RNA không mã hóa dài được bảo tồn, GAPLINC, điều chỉnh phản ứng miễn dịch trong sốc nội độc tố

Để tìm hiểu thêm thông tin, xin vui lòng liên hệdavid.wan@wecistanche.com

Ý nghĩa

Quá trình viêm phần lớn đã được nghiên cứu trong bối cảnh của các gen mã hóa protein. Các nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra các IncRNA là chất điều hòa miễn dịch quan trọng. Đặc điểm chức năng của những gen này vẫn là một lĩnh vực nghiên cứu tích cực. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định GAPLINC là mộtIncRNAgiữa người và chuột. Sự suy giảm GAPLINC dẫn đến tăng cường biểu hiện của các gen đáp ứng miễn dịch trực tiếpNF-kBcác mục tiêu. Thật ngạc nhiên, chúng tôi quan sát thấy những con chuột loại trực tiếp Gaplinc cho thấy khả năng chống lại sốc nội độc tố do LPS gây ra và nhận thấy rằng biểu hiện cơ bản của các gen viêm ngăn cản sự hình thành chấm để bảo vệ khỏi suy đa cơ quan và tử vong. Những phát hiện này có ý nghĩa trong điều trị nhiễm trùng huyết, trong đó các liệu pháp mới nhắm mục tiêu vào các IncRNA có thể đóng góp thông tin có giá trị trong việc hiểu rõ về tình trạng viêm và cải thiện kết quả của bệnh nhân.

Bấm vào đây để tìm hiểu thêm về Cistanche

FG 1. xác định và mô tả đặc điểm của đại thực bàoIncRNA GAPLINC. (A) A schematic for macrophage differentiation in vitro using primary human celeb or immortalized THP-1 cells, Isolated monocytes from human P8MCs are differentiated into macrophages using recombinant magnon stimulating factor. PHP-1 cells are differentiated into macrophages by treatment with PMA (100 nM). (8)RNA-Seg analysis on macrophages differentiated from monocytes isolated from human PBMCs (n = 4 donors). Results are represented in a volcano plot. GAPUNC (shown in red) is the most up-regulated and RNA (>1, 000- fok). (C) Phân tích RNA-Seq củaGAPLNCbiểu hiện trong quá trình phân biệt bạch cầu đơn nhân với đại thực bào trong các mốc thời gian đã chỉ định. tế bào người sơ cấp và tế bào THP -1. Dữ liệu từ Nanotring được thực hiện trong các bản sao sinh học. (E) Một giản đồ cho các tế bào tiền thân bạch cầu hạt đơn nhân tạo ra hai quần thể riêng biệt; 1) MDDC và 2) MDM. Theo dõi trình duyệt bộ gen UCSC hiển thị các lần đọc RNA-Seq từ bạch cầu đơn nhân, đại thực bào và tế bào đuôi gai tạiGAPLINCquỹ tích. () Phân tích qPCR của RNA được tinh chế từ các phân đoạn hạt nhân (trắng) và tế bào chất (xám) trong MDM (phân tích G qPCR của Russ được phân lập từ các phân đoạn polysome khác nhau của hệ thống MDM (10 đến 50% gradient sucrose, SW41, 40 K vòng / phút, cho ~ 1,5 giờ).

Các nghiên cứu gần đây đã xác định được hàng nghìn ARN không mã hóa dài (ncRNA) trong bộ gen của động vật có vú có chức năng điều chỉnh sự biểu hiện gen trong các quá trình sinh học khác nhau. Mặc dù các IncRNA đã được xác định trong nhiều loại tế bào miễn dịch và liên quan đến phản ứng miễn dịch, chức năng sinh học và cơ chế của phần lớn vẫn chưa được khám phá, đặc biệt là trong nhiễm trùng huyết. Ở đây, chúng tôi xác định vai trò của một hdRNA — RNA không mã hóa dài gây ung thư biểu mô dạ dày (GAPLINC) — trước đây được đặc trưng cho vai trò của nó trong bệnh ung thư, bây giờ trong bối cảnh miễn dịch bẩm sinh, đại thực bào và sốc nội độc tố do LPS gây ra. Phân tích transcriptome của đại thực bào từ người và chuột cho thấy GAPLINC là một IndRNA được phục vụ đồng thời được biểu hiện cao sau sự biệt hóa của đại thực bào. Khi kích hoạt viêm, GAPLINC nhanh chóng được điều chỉnh. Các đại thực bào cạn kiệt GAPLINC hiển thị sự biểu hiện tăng cường của các gen gây viêm tại thời điểm ban đầu, trong khi sự biểu hiện quá mức của GAPLINC ngăn chặn phản ứng này. Phù hợp với những con chuột rút GAPLINC, những con chuột loại trực tiếp Gaplinc hiển thị mức cơ bản nâng cao của các gen viêm và cho thấy khả năng chống lạiDo LPS gây rasốc nội độc tố. Về mặt cơ học, sự sống sót có liên quan đến sự gia tăng mức độ hạt nhân NF-xB ở chuột loại trực tiếp Gaplinc thúc đẩy sự biểu hiện cơ bản của các gen mục tiêu thường chỉ được kích hoạt sau khi kích thích viêm. Chúng tôi cho thấy rằng sự kích hoạt các gen đáp ứng miễn dịch này trước thử thách LPS dẫn đến sự hình thành cục máu đông tại các khu vực, giúp bảo vệ những con chuột loại Gaplinc khỏi suy đa cơ quan và tử vong. Kết quả của chúng tôi xác định một chức năng chưa từng biết trước đây của GAPLINC như một chất điều chỉnh tiêu cực của chứng viêm và khám phá ra vai trò quan trọng của lncRNA này trong việc điều chỉnh sốc nội độc tố.

