Chiến lược chống kích ứng chống lại Retinol dựa trên phân tích di truyền của dân số Hàn Quốc: Cách tiếp cận từ trên xuống dưới được hướng dẫn về mặt di truyền

từ khóa: retinol; retinoid;mỹ phẩm; chống kích ứng; tùy chỉnh về mặt di truyền; đa hình đơn nucleotide

Bấm vào đây để biết thêm thông tin về điều trị chống lão hóa Cistanche

1. Giới thiệu

Retinoids, một họ hợp chất có nguồn gốc từ vitamin A bao gồm cả hợp chất tổng hợp và tự nhiên, đã được nghiên cứu chuyên sâu và sử dụng trong các ứng dụng y sinh đa dạng nhưđiều trị ung thư(bệnh bạch cầu myeloid cấp tính), tân sinh cổ tử cung, Vàrối loạn datrong vài thập kỷ qua. Ứng dụng rộng rãi của retinoids, đặc biệt là axit retinoic, dựa trên tiền đề khoa học rằngacid retinoictham gia vào nhiều con đường sinh học trong tự nhiên bằng cách kích hoạt sự tương tác giữa các thụ thể hạt nhân kiểm soát biểu hiện gen [1–5]. Một trong những ứng dụng nổi bật nhất của retinoids là phương pháp điều trị da liễu, cùng với dược phẩm và mỹ phẩm. Kể từ khi retinoids lần đầu tiên được sử dụng để điều trị mụn trứng cá vào những năm 1940, hiệu quả điều trị của nó đối với các rối loạn về da như dày sừng quang hóa, bệnh vẩy nến và bệnh vảy cá đã được báo cáo [6]. Vì nhiều nghiên cứu khoa học và nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh hiệu quả điều trị của tretinoin (axit all-trans retinoic) đối với quá trình lão hóa do quang hóa, sự phát triển của các dẫn xuất retinoid để sử dụng làm thành phần mỹ phẩm đã được kích hoạt. Retinoid mỹ phẩm, bao gồm retinyl palmitate, retinyl axetat, retinol và retinal đã được nghiên cứu kỹ lưỡng trên thị trường thương mại kể từ khi axit retinoic bị cấm trong các sản phẩm mỹ phẩm theo các quy định toàn cầu như Phụ lục II 375 (EC 1223/2009). Một số nghiên cứu đã tiết lộ rằng các retinoids mỹ phẩm này cũng có hiệu quả trong điều trị lão hóa do ánh nắng, mà các đặc điểm bệnh lý liên quan đến nếp nhăn nhỏ và thô, da sần sùi và sắc tố bất thường, thậm chí còn lập luận rằng chúng có tác dụng mạnh như tretinoin [7].

Tuy nhiên, retinoids gây kích ứng và một số tác dụng phụ đặc trưng bởi ban đỏ, đóng vảy, nóng rát và ngứa, còn được gọi là viêm da retinoid [8]. Một số nghiên cứu đã điều tra cơ chế kích ứng và gợi ý rằng các cơ chế khác nhau có liên quan đến kích ứng do retinoid gây ra, bao gồm tình trạng viêm lan rộng và lan rộng được đặc trưng bởi sự giải phóng các cytokine và sự xâm nhập của các tế bào miễn dịch [9], và sự phá vỡ hàng rào bảo vệ da được đặc trưng bởi bởi sự mất cân bằng di truyền của các yếu tố liên quan đến lớp vỏ sừng hóa (CE) [10,11]. Ngoài ra, độc tính quang học của retinoid và các sản phẩm phụ bị thoái hóa của nó do tính không ổn định của nó dưới tia cực tím và nhiệt đã được đề xuất rộng rãi để góp phần gây kích ứng do retinoid gây ra [12]. Tuy nhiên, những quan sát này không đủ để giải thích cặn kẽ tình trạng kích ứng do retinoid gây ra và cho đến nay vẫn chưa có kết luận rõ ràng nào. Vì lý do này, các sản phẩm dựa trên retinol hiện nay thường có công thức chống viêm khá "tẻ nhạt", được sử dụng chung và phổ biến trong các sản phẩm thương mại nói chung. Do đó, một chiến lược chống kích ứng chống lại retinol dựa trên nền tảng khoa học vững chắc vẫn chưa được thiết lập.

