hóa ở nhóm bệnh nhân này.

Berry và cộng sự. cũng mô tả rằng xanthine oxyoreductase được phân bố ở gan, ruột non, tuyến vú và tế bào nội mô. Các phương pháp định vị dưới tế bào đã chứng minh sự hiện diện của xanthine oxyoreductase cả trong tế bào chất và trên màng tế bào. Họ cũng chỉ ra rằng xanthine oxyasereductase trong huyết tương có thể là do xanthine oxyoreductase bị che khuất khỏi màng tế bào hoặc rò rỉ từ tế bào chất. Đây là một trong những lý do chúng tôi kiểm tra hoạt động của XOR trong PPP và PRP để phân biệt hoạt động của enzyme trong tiểu cầu và các tế bào máu khác có trong huyết tương [18]. Dựa trên hoạt động của các enzyme chống oxy hóa, chúng tôi cũng có thể xác định loại liệu pháp thay thế thận nào ít có khả năng khiến bệnh nhân bị stress oxy hóa hơn. Do tính chất kép của XOR, sự hiểu biết về mối quan hệ giữa loại liệu pháp thay thế thận và hoạt động của các đồng phân XOR có thể rất thú vị và hữu ích trong việc lựa chọn loại liệu pháp thay thế thận.

Nguyên liệu và phương pháp

Phê duyệt và đồng ý về mặt đạo đức

Ủy ban Đạo đức Sinh học tại Đại học Y khoa Pomeranian ở Szczecin đã phê duyệt nghiên cứu được thực hiện (số KB−0012/36/11). Tất cả những người tham gia, bao gồm cả những tình nguyện viên khỏe mạnh trong nhóm đối chứng, đều được thông báo về mục đích và phạm vi của nghiên cứu và đồng ý tặng mẫu và công bố dữ liệu kết quả.

Học nhóm

Có 147 người tham gia: nhóm đối chứng gồm 30 tình nguyện viên khỏe mạnh (NK) và 117 bệnh nhân mắc bệnh thận mãn tính (CKD) đang tham dự Phòng khám Thận, Ngoại hành tinh và Bệnh Nội khoa của Đại học Y khoa Pomeranian ở Szczecin. Bệnh nhân Te được chia thành 4 nhóm dựa trên phương pháp điều trị họ nhận được: 30 bệnh nhân trước và sau khi chạy thận nhân tạo (HD A và HD B): 30 bệnh nhân được chạy thận nhân tạo (PD); 27 bệnh nhân trước và sau ghép thận (5–7 ngày sau phẫu thuật) (TE, TE A); 30 bệnh nhân được điều trị bảo tồn (CT) (CKD giai đoạn 2–5). Giới tính, tuổi tác, thời gian lọc máu, nguyên nhân và giai đoạn của bệnh thận mãn tính cũng như nồng độ creatinine trong nhóm xét nghiệm và nhóm đối chứng được đưa ra trong Bảng 1 và 2.

Mẫu

Các mẫu máu (K2EDTA (8 ml), trisodium citrate 3,8% (9: 1; v / v) và huyết thanh (8 ml)) được lấy từ tất cả những người tham gia nghiên cứu. Máu bệnh nhân chạy thận nhân tạo được rút ra từ lỗ rò động tĩnh mạch của họ; chọc tĩnh mạch ngoại vi đã được sử dụng cho tất cả những người tham gia khác. Các mẫu được lấy từ bệnh nhân chạy thận nhân tạo trước (HD A) và khoảng 10 phút sau khi ngừng bơm (HD B). Máu bệnh nhân cấy ghép được thu thập trước khi ghép (TE) và 5–7 ngày sau phẫu thuật (TE A). Bệnh nhân được tuyển vào nhóm TE không thuộc nhóm bệnh nhân chạy thận nhân tạo hoặc thẩm phân phúc mạc trong nghiên cứu này. Họ là những bệnh nhân đủ điều kiện để cấy ghép từ khắp Ba Lan. Phần lớn bệnh nhân ghép thận đã được phân tích chế độ trước đó. K2EDTA và mẫu máu đông máu được ly tâm ở tốc độ 2600 vòng / phút trong 10 phút ở 20 độ để thu được huyết tương và huyết thanh tương ứng. Để thu được huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) và huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP), máu thu thập bằng citrate được ly tâm trong điều kiện ở tốc độ 1100 vòng / phút trong 10 phút ở 20 độ. PRP thu được được chuyển sang một ống mới và ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút ở 20 độ: huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP) được chuyển sang một ống riêng; viên tiểu cầu được rửa hai lần và lơ lửng trong dung dịch đệm Tyroda (pH7,4). Huyết tương, huyết thanh, PPP và PRP được đông lạnh ở -80 độ cho đến khi các xét nghiệm được thực hiện. Ở những bệnh nhân chạy thận nhân tạo, máu được thu thập trước khi sử dụng heparin và sau khi lọc máu kéo dài trung bình 4–5 giờ (thời gian bán hủy của heparin - 4 giờ) để loại bỏ mọi ảnh hưởng có thể có của heparin đối với hoạt động XOR.