Hình 2. GAPLINC là một chất điều chỉnh tiêu cực tình trạng viêm và phụ thuộc vào tín hiệu Nf-sB. Các bạch cầu đơn nhân được phân lập từ PBMC của người và được biệt hóa thành đại thực bào được chuyển nhiễm với sự kiểm soát hoặc GAPLINC siRNA. (MỘT)Phân tích chuỗi phân tích RNAtrên GAPLINC kd hoặc điều khiển MDM siRNA. RNA-Seq được thực hiện trong các bản sao sinh học. Kết quả được thể hiện trong một âm mưu núi lửa. Các gen quy định hướng lên có ý nghĩa với sự thay đổi nếp gấp Nhiều hơn hoặc bằng 2 được đóng hộp màu đỏ. (6) Phân tích GO-Term trên các gen được điều chỉnh tăng đáng kể. (C) Bản đồ nhiệt thể hiện sự biểu hiện gen của các gen liên quan đến hệ miễn dịch hàng đầu được điều chỉnh theo GAPLINC kd. Dữ liệu từ RNA-Seq được thực hiện trong các bản sao sinh học. (D) Đồng dạng GAPLINC trong MDM được xác định bằng giải trình tự R2C2 dựa trên Nanopore. Dữ liệu từ giải trình tự Nanopore được thực hiện trong các bản sao sinh học (dữ liệu thô có sẵn tại SRAunder Bloproject PRINA639136). (E) Một bảng biểu thị số lần đọc và phần trăm của mỗi đồng dạng GAPLINC. (F) Vectơ hai chiều thể hiện GFP-Zetocin ở một bên và GAPLINC ở bên kia. (G và H) phân tích qPCR biểu hiện GAPLINC trong THP -1 ô thể hiện GAPLINC ngoài tử cung hoặc điều khiển vectơ trống. Mức IL6 được định lượng sau khi kích thích với LPS (200 nal mL) trong 6 giờ; dữ liệu được tổng hợp từ ba thử nghiệm độc lập. * p<0.05. ()="" rna-seq="" analysis="" of="" mdms="" stimulated="" with="" lps(200="" ng/ml)="" for="" the="" indicated="" time="" points.="" data="" from="" rna-seq="" was="" performed="" in="" biological="" duplicates.="" galplinc="" expression="" is="" represented="" as="" copies="" per="" cell="">FPKM), Phân tích U qPCR của GAPLINC trong MDM （n=3） được xử lý trước bằng DMSO hoặc BAY -7082 （10μM）, tiếp theo là kích thích LPS （200 ngmL） cho 6 dữ liệu ht được tổng hợp từ ba thí nghiệm độc lập. *P<0.05. (k)atacseq="" analysis="" of="" monocytes="" and="" macrophages,="" untreated="" and="" treated="" with="" lps="" (200="" ng/ml)="" for="" 1,6,="" and="" 18h.ucsc="" browser="" track="" displays="" atac-seq="" reads="" at="" the="" gaplinc="">

nhiễm trùng huyết là một căn bệnh đe dọa tính mạng do cơ thể phản ứng quá mức với sự hiện diện của nhiễm trùng, có thể nhanh chóng dẫn đến suy đa cơ quan và tử vong. Hệ thống miễn dịch rất cần thiết trong việc bảo vệ chống lại nhiễm trùng; tuy nhiên, việc kích hoạt không kiểm soát có thể gây ra hậu quả nghiêm trọng cho máy chủ. Theo Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh, cứ ba bệnh nhân tử vong tại bệnh viện thì có một người bị nhiễm trùng huyết (1). và chúng ta vẫn chưa hiểu cơ chế phân tử cơ bản dẫn đến tử vong. Các lựa chọn lâm sàng để điều trị nhiễm trùng huyết chỉ giới hạn ở việc truyền dịch, kháng sinh và chăm sóc hỗ trợ và hầu như không thay đổi trong nhiều thập kỷ. Mặc dù chẩn đoán sớm và điều trị nhanh chóng đã cải thiện kết quả nhiễm trùng huyết (2), nhưng vẫn cần phát triển các liệu pháp điều trị mới. Mặc dù các nghiên cứu biểu hiện gen đã được thực hiện để kiểm tra các mục tiêu điều trị tiềm năng đối với nhiễm trùng huyết, nhưng các mục tiêu này phần lớn vẫn chưa được xác minh (3). Chúng tôi đã xác định được một RNA không mã hóa dài (lncRNA) có vai trò trong việc kiểm soát phản ứng miễn dịch và sốc nội độc tố, cung cấp các con đường cho sự phát triển thuốc mới nhằm mục tiêu nhiễm trùng huyết.