Phương pháp di truyền có thể là một giải pháp khác để thiết lập chiến lược chống kích ứng chống lại retinol. Các biến thể di truyền đã được nghiên cứu rộng rãi để khám phá các gen liên quan đến hiệu quả của thuốc và tác dụng phụ [13]. Nelson và cộng sự. cho thấy rằng các loại thuốc được dự đoán bởi các hiệp hội di truyền đã biết chỉ chiếm 2.0 phần trăm thuốc ở giai đoạn tiền lâm sàng, mặc dù tỷ lệ này tăng lên 8,2 phần trăm trong các loại thuốc đã được phê duyệt [14]. Điều này ngụ ý rằng việc tập trung vào các mục tiêu được phát hiện bởi các nghiên cứu di truyền sẽ làm tăng đáng kể cơ hội phát triển thuốc thành công, như đã được chứng minh với các loại thuốc điều trị cholesterol hoặc viêm khớp dạng thấp [15-18].

Điều trị bằng retinol gây ra những thay đổi trong biểu hiện của các yếu tố phiên mã liên quan đến sự phát triển của tế bào [19] và protein cấu trúc [11]. Cụ thể hơn, nhiều loại protein có liên quan đến kích ứng do retinol gây ra, bao gồm các cytokine liên quan đến viêm (MCP-1, TNF-a, interferon và interleukin) [9], thụ thể axit retinoic (RARG) [ 20], tiềm năng thụ thể thoáng qua kênh cảm nhận đau vanilloid 1 (TRPV1) [21] và GPCR kích hoạt tế bào mast (MRGPRX2) [22]. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu di truyền chỉ giới hạn ở một gen hoặc con đường duy nhất và cơ chế toàn diện của viêm da retinoid vẫn chưa được làm sáng tỏ. Do đó, một phân tích "gen ứng cử viên" về kích ứng do retinoid gây ra đã được tiến hành để sàng lọc các chất chống kích ứng chống lại viêm da retinoid và kết quả tương tự sẽ bổ sung vào nhóm gen mục tiêu hiện tại để nghiên cứu viêm da retinoid.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu này được thiết kế như thể hiện trong Hình 1. Tóm lại, kiểu hình cho kích ứng do retinol gây ra từ đánh giá lâm sàng đầu tiên trên 173 người Hàn Quốc đã được thực hiện. Thông qua phân tích di truyền, các dấu hiệu di truyền đã được sàng lọc, các chất chống kích ứng và công thức đã được nghiên cứu. Sau đó, một nghiên cứu thử nghiệm quy mô nhỏ (n=7) và đánh giá lâm sàng quy mô lớn (thứ 2, n=91) ​​đã được thực hiện để xác minh hiệu quả chống kích ứng của công thức mới được phát triển.

Hình1.Thiết kế nghiên cứu.Sơ đồ trên(biểu đồ dòng chảy)mô tả quy trình tổng thể của nghiên cứu.Bảng dưới biểu thị ba thử nghiệm chính dựa trên con người.Retinol1IU đề cập đến 3×10−5 phần trăm w/chiến thắng trong công thức.(2500IU=0.075 phần trăm w/w;3300IU=0.1 phần trăm w/ w;5000IU=0.15 phần trăm w/w).

2.2. Kiểu hình của kích ứng do Retinol gây ra

đã được thông báo về các thành phần của kem trước khi thử nghiệm và những người tham gia bị kích ứng da với bất kỳ thành phần nào trong kem, ngoại trừ retinol, đã bị loại khỏi thử nghiệm. Quy trình chi tiết được mô tả trong Thông tin hỗ trợ.

2.3. Microarray đa hình nucleotide đơn (SNP)

DNA bộ gen được chiết xuất từ ​​​​các mẫu nước bọt bằng QIAmp Mini Prep Kit (QIAGEN, Germantown, MD, USA). Kiểu gen được thực hiện bằng cách sử dụng chip thử nghiệm sàng lọc toàn cầu phiên bản 2 theo giao thức thử nghiệm sàng lọc thông lượng cao (HTS) của Illumina Infifinium (Illumina, San Diego, CA, USA). Cường độ hạt thu được bằng cách sử dụng iScan®instrument và sau đó được sử dụng để tạo dữ liệu kiểu gen bằng phần mềm GenomeStudio® (Illumina, San Diego, CA, USA).