Hoạt tính xanthine oxyoreductase trong huyết tương và tiểu cầu nghèo tiểu cầu

Việc xác định được thực hiện bằng máy quang phổ Perkin Elmer UV/VIS Lambda 40P. Những thay đổi tuyệt chủng được ghi nhận ở bước sóng 340nm (XD) và 302nm (XDO, XO) trong 5 phút ở 30 độ. Hoạt tính enzyme được đo bằng sự hình thành axit uric và NADH (tăng A340 và A302) và được biểu thị bằng mU× mL−1 (milliunits trên mililit). Hoạt tính enzyme đã được tính toán, có tính đến tốc độ phản ứng ban đầu. Sự hình thành axit uric được đo ở bước sóng 302nm (đồng dạng XDO và XO) vì độ hấp thụ của nó vẫn cao ở đó, trong khi sự thay đổi nồng độ NAD+ không góp phần. Hệ số tuyệt chủng của NADH+ H+ ε340=6.22× 103 [L∙mol−1 cm−1 ] được sử dụng để tính hoạt độ của các dạng đồng phân của xanthine oxyoreductase NADH+ H+: ε302=2.30× 103 [ L∙mol−1 cm−1 ] [7, 19–22].

Bảng 1 Đặc điểm chung của bệnh nhân chạy thận nhân tạo (HD), lọc màng bụng (PD) được điều trị bảo tồn (CKD), ghép thận (TE) và nhóm đối chứng (C) tham gia nghiên cứu (trung bình±SD)

P* - ý nghĩa thống kê về sự khác biệt giữa các nhóm HD, PD và CKD, phép kiểm Fisher chính xác TE và C đối với các biến định tính; đối với các biến định lượng - ANOVA một chiều và; P ** - có ý nghĩa thống kê đối với sự khác biệt giữa các nhóm HD, PD và CKD và phép kiểm Fisher chính xác TE đối với các biến định tính đối với các biến định lượng một chiều ANOVA hoặc; DM - bệnh thận đái tháo đường; HA - tăng huyết áp; GIK - thận viêm cầu thận; ADPKD - bệnh thận đa nang di truyền nhiễm sắc thể thường trội; NS - không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.

Bảng 2 Đặc điểm chung của bệnh nhân chạy thận nhân tạo (B - trước HD, A - sau), lọc màng bụng (PD) được điều trị bảo tồn (CKD) trước và sau ghép thận (TE B và TE A) và nhóm đối chứng (NK) tham gia nghiên cứu nghiên cứu (trung bình±SD)

P * - ý nghĩa thống kê đối với sự khác biệt giữa các nhóm HD A, HD B, PD và CKD, TE và C đối với các biến định lượng - Kruskal Wallis ANOVA, ANOVA một chiều hoặc t-test P của Sinh viên ** - ý nghĩa thống kê đối với sự khác biệt giữa HD A , HD B, PD và CKD và TE cho các biến định lượng ANOVA của Kruskal Wallis hoặc phân tích một chiều ANOVA Kt / V - chỉ số lọc máu (phần thể tích V được tinh chế bằng độ thanh lọc K tại thời điểm t) NS không tìm thấy mối quan hệ có ý nghĩa thống kê

Phân tích thống kê Để đánh giá sự phân bố, thử nghiệm KS (Kolmogorov-Smirnov) đã được sử dụng, trong trường hợp một số biến (hoạt động của các đồng dạng XD và XDO trong PRP) cho thấy sự phân bố tham số không bình thường. Các phép thử Fisher và Chi bình phương chính xác được sử dụng để phân tích dữ liệu định lượng. Sử dụng phân tích t-test và ANOVA của Sinh viên cho các hệ thống đơn biến, sự khác biệt giữa các biến liên quan (theo cặp) và không liên quan (không ghép đôi) được đánh giá trong trường hợp các biến có phân phối chuẩn. Trong trường hợp các biến có phân phối không chuẩn, phân tích ANOVA Kruskal-Wallis được thực hiện để đánh giá sự khác biệt giữa các tham số, cũng như thử nghiệm phi tham số Mann-Whitney U cho dữ liệu chưa ghép đôi hoặc Wilcoxon cho dữ liệu ghép đôi. Mô hình hồi quy tuyến tính bội được sử dụng để xác định đánh giá đa yếu tố về mối quan hệ giữa các tham số được nghiên cứu. Phân tích thống kê kết quả được thực hiện bằng Statistica 12 (StatSoft).