Kết quả

Hình 3. GAPLINC được bảo tồn ở chuột và điều chỉnh phản ứng với sốc nội độc tố. (4) GAPLINC được bảo tồn trong tổng hợp. GAPLINC nằm trên Chr18in người và Chr17 ở chuột, giữa gen mã hóa protein Dlgap1 và Gift. Dlgapil không được thể hiện bằngđại thực bào. (B) MCA cho thấy sự phân bố của mức Gaplinc trong các loại tế bào miễn dịch khác nhau (BM). (C) phân tích qPCR biểu hiện Gaplinc trong các tế bào B và BMDM; những dữ liệu này (trung bình ± SD) là đại diện cho ba thí nghiệm độc lập, (D) phân tích qPCR về biểu hiện Gaping trong BMDME được kích thích với LPS (200 na / mL) trong 6 giờ; những dữ liệu này (trung bình ± SD) đại diện cho ba thí nghiệm độc lập. (E) Sơ đồ vị trí Gaplinc trước và sau khi xóa qua trung gian CRISPRCas9. Các đường đứt nét biểu thị vùng xóa gần đúng. Gel thể hiện sự khuếch đại PCR của dữ liệu bộ gen. Độ dài của amplicon được so sánh cho chuột WT và Gaping KO, (F) phân tích qPCR biểu hiện Gaplinc trong BMDM WT và Gaplinc-KO bằng cách sử dụng kết hợp các mồi để phát hiện các vùng mở rộng Exon1, Exon2 và exon của bảng điểm Gaplinc; những dữ liệu này (trung bình ± SD) đại diện cho ba thí nghiệm độc lập. (G) Phân tích RNA-Seq trong BMDM từ chuột WT và Gaplinc KO (n =3). Kết quả được thể hiện trong một âm mưu núi lửa. Các gen quy định tăng lên đáng kể có sự thay đổi lần gấp Nhiều hơn hoặc bằng 2 được biểu thị bằng màu đỏ. (H) Phân tích GO-Term trên các gen được điều chỉnh tăng đáng kể. (I và J) Dữ liệu về tỷ lệ sống sót của chuột WT và Gaplinc KO được hiển thị theo thử thách LPS của vi khuẩn E. coli (5 mg / kg / chuột) (n =6 đến 10). Kiểm tra thống kê về sự khác biệt được tính bằng cách sử dụng kiểm tra xếp hạng nhật ký (Mantel-Cox). "…P< 0.001.="" changes="" in="" body="" temperature="" of="" wt="" and="" gapline="" ko="" mice="" were="" recorded="" at="" the="" indicated="" time="" points.="" (k)="" survival="" data="" of="" wt="" and="" gaplinc="" ko="" mice="" are="" shown="" in="" response="" to="" the="" e.="" coli="" lps="" challenge(20="" mg/kg/mice)(n="10)." the="" statistical="" test="" of="" differences="" was="" calculated="" using="" the=""><>

Vì biểu hiện lncRNA có thể điều chỉnh phản ứng miễn dịch bằng cách ảnh hưởng đến sự biệt hóa tế bào miễn dịch và chức năng tương ứng của chúng (4-7), chúng tôi muốn điều tra vai trò của ncRNA trong đại thực bào. Đại thực bào là những tế bào miễn dịch bẩm sinh quan trọng có thể có nguồn gốc từ bạch cầu đơn nhân và rất quan trọng để nhận biết mầm bệnh thông qua việc sử dụng các thụ thể giống như Toll (TLR). TLR bắt đầu các con đường tín hiệu phức tạp kích hoạt các yếu tố phiên mã quan trọng như NF-kB. Tham gia vào quá trình phiên mã của hàng trăm gen đáp ứng miễn dịch (8).

Để xác định các IncRNA liên quan đến sự biệt hóa và chức năng của đại thực bào, chúng tôi đã tiến hành giải trình tự RNA (RNA-Seq) ở cả đại thực bào có nguồn gốc từ bạch cầu đơn nhân sơ cấp (MDM) và dòng tế bào đơn nhân THP -1 s (Hình. lA và Phụ lục SI. Hình. S1). Chúng tôi đã xác định ung thư biểu mô tuyến dạ dày dự đoán RNA không mã hóa dài liên gen (GAPLINC) là IncRNA được điều chỉnh tốt nhất trong quá trình biệt hóa bạch cầu đơn nhân với đại thực bào (Hình 1B). Mức GAPLINC có thể được phát hiện vào ngày đầu tiên và tăng lên ~ 300 bản sao mỗi ô (Hình 1C). Bằng cách sử dụng công nghệ cấu hình RNA (nCounter, Nanostring), chúng tôi đã xác nhận GAPLINC là một trong 10 mRNA hàng đầu được thể hiện trong các MDM chính và THP -1 khác nhau (Hình 1D). Chúng tôi cũng xác nhận rằng GAPLINC được biểu hiện nhiều trong MDM nhưng không được biểu hiện trong các tế bào đuôi gai có nguồn gốc từ tế bào monocyte có liên quan chặt chẽ (MDDCs) (Hình 1E), cho thấy rằng biểu hiện của loại tế bào GAPLINCis cụ thể. Bằng cách thực hiện một thí nghiệm phân tách tế bào và đo mức GAPLINC trong các ngăn tế bào chất và nhân của đại thực bào bằng qPCR, chúng tôi nhận thấy GAPLINC chủ yếu khu trú trong tế bào khi kết hợp với CD14, mRNA tế bào chất và NEAT1, một IncRNA nhân (Hình. 1F). Điều này phù hợp với những phát hiện trong tế bào ung thư, trong đó GAPLINC chủ yếu được khu trú trong tế bào chất (9). Để đảm bảo GAPLINC không mã hóa, chúng tôi đã thực hiện trình đơn polysome, một phương pháp được sử dụng để phân tích xem một gen có được dịch mã tích cực thành protein hay không. Ngược lại với CD14, cả NEATI và GAPLINC đều không được tìm thấy trong phần polysome cao, cho thấy rằng GAPLINC không được dịch mã (Hình 1G),