Kiểm soát chất lượng của dữ liệu kiểu gen được ưu tiên thực hiện trong các điều kiện sau: Trong số các mẫu có kiểu gen, các cá nhân có tỷ lệ gọi kiểu gen thấp hơn 98 phần trăm đã bị loại trừ. Đối với các biến thể có kiểu gen, SNP có tỷ lệ gọi thấp hơn 98 phần trăm , tần số alen phụ thấp hơn 1 phần trăm , sai lệch so với trạng thái cân bằng Hardy–Weinberg (giá trị p HWE < 1 × 10−6) và những biến thể có nhiều hơn hai alen đã bị loại trừ. Trong số 173 cá thể có kiểu gen, 159 cá thể đã vượt qua tiêu chí QC và được chọn để phân tích thêm.

2.4. Đánh giá kích ứng

Hai loại kem, cụ thể là kem kiểm soát với 5000 IU retinol và kem dựa trên công thức chống kích ứng (AF) với 5000 IU retinol, đã được sử dụng cho bảy cá nhân (ba nam và bốn nữ) trong nghiên cứu thí điểm. Các cá nhân thoa kem lên mặt trước khi đi ngủ theo cách sau: một loại kem trên một nửa khuôn mặt và một loại khác trên nửa mặt còn lại. Các đối tượng thử nghiệm được làm mù kem có chứa công thức chống kích ứng (mù đơn). Sau ba ngày áp dụng, các đối tượng được yêu cầu ngừng ứng dụng trong 4 ngày. Đỏ da và mất nước qua biểu bì (TEWL) được đo bằng máy đo sắc ký (CR-400, Konica Minolta, Osaka, Nhật Bản) và Tewameter® (TM 300 E, Courage plus Khazaka Electronic GmbH, Köln, Đức), tương ứng. Để đo ngưỡng áp suất đau (PPT), người ta đã chế tạo và sử dụng một máy đo độ cao có đường kính đầu dò là 1 mm kết hợp với một ống đong. Trước khi đo, khuôn mặt của các đối tượng được làm sạch và thích nghi trong 20 phút trong phòng máy lạnh (nhiệt độ, 23 ± 2◦C; độ ẩm tương đối, 50 ± 10 phần trăm).

Xem xét rằng kích ứng do retinoid gây ra gây ra rất nhiều loại kích ứng và mức độ nghiêm trọng, có vẻ như các hướng dẫn đo kích ứng truyền thống chủ yếu tập trung vào ban đỏ được đề xuất bởi hướng dẫn của Frosh và CTFA [23] không định tính hoặc định lượng hiệu quả các kích ứng này. Do đó, chúng tôi đã thiết kế lại hướng dẫn tự đánh giá về kích ứng da, như trong Bảng S1 (xem Tài liệu bổ sung). Việc tự đánh giá này được thực hiện trong một nghiên cứu thí điểm nhỏ và đánh giá lâm sàng quy mô lớn lần thứ hai.

2.5. Chuẩn bị tế bào và thí nghiệm trong ống nghiệm

Thông tin chi tiết về việc chuẩn bị tế bào và quy trình thí nghiệm trong ống nghiệm được cung cấp trong Thông tin bổ sung. Tóm lại, các tế bào sừng, nguyên bào sợi, tế bào mast và TRPV{{0}}HEK biểu hiện quá mức đã được nuôi cấy bằng cách sử dụng các thí nghiệm và quy trình nuôi cấy riêng. RT-PCR, giải phóng -hexosaminidase và dòng canxi đã được phân tích. 2.6. Phân tích thống kê Phân tích thống kê được thực hiện bằng SNP và Variation Suit (SVS) v8.9.0 (Golden Helix, Bozeman, MT, USA) và PLINK 1.90 (Cambridge, MA, USA) [24]. Để phân tích gen ứng cử viên, SNP trong các gen ứng cử viên (bao gồm vùng quảng bá −2 kb và vùng hạ lưu 500 bp) đã được trích xuất. Ý nghĩa thống kê của các hiệp hội và tỷ lệ chênh lệch được xác định bằng thử nghiệm hiệp hội kiểu gen với một mô hình phụ gia. Trước khi tính điểm rủi ro đa gen, sự mất cân bằng liên kết (LD) đã được kiểm tra và SNP được chọn bằng Haploview 4.2 (Cambridge, MA, USA). [25]. Các alen cho thấy xu hướng gia tăng kích ứng do retinol gây ra đã được sử dụng để phân tích. Điểm rủi ro đa gen được tính bằng tổng trọng số của các tỷ lệ chênh lệch của mỗi alen [26]. Quá trình tiền xử lý dữ liệu đầu vào, tạo một tập hợp con ngẫu nhiên gồm những người tham gia để xác thực lặp lại và tính toán điểm rủi ro đa gen được thực hiện bằng cách sử dụng mã được viết tùy chỉnh trong R v.4.0.3. GraphPad Prism v7.04 (Phần mềm GraphPad, San Diego, CA, USA) đã được sử dụng để trực quan hóa dữ liệu. Các thanh lỗi có giá trị được lấy bằng cách chia từng độ lệch chuẩn cho căn bậc hai của số lượng mẫu được hiển thị trong các hình.

