Phát hiện mức độ tăng cao của Tetrahydrobiopterin trong mẫu huyết thanh của bệnh nhân ME/CFS mắc chứng không dung nạp tư thế đứng: Một nghiên cứu thí điểm

Trừu tượng:Viêm não tủy cơ hoặc hội chứng mệt mỏi mãn tính (ME/CFS) là một bệnh mãn tính đa cơ quan được đặc trưng bởi mệt mỏi cơ nghiêm trọng, đau, chóng mặt và sương mù não. Nhiều bệnh nhân mắc ME/CFS gặp phải tình trạng không dung nạp tư thế đứng (OI), đặc trưng là thường xuyên chóng mặt, choáng váng và cảm thấy ngất xỉu khi duy trì tư thế thẳng đứng. Mặc dù đã được điều tra kỹ lưỡng nhưng cơ chế phân tử của tình trạng suy nhược này vẫn chưa được biết rõ. NTCH thường biểu hiện bằng những thay đổi về tim mạch như giảm lưu lượng máu não, giảm huyết áp và giảm nhịp tim. Khả dụng sinh học của tetrahydrobiopterin (BH4), một đồng yếu tố thiết yếu của enzyme nitric oxit synthase (eNOS) nội mô, được kết hợp chặt chẽ với sức khỏe tim mạch và tuần hoàn. Để khám phá vai trò của BH4 trong ME/CFS, mẫu huyết thanh của bệnh nhân CFS (n=32), bệnh nhân CFS chỉ mắc OI (n=10; CFS + OI) và bệnh nhân CFS mắc cả OI và bệnh đa dây thần kinh sợi nhỏ (n=12; CFS + OI + SFN) đã được thực hiện ELISA BH4. Điều thú vị là, kết quả của chúng tôi cho thấy biểu hiện BH4 cao đáng kể ở bệnh nhân CFS, CFS + OI và CFS + OI + SFN so với nhóm đối chứng phù hợp với độ tuổi/giới tính. Cuối cùng, xét nghiệm sản xuất ROS trong các tế bào vi mô nuôi cấy theo thống kê tương quan Pearson chỉ ra rằng BH4 tăng cao trong mẫu huyết thanh của bệnh nhân CFS + OI có thể liên quan đến phản ứng stress oxy hóa. Những phát hiện này cho thấy rằng việc điều hòa chuyển hóa BH4 có thể là mục tiêu đầy hứa hẹn để tìm hiểu cơ chế phân tử của CFS và CFS với OI.

Cistanche có thể hoạt động như một chất chống mệt mỏi và tăng cường sức chịu đựng, và các nghiên cứu thực nghiệm đã chỉ ra rằng thuốc sắc của Cistanche tubulosa có thể bảo vệ hiệu quả các tế bào gan và tế bào nội mô bị tổn thương ở chuột bơi lội chịu trọng lượng, điều chỉnh tăng biểu hiện của NOS3 và thúc đẩy glycogen ở gan tổng hợp, do đó có tác dụng chống mệt mỏi. Chiết xuất Cistanche tubulosa giàu phenylethane glycoside có thể làm giảm đáng kể nồng độ creatine kinase, lactate dehydrogenase và lactate trong huyết thanh, đồng thời làm tăng nồng độ hemoglobin (HB) và glucose ở chuột ICR, và điều này có thể đóng vai trò chống mệt mỏi bằng cách giảm tổn thương cơ. và trì hoãn việc làm giàu axit lactic để dự trữ năng lượng ở chuột. Viên nén Cistanche Tubulosa kéo dài đáng kể thời gian bơi lội chịu trọng lượng, tăng dự trữ glycogen ở gan và giảm nồng độ urê huyết thanh sau khi tập thể dục ở chuột, cho thấy tác dụng chống mệt mỏi của nó. Thuốc sắc của Cistanchis có thể cải thiện sức bền và đẩy nhanh quá trình loại bỏ mệt mỏi ở chuột tập thể dục, đồng thời cũng có thể làm giảm độ cao của creatine kinase trong huyết thanh sau khi tập thể dục nặng và giữ cho siêu cấu trúc cơ xương của chuột bình thường sau khi tập thể dục, điều này cho thấy rằng nó có tác dụng tăng cường sức mạnh thể chất và chống mệt mỏi. Cistanchis cũng kéo dài đáng kể thời gian sống sót của chuột bị nhiễm độc nitrit và tăng cường khả năng chống lại tình trạng thiếu oxy và mệt mỏi.