Hình 4. Gaplnc KO điều chỉnh IRGs và cho thấy mức p65 tăng lên ở chế độ khỏa thân tại thời điểm ban đầu. (A) Mức cytokine trong huyết thanh của chuột WT và Gaplinc KO ở mức basal.n =4 đến 7, * P<0.05.(b and="" c)rna-seg="" analysis="" in="" bmdms="" from="" wtand="" gaplinx="" ko="" mice="" stimulated="" with="" lps="" (200naiml)for6h="" (n="3)." the23aenes="" up-regulated="" in="" gap/inc="" ko-only="" condition="" are="" compared="" to="" wt="" and="" gapfinc-ko="" bmdms="" stimulated="" with="" lps.="" the="" resulting="" fold="" change="" upon="" lps="" stimulation="" is="" shown="" for="" wt="" and="" gapinc-ko="" bmdms.genes="" are="" ranked="" according="" to="" their="" fold="" change="" in="" wt.="" (d)="" coagulation="" parameters="" assessed="" for="" wt="" and="" gapinc="" ko="" mice="" challenged="" ip.with="" e.="" coils(5mg/kg/mice)(n="4" to="" 5).plasma="" was="" collected="" 18h="" post-lpsiniection.="" aptt="" was="" measured.="" (e)genes="" upregulated="" non="" sirna="" kd="" of="" human="" gaplnc="" in="" mdms="" are="" compared="" to="" genes="" up-regulated="" upon="" crsprcas9="" knockout="" of="" mouse="" gaplincin="" bmdms="" (fold="" change="" ≥1.5).="" up-regulated="" genes="" overlapping="" in="" both="" humans="" and="" mice="" are="" shown="" in="" the="" middle.="" (f)="" western="" blot="" of="" kb-gin="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" at="" the="" indicated="" time="" points="" following="" stimulation="" with="" lps="" (200="" ngml);="" these="" data="" are="" representative="" of="" three="" independent="" experiments,(g)="" western="" blot="" of="" p65="" in="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="3)" at=""><0.01. (h="" western="" blot="" of="" p65="" in="" the="" nuclear="" fraction="" of="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="">

Tiếp theo, chúng tôi nghiên cứu tác động của GAPLINC làm im lặng đối với việc phân biệt các đại thực bào. Khi mức GAPLINC tăng lên trong quá trình biệt hóa, chúng tôi đã giả thuyết rằng việc hạ gục GAPLINC (KD) sẽ tác động đến các gen liên quan đến sự khác biệt. Sử dụng RNA can thiệp nhỏ (siRNA) tổng hợp, chúng tôi đã đạt được ~ 55 đến 65 phần trăm kd GAPLINC trong MDM chính (Phụ lục SIA, Hình S2). Chúng tôi đã thực hiện RNA-Seq và xác định một số gen bị rối loạn điều hòa dựa trên GAPLINC kd (Hình 24). Chúng tôi đã xác nhận các lượt truy cập hàng đầu bằng Nanostring (Phụ lục SI, Hình S3). Phân tích làm giàu Gene Ontology (GO) cho thấy rằng các gen đáp ứng miễn dịch đại diện quá mức trong các gen được điều chỉnh theo GAPLINC kd và không phải các gen liên quan đến sự biệt hóa đại thực bào, trái với giả thuyết ban đầu của chúng tôi. (Hình 2B). Đáng chú ý, các gen được biểu hiện khác biệt trong tế bào GAPLINC-KD bao gồm các cytokine tiền viêm và chemokine (IL6, CXCL10 và TNFSF10), các gen được kích thích bởi IFN (ISG) (IFIT2 và RSAD2), và các protein liên kết guanylate (GBPs) (GBP3 và GBP5) (Hình 2C và Phụ lục SI. Hình S4). Để xác minh rằng sự biệt hóa của đại thực bào không bị ảnh hưởng bởi GAPLINC kd. nồng độ CD11B.CD16 và CD14 được đo trong các đại thực bào được xử lý tín hiệu và kiểm soát và được thấy là tương tự nhau (Phụ lục SI. Hình S5). Tiếp theo, chúng tôi sử dụng một cách tiếp cận kd bổ sung bằng cách sử dụngCRISPRức chế (CRISPRi) để nhắm mục tiêu đến vị trí bắt đầu phiên mã bằng GAPLINSử dụng ba RNA dẫn đường (gRNA) khác nhau trong các tế bào THP -1 được kích thích bằng phorbol 12- myristate 13- acetate (PMA). Chúng tôi đã đạt được hơn 80 phần trăm kd của GAPLINC và một lần nữa quan sát thấy biểu hiện tăng lên của cytokine IL6 tiền viêm khi GAPLINC bị hạ gục lúc ban đầu (Phụ lục SI. Hình S6 A và B). Điều thú vị là, sau khi kích hoạt lipopolysaccharide (LPS), mức IL6 tương tự trong tế bào đối chứng so với GAPLINC kd THP -1 (Phụ lục SIA, Hình S6C). Vì các mức cơ bản khác nhau, cảm ứng nếp gấp tổng thể của IL6 bị giảm khi GAPLINC bị loại bỏ. (Phụ lục S7, Hình S6D).