Trong phân tích tỷ lệ xuất hiện kích ứng dựa trên câu hỏi phân đôi (kem retinol có gây kích ứng hay không: Y/N), thử nghiệm chi bình phương đã được thực hiện để điều tra ý nghĩa thống kê.

3. Kết quả và thảo luận

3.1. Đề xuất các gen mục tiêu để sàng lọc các chất chống kích ứng đối với kích ứng do retinol gây ra

3.1.1. Đánh giá lâm sàng đầu tiên—Ứng dụng tại chỗ của Retinol và phân tích các đặc tính gây kích ứng của nó

Chúng tôi đã điều tra các đặc tính gây kích ứng của retinol và mối quan hệ của nó với độ nhạy cảm của da ở 173 người Hàn Quốc. Họ bôi retinol trong 3 ngày, sau đó là 4 ngày nghỉ mỗi tuần trong 3 tuần, với mỗi nồng độ retinol tăng dần mỗi tuần (2500 IU trong tuần đầu tiên, 3300 IU trong tuần thứ 2 và 5000 IU trong tuần đầu tiên). tuần thứ 3). Sau đó, chúng tôi phân tích bảng câu hỏi nhận được sau thí nghiệm để điều tra các yếu tố liên quan đến kích ứng do retinol gây ra.

Tỷ lệ người tham gia thuộc nhóm da nhạy cảm báo cáo rằng họ bị kích ứng cao hơn so với nhóm da không nhạy cảm (Hình 2a). Người ta cũng chỉ ra rằng những người thuộc nhóm da nhạy cảm có khả năng ngừng sử dụng sản phẩm mỹ phẩm do kích ứng da cao gấp ba lần (Hình 2b). Trong số những người từng bị kích ứng, hầu hết mọi người trả lời rằng mỹ phẩm cơ bản gây kích ứng, sau đó là kem chống nắng, sữa rửa mặt và mỹ phẩm (Hình 2c). Tỷ lệ những người từng bị kích ứng da với các sản phẩm retinol trước đây trả lời rằng họ bị kích ứng trong thí nghiệm này cao hơn so với những người không bị kích ứng da khi sử dụng các sản phẩm retinol trước đây (Hình 2d). Kết quả này cho thấy kích ứng do retinol gây ra có xu hướng xảy ra lặp đi lặp lại tùy thuộc vào từng cá nhân, điều này ủng hộ giả thuyết rằng các yếu tố di truyền có thể ảnh hưởng đến độ nhạy cảm với retinol. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các biến thể di truyền ảnh hưởng đáng kể đến khả dụng sinh học của retinol và retinoid, hỗ trợ rằng các yếu tố di truyền cũng có thể chi phối kích ứng do retinol gây ra [27,28].

Loại kích ứng do sử dụng retinol gây ra rất khác nhau giữa các cá nhân. Tuy nhiên, châm chích là phổ biến nhất, chiếm khoảng 3/4 số lần kích ứng và sau đó là nóng rát, ngứa và ban đỏ (Hình 2e).

(c) Tỷ lệ cá nhân bị kích ứng khi sử dụng các sản phẩm mỹ phẩm cơ bản. (d) Tỷ lệ cá nhân từng bị kích ứng với các sản phẩm chứa retinol. (e) Các loại kích ứng mà các cá nhân gặp phải khi sử dụng các sản phẩm bôi ngoài da có chứa retinol; * giá trị p < 0.05; *** giá trị p < 0,001; ns, không đáng kể.