Vì GAPLINC kd dẫn đến việc điều hòa các gen đáp ứng miễn dịch, chúng tôi đã tạo ra một dòng tế bào THP -1 biểu hiện quá mức GAPLINC để xác định xem nó có làm trung gian cho tác động ngược lại hay không. Sử dụng dữ liệu trình tự đã đọc lâu. chúng tôi đã xác định các dạng đồng dạng thống trị của GAPLIN được thể hiện trong MDM (Hình. 2D). Dạng isoform phong phú nhất, khớp với chú thích gen Trình tự tham chiếu (RefSeq), đã được đưa vào cấu trúc của chúng tôi (Hình 2E). Chúng tôi đã sử dụng một vectơ phân tử có chứa promoter hai chiều để điều khiển song song protein huỳnh quang xanh (GFP) / Zeocin và GAPLINC (Hình 2F). Chúng tôi xác nhận bằng cách sử dụng qPCR rằng GAPLINC được thể hiện ổn định trong THP -1 so với đối chứng (Hình 2G). Sự biểu hiện quá mức của GAPLINC làm giảm IL6 ở mức RNA so với đối chứng sau khi kích thích bằng LPS, một thành phần của vi khuẩn gram âm (Hình 2H). Những quan sát này cho thấy GAPLINC hoạt động như một chất điều hòa tiêu cực đối với phản ứng viêm.

Tiếp theo, chúng tôi kiểm tra mức GAPLINC trong MDM chính để phản ứng với tình trạng viêm. Khi kích thích LPS, chúng tôi nhận thấy rằng GAPLINC nhanh chóng được điều chỉnh (Hình 2I). Ngoài ra, bằng cách sử dụng qPCR, chúng tôi cho thấy rằng GAPLINC cũng bị hạn chế sau khi kích hoạt với nhiều loạiTLRphối tử (Phụ lục SI, Hình S7A). Sự cảm ứng của các gen viêm kiểm soát dương tính TNF-a, IL6 và CCL5 đã được xác nhận (Phụ lục SI, Hình S7B). Những dữ liệu này gợi ý rằng biểu hiện GAPLINC phải được giảm bớt sau khi kích thích để sự cảm ứng gen viêm tối ưu xảy ra. Để đánh giá vai trò của NF-kB trong việc kiểm soát sự biểu hiện của GAPLINC, MDM đã được xử lý trước bằng dimethyl sulfoxide (DMSO) hoặc BAY 11-7082, một chất ức chế NF-B,

tiếp theo là kích thích với LPS trong 6 giờ. Ở BAY 11-7082- MDM được điều trị. sự điều chỉnh giảm của GAPLINC đã bị suy giảm so với sự kiểm soát (Hình 2 /). điều này cho thấy quy định của GAPLINC phụ thuộc vào tín hiệu NF-KB. Sự cảm ứng của các gen viêm kiểm soát tích cực TNF- và IL6 khi kích thích LPS đã được xác nhận (Phụ lục SIA, Hình, S7C). đánh giá khả năng tiếp cận nhiễm sắc của locus GAPLINC. Chúng tôi nhận thấy rằng GAPLINC được phiên mã tích cực trong các macro-phage đang nghỉ ngơi nhưng đóng chặt lại sau khi kích thích LPS (Hình 2K), cho thấy rằng GAPLINC được điều chỉnh ở mức độ phiên mã.

Để khám phá sự bảo tồn của GAPLINC giữa người và chuột. chúng tôi đã tìm cách xác định các locus tổng hợp, trong đó các gen được bảo tồn vị trí giữa hai gen mã hóa protein giống nhau. tiếp theo là đánh giá để bảo tồn chức năng. Ở đây, chúng tôi cho thấy rằng Gaplinc được bảo tồn theo vị trí, xác định vị trí bản sao giữa các gen Dlgap1 và TgifI (Hình 3A).

(10) để đánh giá mức độ sao chép trên các tế bào miễn dịch trong tủy xương (BM) và nhận thấy nó được biểu hiện cao nhất ở đại thực bào, với mức độ biểu hiện thấp hơn ở tế bào tiền nhân trung tính (Hình 3B). Tiếp theo, để xác định xem các mẫu biểu hiện có được bảo tồn trong quá trình biệt hóa đại thực bào ở cả người và chuột hay không, chúng tôi đã thực hiện RNA-Seq so sánh tế bào BM với đại thực bào có nguồn gốc từ tủy xương (BMDM), hoàn thành quá trình lắp ráp phiên mã de novo và nhận thấy mức Gaplinc của chuột tăng lên sau quá trình biệt hóa (Phụ lục SI, Hình S8A). Chúng tôi đã xác nhận điều này bằng qPCR, so sánh mức Gaplinc trong các tế bào BM với BMDM (Hình 3C). Có thể so sánh với GAPLINC của con người. chuột Gaplinc được điều chỉnh nhanh chóng trong các BMDM được kích thích bởi LPS (Hình.3D). Để kiểm soát, chúng tôi xác nhận sự cảm ứng của các gen gây viêm The-a và I6 (Phụ lục SI. Hình S8B). Mouse Gaplinc cũng được điều chỉnh nhanh chóng sau khi kích hoạt với các phối tử TLR khác nhau. Sự cảm ứng của các gen kiểm soát tích cực ll6 và Ccl5 cũng đã được xác nhận (Phụ lục SI, Hình. S8C).

Sử dụng CRISPR, chúng tôi đã tạo ra một con chuột Gaplinc knockout (KO) trong đó Exon I và phần lớn intron đầu tiên đã bị loại bỏ (Hình 3E). Chuột Chaplin KO sinh sản bình thường và không có khuyết tật phát triển rõ ràng. Việc xóa Gapline được xác nhận bằng cách khuếch đại PCR của DNA bộ gen ở chuột kiểu hoang dã (WT) và Gaplinc KO, với kích thước amplicon ~ 1.300 bp đối với WT và ~ 500 bp đối với chuột Gaplinc KO (Hình 3E), Chiến lược định dạng gen đầy đủ để xác nhận WT và Gaplinc KO được tô sáng trong Phụ lục SI, Hình S9. Chúng tôi cũng xác nhận sự thiếu hụt Gaplinc trong BMDM bằng cách sử dụng qPCR (Hình 3F). Để đánh giá xem sự thiếu hụt Gaplinc có ảnh hưởng đến sự phân hóa hay không, chúng tôi nhuộm WT và Gaplinc-KO BMDMs cho CD11B và F4 / 80; các kiểu nhuộm tương tự nhau, gợi ý sự biệt hóa đại thực bào bình thường (Phụ lục SI, Hình S104). Để đánh giá xem liệu Gaplinc KO có phá vỡ chức năng của đại thực bào hay không, chúng tôi so sánh hoạt động thực bào ở các BMDM WT và Gaplinc-KO và không tìm thấy sự khác biệt nào (Phụ lục SI, Hình 10B).

Để đánh giá tác động toàn cầu của sự thiếu hụt Gaplinc trong đại thực bào, chúng tôi thực hiện RNA-Seq trên WT và Gaplinc-KO BMDMs; cả hai đều không được điều trị và LPS được kích thích trong 6 giờ. Trong Gaplinc-KO BMDMs, sự biểu hiện của 23 gen (được hiển thị bằng màu đỏ. Hình 3G) đã được điều chỉnh một cách đáng kể ở thời điểm ban đầu. Các gen này bao gồm các cytokine tiền viêm và chemokine (Il6.l 1- a. I 1-8 và Cxd1 0), ISGs (Ifitlbl1), các thành viên gia đình GBP (Gbp5 và Gbp0), và Các dấu hiệu bề mặt tế bào đặc trưng cho các đại thực bào đã hoạt hóa (Cd69). Phân tíchGO đã xác nhận rằng các gen liên quan đến phản ứng miễn dịch được đại diện quá mức trong Gaplinc-KO BMDMs tại thời điểm ban đầu (Hình 3H). Những gen này thường được điều chỉnh tăng sau khi kích thích LPS (Phụ lục SI. Hình. S11). Tương tự như dữ liệu thu được từ các nghiên cứu trên người của chúng tôi, những dữ liệu này cho thấy rằngGAPLINCđược bảo tồn về mặt chức năng giữa các loài để kiểm soát cơ bản sự biểu hiện của các gen phản ứng viêm (IRGs). Không có sự khác biệt lớn về các gen được điều chỉnh sau khi kích thích LPS giữa WT và Gaplinc-KO BMDM (Dataset S1).