3.1.2. Phân tích gen ứng cử viên cho kích ứng do retinol gây ra

Để khám phá các biến thể di truyền liên quan đến độ nhạy cảm của da với retinol, chúng tôi đã chọn 14 gen ứng cử viên nổi tiếng với chức năng chuyển hóa retinoid và độ nhạy cảm của da (Bảng S2). Chúng tôi đã đề cập đến phân tích phiên mã trước đây của da tái tạo 3D khi điều trị chất nhạy cảm [29].

Tổng cộng có 319 SNP nằm trong các gen ứng cử viên đã được chọn và sử dụng để phân tích liên kết bằng mô hình phụ gia. Ba mươi SNP có liên quan đáng kể đến kích ứng do retinol gây ra, không có trường hợp nào được báo cáo trước đây (p < 0.05; Bảng 1). Cụ thể, tổng cộng 12 SNP đã được tìm thấy trong RARB, ba trong EGFR, ba trong CD44, hai trong IL18, hai trong IL4R và bốn trong BCL2. Bốn gen khác, CD86, RXRB, MMP10 và COL6A2, bao gồm các SNP đơn lẻ. Các SNP được phát hiện thuộc về 10 gen, hai trong số đó là gen liên quan đến retinol và tám gen còn lại liên quan đến độ nhạy cảm chung của da theo các nghiên cứu trước đó. Trong số 10 gen này, chúng tôi đã chọn 3 gen quan trọng nhất liên quan đến kích ứng da: COL6A2, EGFR và IL-4R.

COL6A2, mã hóa một trong ba chuỗi alpha của collagen loại VI được tìm thấy trong hầu hết các mô liên kết, đã được chứng minh là có khả năng điều chỉnh quá trình lắp ráp ma trận da và sự vận động của nguyên bào sợi [30], đồng thời nó góp phần tái tạo mô và chữa lành vết thương [31,32]. Khiếm khuyết này dẫn đến hình thành sẹo lồi [33] và các kiểu hình da bất thường [34]. Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) là một bộ điều chỉnh quan trọng của chức năng hàng rào biểu bì. Tín hiệu EGFR đã được chứng minh là có tác dụng ức chế khả năng của lớp vỏ sừng hóa và phá vỡ chức năng hàng rào liên kết chặt chẽ trong tế bào sừng biểu bì [35,36]. Ngoài tín hiệu EGFR, một loạt các yếu tố khác như ADAM17 (một disintegrin và metallicoproteinase 17) [37] và kênh TRP [38] cũng được cho là ảnh hưởng đến chức năng hàng rào biểu bì liên quan một cách có hệ thống với EGFR.

Trong vài thập kỷ qua, chức năng và vai trò của interleukin 4 (IL-4) và thụ thể của nó, IL-4R, đã được nghiên cứu rộng rãi. Là yếu tố điều chỉnh chính trong hệ thống miễn dịch thể dịch và thích ứng, IL-4, chủ yếu được tiết ra từ tế bào mast và tế bào Th2, tạo ra sự biệt hóa của tế bào Th2 và kích thích tế bào B. Mặc dù vai trò của nó chưa được hiểu rõ ràng, nhưng nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng IL-4 có thể thúc đẩy các quá trình gây viêm và kích ứng lan rộng, trong khi khiếm khuyết của nó được chứng minh là gây ra bệnh dị ứng, bệnh Alzheimer và khối u [39]. Dọc theo cùng một trục đối với phản ứng miễn dịch liên quan đến IL-4-IL, IL-4R được biểu hiện khắp nơi trên các tế bào miễn dịch khác nhau trong cả hệ thống miễn dịch bẩm sinh và thích nghi. IL-4R là một thụ thể chung cho cả IL-4 và IL-13 [40]. Không giống như IL-4 ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình biệt hóa Th2, IL-13 cũng chịu trách nhiệm kích hoạt tế bào mast kiểm soát chức năng của bạch cầu ái toan và nó có tác dụng ức chế miễn dịch và chống viêm đối với đại thực bào bằng cách ức chế các cytokine tiền viêm và chemokine [41].

3.2. Phương pháp tiếp cận từ trên xuống: Sàng lọc chất chống kích ứng trong ống nghiệm

3.2.1. Các gen liên quan đến sửa chữa mô, COL6A2 và EGFR

Dựa trên các gen đã chọn, chúng tôi đã sàng lọc các chất chống kích ứng có thể điều chỉnh cơ chế bệnh sinh phân tử, chẳng hạn như kiểm soát sự biểu hiện của các gen mục tiêu.