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra khả năng của các IncRNA để điều chỉnh quá trình phiên mã của các gen lân cận (11). Do đó, chúng tôi đã khám phá các vai trò điều hòa cis tiềm năng đối với Gaplinc vì gen lân cận của nó, Tgif1, trước đây có liên quan đến việc điều chỉnh sự hoạt hóa của đại thực bào (12). Sử dụng dữ liệu RNA-Seq của chúng tôi, chúng tôi xác nhận rằng trong GaplincKO BMDM, sự biểu hiện của Tgifl so với tế bào T không bị ảnh hưởng (SIAppendir.Fig.S124). Chúng tôi xác nhận thêm bởi qPCR rằng Tgifl không bị thay đổi trong Gaplinc-KO BMDM (Phụ lục SI, Hình. S12B). Tiếp theo, chúng tôi khám phá khả năng sự gián đoạn của quỹ đạo Gaplinc có thể loại bỏ một yếu tố quy định quan trọng, chẳng hạn như một chất tăng cường. Chúng tôi đã sử dụng dữ liệu ATAC-seq từ WT BMDM để đánh giá các vùng hoạt động phiên mã trong locus Gaplinc (13). Chúng tôi không xác định được các tín hiệu trong vùng xóa Gaplinc, chỉ những tín hiệu tương ứng với vùng khởi động Gaplinc (Phụ lục SI. Hình 13). Nói chung, những dữ liệu này gợi ý rằng việc tăng cường điều chỉnh IRG khi thiếu hụt Gaplinc không phải do tác động lên các gen lân cận hoặc loại bỏ yếu tố điều hòa.

Vì Gaplinc KO trong BMDMs điều chỉnh sự biểu hiện của IRG trong điều kiện cơ bản, nên tiếp theo, chúng tôi muốn thử thách động vật Gaplinc KO in vivo để quan sát sự khác biệt trong phản ứng của vật chủ. Chúng tôi đã sử dụng một mô hình "sốc nội độc tố". trong đó Escherichia coli LPSwas trong phúc mạc (ip) được tiêm vào chuột WT và Gaplinc KO để đo lường sự khác biệt về tỷ lệ sống sót. Với liều lượng 5 mg / kg / chuột. Chuột WT cho thấy 0 phần trăm sống sót sau 2 ngày (Hình 30. Tuy nhiên, 100 phần trăm chuột Gaplinc KO sống sót, nhận thấy rằng chuột Gaplinc KO có khả năng chống lại cú sốc nội độc tố do LPS gây ra (Hình 31). Đáng chú ý là quan sát thấy sự khác biệt nhiệt độ đáng kể giữa chuột thiếu WT và chuột thiếu Gaplinc (Hình 3). , những dữ liệu này cho thấy Gaplinc đóng một vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh phản ứng miễn dịch in vivo.

Từ các nghiên cứu trên người, chúng tôi biết rằng GAPLINC có thể phục hồi các gen miễn dịch muộn ở ban đầu. Mặc dù không có sự khác biệt về biểu hiện cytokine sau khi kích hoạt viêm, nhưng có sự khác biệt về mức độ phản ứng do các mức ban đầu khác nhau. Chúng tôi đã sử dụng một mảng cytokine đa hợp để đo lường đồng thời các dấu ấn sinh học liên quan đến tái bảo trợ miễn dịch, nhiễm trùng huyết và ung thư. Tại thời điểm ban đầu, các gen miễn dịch quan trọng bao gồm MDC. MIP -1 a.IL -13. IL -5. và M-CSF tăng cao đáng kể trong huyết thanh của chuột Gqplinc KO so với WT (Hình 44). Các cytokine này có liên quan đến việc tuyển chọn tế bào: tuy nhiên, bằng cách sử dụng phương pháp đo tế bào dòng chảy, chúng tôi xác nhận tỷ lệ phần trăm bạch cầu trung tính, tế bào T, tế bào B, bạch cầu ái toan, bạch cầu đơn nhân và đại thực bào có thể so sánh được giữa WT và Gaplinc KOmice tại thời điểm ban đầu (Phụ lục SI, Hình S14) . Điều thú vị là các tỷ lệ phần trăm này cũng có thể so sánh với các thử thách sau LPS tại các thời điểm 6 giờ và 18 giờ (Phụ lục SI, Hình S15 và S16). Hơn nữa, huyết thanh từ chuột WT và Gaplinc KO được kiểm tra các đặc điểm lâm sàng của nhiễm trùng huyết, bao gồm lactate và protein phản ứng C (CRP) (Phụ lục S7, Hình. S17), không cho thấy sự khác biệt

Khi mức MDC hoặc IL tăng lên -13 (Hình.44) trước đây đã được đặc trưng để đóng vai trò bảo vệ chống lại sốc nội độc tố thông qua điều biến các cytokine tiền viêm (14,15), tiếp theo chúng tôi kiểm tra sự khác biệt về mức cytokine tiền viêm , bao gồm l6, Il 1-, l 1- và Cxcl10, sau khi kích hoạt viêm. Trong khi mức WT và Gaplinc KO giống nhau ở cả bảng điểm (Hình 4B) và mức protein (Phụ lục SI, Hình 18A-C), mức độ thay đổi thấp hơn nhiều (Hình 4C), cho thấy mức độ giảm này thay đổi có thể đóng một vai trò trong việc ngăn ngừa sự nhạy cảm của chuột Gaplinc KO với LPS. gây sốc nội độc tố.

Cùng với việc sản xuất tràn lan các cytokine. một khía cạnh lâm sàng khác của sốc nội độc tố có thể dẫn đến tử vong là sự hình thành cục máu đông trong các mạch nhỏ hơn, dẫn đến suy đa cơ quan (16.17). Để giải quyết vấn đề này, chúng tôi đã phân tích huyết thanh của những con chuột được điều trị bằng LPS ip. để đánh giá sự khác biệt trong quá trình đông máu. Sử dụng xét nghiệm thời gian thromboplastin một phần được kích hoạt (a) đo thời gian hình thành cục máu đông, chúng tôi thấy rằng chuột WT cho thấy thời gian kéo dài đáng kể so với chuột Gaplinc KO khi thử thách LPS (Hình 4D). Thời gian aPTT kéo dài cho thấy chuột WT đã trải qua quá trình đông máu và cạn kiệt các yếu tố đông máu quan trọng, do đó tại thời điểm thử nghiệm, bắt đầu đông máu và đo, thời gian hình thành cục máu đông được tăng lên. Dữ liệu cho thấy rằng sự khác biệt về khả năng sống sót khi thử thách LPS là do chuột WT trải qua quá trình đông máu, dẫn đến suy các cơ quan cuối cùng và tử vong.

Tiếp theo, chúng tôi cố gắng tìm hiểu một cách máy móc cách Gaplinc làm trung gian cho hiệu ứng này. Đầu tiên, chúng tôi xác nhận bản địa hóa của nó và phân tích mức Gaplinc trong cả ngăn tế bào chất và hạt nhân của BMDM bằng qPCR. Tương tự với GAPLINC của con người. chuột Gaplinc chủ yếu là tế bào chất (Phụ lục ST, Hình 19). Tiếp theo, chúng tôi thực hiện Xác định toàn diện đã sửa đổi các protein liên kết RNA (ChIRP), cùng với phép đo khối phổ và giải trình tự RNA nhỏ, vì GAPLINC trước đây đã được chứng minh là tương tác với các RNA vi mô (18). Chúng tôi không quan sát thấy các tương tác với các mục tiêu đã xác định trước đó (Phụ lục SIA, Hình S20).

Vì chúng tôi không thể xác định đối tác liên kết trực tiếp, chúng tôi tập trung vào chức năng được bảo tồn giữa người và chuột, cụ thể là các gen được bảo tồn bị ảnh hưởng trong các nghiên cứu GAPLINC kd ở người và chuột Gaplinc KO của chúng tôi, phần lớn trong số đó là các cơ quan điều hòa NF-kB (Hình 4E ). Dạng NF-KB phong phú nhất được kích hoạt bởi LPS là heterodimer p65: p50, và bảy trong số chín gen được bảo tồn là mục tiêu p65 trực tiếp (19). Chúng tôi đã sử dụng kết tủa miễn dịch RNA tự nhiên (RIP) và cho thấy rằng không có tương tác trực tiếp giữa Gaplinc và p65 (Phụ lục S7, Hình S21). để ức chế I-kB- trong tế bào đang nghỉ ngơi. Sau khi được kích hoạt, I-KB- bị phân hủy, cho phép p65: p50 chuyển vị vào nhân và kích hoạt các gen mục tiêu (20). Trong các BMDM WT và Gaplinc-KO, chúng tôi đo lường sự suy thoái của I-kB- bằng cách sử dụng Western blot và không tìm thấy sự khác biệt nào (Hình 4F). Tiếp theo, chúng tôi so sánh tổng mức p65 trong BMDM. Trong dữ liệu RNA-Seg của chúng tôi, mức phiên mã p65 (RelA) ở cả điều kiện cơ bản và điều kiện kích thích LPS cho WT và Gaplinc-KO BMDM đều có thể so sánh được (Phụ lục SI, Hình. S22). Tuy nhiên, khi chúng tôi so sánh tổng mức protein p65 theo Western blot, chúng tôi thấy mức p65 tăng lên đáng kể trong Gaplinc-KOcells so với WT (Hình. 4G). Điều này cho thấy rằng Gaplinc điều chỉnh tổng mức p65 ở mức tịnh tiến. Ngoài ra, chúng tôi đánh giá mức độ p65 trong các ngăn tế bào chất và hạt nhân và nhận thấy rằng hạt nhân p65 có nhiều hơn trong các tế bào thiếu Gaplinc so với WT (Hình 4H). Kết hợp lại, những dữ liệu này cho thấy vai trò cơ học của GAPLINC trong việc tạo mồi kích hoạt các IRG quan trọng.

Thảo luận

Ở đây, chúng tôi đã xác định GAPLINC là một IncRNA biểu hiện tế bào được bảo tồn ở người và chuột, có chức năng kiểm soát biểu hiện gen viêm thông qua điều hòa NF-xB. So với các IncRNA tế bào được báo cáo có tác động đến hiệu quả dịch mã bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện protein hoặc sự lắp ráp ribosome (21-23), chúng tôi nhận thấy Gapline đóng góp về mặt tế bào vào khả năng dịch mã p65; tuy nhiên, cơ chế tương tác, trực tiếp hoặc gián tiếp, vẫn còn phải được xác định. Phát hiện của chúng tôi cung cấp những hiểu biết sâu sắc về cách một IncRNA được bảo tồn về mặt chức năng điều chỉnh phản ứng miễn dịch và cung cấp các con đường điều tra để phát triển các liệu pháp điều trị sốc nội độc tố.