Các báo cáo trước đó tiết lộ rằng retinoid gây ra những thay đổi về sinh lý và hình thái ở hàng rào bảo vệ da [8,42,43]. Người ta đã quan sát thấy rằng việc điều trị mô da bằng axit retinoic ex vivo và in vivo làm tăng sự mất nước qua biểu bì (TEWL), và một số nghiên cứu đã tiết lộ rằng sự gián đoạn chức năng hàng rào bảo vệ da này được điều hòa bởi một kiểu biểu hiện mất cân bằng của lớp vỏ sừng hóa và lớp biểu bì chặt chẽ. các gen liên quan đến mối nối. Quá trình điều hòa giảm của filaggrin (FLG), loricrin và CLDN1 cũng như quá trình điều hòa tăng của CLDN2, CLDN4 và sự biểu hiện khác biệt đáng kể của các gen thành viên họ serpin đã được quan sát thấy trong một nghiên cứu trước đó, được cho là nguyên nhân chính gây kích ứng do retinoid [10,11]. \Chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng những người có biến thể di truyền trong COL6A2 và EGFR có xu hướng dễ bị retinol làm suy yếu chức năng hàng rào bảo vệ da, dẫn đến kích ứng do retinol gây ra (Hình 3a). Chúng tôi cũng xem xét rằng ngoài collagen VI, collagen IV cũng là một yếu tố quan trọng trong màng đáy biểu bì và quá trình chữa lành vết thương, mặc dù vai trò chính xác của nó trong mô da vẫn chưa rõ ràng [44]. Chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng sự thiếu hụt hoặc bất thường của collagen VI và IV dẫn đến dễ bị kích ứng do retinol gây ra và sự biểu hiện quá mức của cả hai loại collagen có thể làm suy yếu hàng rào bảo vệ da do retinol gây ra. Trong số các chất khác nhau, chúng tôi quan sát thấy rằng glucosamine làm tăng biểu hiện của COL6A2 và COL4A2 lên 1.5-lần và 1.7-lần tương ứng (Hình 3a, bảng ở giữa). Vai trò điều tiết của glucosamine đối với COL6A2 và COL4A2 chưa được báo cáo trước đây, điều này ngụ ý rằng những quan sát này rất quan trọng về mặt khoa học.

Trong trường hợp của EGFR, chúng tôi đã xem xét cẩn thận nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng axit retinoic gây ra sự biểu hiện quá mức của aquaporin 3 (AQP3) thông qua con đường EGFR/ERK trong tế bào sừng của con người [45]. Trong báo cáo đầu tiên, chúng tôi đã quan sát thấy rằng không chỉ axit retinoic mà cả retinol cũng tạo ra biểu hiện AQP3 gấp khoảng hai lần trong nguyên bào sợi (Hình 3a bảng bên phải). Hiệu ứng suy giảm của sự biểu hiện quá mức AQP3 bởi niacinamide (nicotinamide) tương tự như hiệu ứng được tìm thấy trong một nghiên cứu trước đó. Trong số các chất khác nhau, trehalose và eupatilin làm suy yếu sự biểu hiện quá mức AQP3 do retinol gây ra. Eupatilin (5,7-dihydroxy-3',4',6-trimethoxyflavone), một loại flavonoid được tìm thấy trong Artemisa asiatica, đã được báo cáo là tăng cường chức năng hàng rào bảo vệ da trong điều kiện bệnh lý in vivo [46].

Ngoài ra, chúng tôi đã điều tra biểu hiện của FLG, đây là chỉ số chính về chức năng hàng rào bảo vệ da. Tương tự như các nghiên cứu in vivo trước đây [47], chúng tôi đã quan sát thấy rằng retinol làm giảm đáng kể biểu hiện của FLG khoảng 45% , và mức giảm này đã được đảo ngược bởi niacinamide, glucosamine và sucralfat (Hình S1a, xem Tài liệu bổ sung).

Nói chung, glucosamine, trehalose và sucralfat có thể làm giảm bớt sự phá vỡ hàng rào bảo vệ da do retinol gây ra bằng cách điều chỉnh biểu hiện của COL6A2, AQP3 và FLG.

3.2.2. Gene gây viêm: IL-4R

Sau đó, chúng tôi đã cố gắng xác định các chất chống kích ứng liên quan đến các gen gây viêm. Dựa trên kết quả phân tích di truyền của chúng tôi, người ta đã chứng minh rằng những người dễ bị kích ứng do retinol gây ra có xu hướng có các dấu hiệu SNP cho IL-4R chứ không phải IL-4. Trước tiên, chúng tôi đã điều tra xem liệu việc điều trị bằng retinol có điều chỉnh biểu hiện của IL-4 hoặc IL-4R trong tế bào mast hay không, đây cũng là nguyên nhân chính gây ra tình trạng viêm nhiễm liên quan đến IL-4-. Retinol gây ra sự biểu hiện quá mức của IL-4R 1.74-gấp. Mặc dù retinol không gây ra sự biểu hiện quá mức IL-4 (Hình S1b, xem Tài liệu bổ sung), người ta đã quan sát thấy rằng ectoine làm giảm hiệu quả biểu hiện IL-4 của tế bào mast, điều này trùng khớp với các nghiên cứu trước đó lập luận về tác dụng chống viêm của ectoine trong một số mô hình bệnh như IBD (bệnh viêm ruột) và bệnh đường hô hấp dị ứng [48,49]. Cụ thể hơn, các nghiên cứu trước đó cho thấy rằng ectoine có thể bình thường hóa biểu hiện của IL-4 trong CNP (hạt nano carbon) gây viêm phổi trong mô hình in vivo, hỗ trợ kết quả thử nghiệm của chúng tôi [50].

Crocin, glucosamine và ectoine đã làm giảm bớt sự biểu hiện quá mức do retinol kích thích IL-4R trong tế bào mast, với mức giảm lần lượt là 37,03% , 41,97% và 82,59% . Ectoine (1,4,5,6-tetrahydro-2-metyl-4-pyrimidinecarboxylic acid), một hợp chất tự nhiên được tìm thấy trong một số vi khuẩn ưa mặn, đã được chứng minh là điều chỉnh nhiều cytokine và chemokine trong điều kiện viêm nhiễm, mặc dù vai trò của ectoine trong việc cải thiện biểu hiện của IL-4R vẫn chưa được làm rõ. Các quan sát của chúng tôi cung cấp những hiểu biết mới về chức năng của ectoine. Nghiên cứu trước đây của nhóm chúng tôi cho thấy rằng ectoin ở nồng độ tối ưu 100 ppm cho thấy tác dụng chống viêm cao nhất chống lại tác dụng của retinoids và khả năng gây độc tế bào không đáng kể trong thí nghiệm in vitro dựa trên tế bào (dữ liệu không được hiển thị). Chúng tôi cũng đã đo tốc độ giải phóng -hexosaminidase của các tế bào mast, đây là một chỉ số về sự thoái hóa của tế bào mast (Hình 3b, bảng bên phải). Ectoine không làm giảm sự giải phóng -hexosaminidase do retinol gây ra trong retinol 400 ppm, mặc dù nó làm giảm sự giải phóng -hexosaminidase do retinol gây ra trong retinol 200 ppm. Nói chung, có thể kết luận rằng ectoine có thể cải thiện tình trạng viêm nhiễm liên quan đến IL-4 và IL-4R–do retinol gây ra. Xem xét nghiên cứu trước đây rằng ectoine can thiệp vào việc kích hoạt EGFR trong viêm phổi do CNP gây ra [50], ectoine dường như cũng có lợi cho sự phá vỡ hàng rào bảo vệ da do retinol gây ra.

3.2.3. Viêm thần kinh, Adiponectin và TRPV1

Một đặc điểm nổi bật của kích ứng do retinol gây ra ở những bệnh nhân cực kỳ nhạy cảm với retinoid là các phản ứng giống như dị ứng như cảm giác nóng rát và châm chích nhanh, ngứa, phù lan tỏa nhanh và phát ban. Một nghiên cứu tiết lộ rằng retinoids, bao gồm retinol và axit retinoic, kích hoạt TRPV1 [21]. Do đó, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng kích ứng do retinol gây ra, đặc biệt là xảy ra nhanh chóng trong vòng vài phút, là do retinol kích hoạt TRPV1.

Hình 3. Phân tích biểu hiện mRNA để sàng lọc các chất chống kích ứng có thể điều chỉnh quá trình sinh bệnh học phân tử liên quan đến kích ứng. (a) Điều tra cơ chế bệnh sinh phân tử liên quan đến sự phá vỡ hàng rào bảo vệ da Sơ đồ nguyên lý cho phương pháp điều biến di truyền đối với retinol (sự phá vỡ hàng rào bảo vệ da do ROL gây ra. (bên trái) Biểu hiện mRNA tương đối của COL4A2 và COL6A2 khi các nguyên bào sợi được điều trị bằng glucosamine (ở giữa) và biểu hiện mRNA tương đối của AQP3 (tế bào sừng, bên phải). (b) Điều tra quá trình sinh bệnh học phân tử liên quan đến quá trình viêm (điều khiển bởi tế bào mast). Biểu hiện mRNA tương đối của IL-4R khi RBL-2H3 được điều trị bằng 1 0 µM retinol và các ứng cử viên khác nhau. (c) Viêm thần kinh qua trung gian TRPV1 do retinol gây ra và tác dụng đối kháng của 4-t-butylcyclohexanol và omega-9; Ba điều kiện để kết hợp: (1) 4-t-butylcyclohexanol 25 µM và omega-9 5 µM, (2) 4-t-butylcyclohexanol 50 µM và omega-9 10 µM, và (3) 4- t-butylcyclohexanol 100 µM và omega-9 20 µM, BC, 4-t-butylcyclohexanol; OA, omega-9 axit oleic; Một thanh tỷ lệ 50 µm (màu trắng) được hiển thị; * p < 0,05; ns, không đáng kể; thanh lỗi đã được hiển thị; ppm, phần triệu.

TRPV1, một cation không chọn lọc được kích hoạt bởi các kích thích hóa lý khác nhau, đã được nghiên cứu rộng rãi, đặc biệt là vai trò của nó đối với da. [51–54] Mặc dù TRPV1 không xuất hiện trong phân tích di truyền trước đó, nhưng cần lưu ý rằng adiponectin (ADIPQ) đã xuất hiện trong một số mô hình phân tích với ý nghĩa thống kê từ thấp đến trung bình. Một nghiên cứu trước đây về dân số Hàn Quốc cho thấy kiểu hình da "nhạy cảm" dường như có liên quan đến sự thiếu hụt adiponectin, do đó góp phần vào việc điều hòa lại TRPV1 [55]. Các tế bào HEK293 biểu hiện quá mức TRPV1-đã được xử lý bằng retinol và việc kích hoạt TRPV1 đã được xác nhận bằng cách chụp ảnh dòng canxi. Chúng tôi quan sát thấy rằng retinol có thể kích hoạt TRPV1 theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình S1c, xem Tài liệu bổ sung). Ở nồng độ trên 50 µM, hiệu ứng chủ vận trên TRPV1 dường như đạt đến mức ổn định. Dựa trên một nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã điều tra xem liệu axit oleic 4-t-butylcyclohexanol và omega-9 có thể đối kháng hoạt hóa TRPV1 do retinol gây ra hay không. Đúng như dự đoán, cả hai chất đều có thể đối kháng với TRPV1, trong khi ở liều lượng thấp, axit oleic omega-9 mạnh hơn 4-t-butylcyclohexanol (Hình S1d, xem Tài liệu bổ sung). Sự kết hợp của hai vật liệu này cho thấy tác dụng hiệp đồng nhẹ trong việc ức chế TRPV1 bằng retinol. Ba nồng độ khác nhau của sự kết hợp 4-t-butylcyclohexanol và omega-9 cho thấy khả năng kích hoạt TRPV1 do retinol gây ra giảm, lần lượt là 28,25% , 43,73% và 68,50% . Dòng canxi vào các tế bào qua trung gian kích hoạt TRPV1 đã được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (Hình 3c). Để kết luận, chúng tôi đã xác minh rằng kích ứng do retinol gây ra cũng có thể liên quan đến tình trạng viêm thần kinh qua trung gian kích hoạt TRPV1 trong mô hình in vitro và 4-t butylcyclohexanol và axit oleic omega-9 có thể được sử dụng để giảm thiểu kích ứng thần kinh viêm bằng cách đối kháng TRPV1.

Email:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp cùng với 86 15292862950