Bấm vào Quá mệt mỏi

【Để biết thêm thông tin:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】

Từ khóa:ME/CFS; tetrahydrobiopterin; không dung nạp tư thế đứng; bệnh đa dây thần kinh sợi nhỏ; NOS nội mô; các loại oxy phản ứng

1. Giới thiệu

Viêm não tủy/Hội chứng mệt mỏi mãn tính (ME/CFS) là một bệnh đa hệ thống mãn tính được đặc trưng bởi tình trạng mệt mỏi cơ, đau, chóng mặt và sương mù não suy nhược [1,2]. Một nhóm nhỏ bệnh nhân ME/CFS có biểu hiện hạ huyết áp thế đứng nghiêm trọng [3] được đặc trưng bởi huyết áp giảm đáng kể gây chóng mặt và ngất xỉu khi đứng ở tư thế thẳng đứng [4]. Tình trạng này thường được gọi là không dung nạp tư thế đứng (OI). Một nhóm nhỏ bệnh nhân OI cũng đáp ứng các tiêu chuẩn chẩn đoán cho bệnh đa dây thần kinh sợi nhỏ [5,6] được chẩn đoán bằng cách sử dụng phương pháp nhuộm màu đỏ Congo để phát hiện bệnh amyloidosis trong các mẫu sinh thiết da [7]. Mặc dù đã được nghiên cứu kỹ lưỡng nhưng cơ chế phân tử của OI vẫn chưa được biết đến.

BH4 là một đồng yếu tố quan trọng của quá trình chuyển hóa axit amin [8]. Các axit amin, chẳng hạn như phenylalanine, tyrosine và tryptophan, được chuyển đổi thành các chất trung gian quan trọng của tế bào nhờ hoạt động của các enzyme hydroxylase. BH4 đóng vai trò là đồng yếu tố thiết yếu của tất cả các enzyme hydroxylase này [9–11]. Theo đó, khả dụng sinh học của BH4 rất quan trọng cho việc tổng hợp các chất dẫn truyền thần kinh, chẳng hạn như dopamine và serotonin [10]. Ngoài các enzyme hydroxylase này, BH4 còn điều chỉnh chức năng của enzyme tổng hợp oxit nitric và kiểm soát việc sản xuất oxit nitric (NO) trong nội mô [12]. Sản xuất NO nội mô giúp tăng cường phản ứng giãn mạch, giảm huyết áp và giúp thư giãn cơ [13,14]. Mặt khác, khi có stress oxy hóa, BH4 tách khỏi quá trình sản xuất NO do eNOS gây ra [15] và trực tiếp làm tăng phản ứng căng thẳng của ty thể trong mô tim [16] và cơ xương [17]. Do đó, việc điều hòa chuyển hóa BH4 rất quan trọng đối với chức năng tim mạch và sức khỏe tuần hoàn. Vì bệnh nhân NTCH được báo cáo là có biểu hiện bất thường về tim mạch nên chúng tôi quan tâm nghiên cứu xem liệu bệnh nhân NTCH có làm thay đổi chuyển hóa BH4 hay không. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào tìm hiểu vai trò của chuyển hóa BH4 trong CFS. Hơn nữa, nghiên cứu của chúng tôi cũng khám phá xem liệu bệnh nhân CFS mắc OI có làm thay đổi quá trình sinh tổng hợp BH4 hay không.

Mẫu huyết thanh của 66 đối tượng được đưa vào nghiên cứu với n=32 CFS và n=34 đối chứng. ELISA định lượng mù đôi đã được thực hiện để so sánh nồng độ BH4 giữa bệnh nhân đối chứng khỏe mạnh và bệnh nhân CFS. Thật thú vị, chúng tôi quan sát thấy có sự điều chỉnh tăng mạnh BH4 ở bệnh nhân CFS so với nhóm đối chứng khỏe mạnh. Trong khi so sánh mức độ BH4 giữa các bệnh nhân CFS mắc OI (n=10) và các biện pháp kiểm soát phù hợp với độ tuổi/giới tính (n=10), chúng tôi cũng quan sát thấy rằng bệnh nhân CFS mắc OI có mức độ suy nhược cơ thể cao hơn đáng kể. BH4 trong huyết thanh. Nói chung, bản thảo hiện tại của chúng tôi nhấn mạnh rằng việc tăng BH4 huyết thanh ở bệnh nhân CFS có thể đóng một vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của OI.

2. Kết quả

Đối tượng tham gia nghiên cứu: Để định lượng nồng độ BH4 trong các mẫu huyết thanh, tổng cộng 66 đối tượng người đã được đưa vào nghiên cứu. Bảng 1 tóm tắt độ tuổi, giới tính, dân tộc và tình trạng bệnh lý sẵn có của những đối tượng này. Bốn đối tượng trong nhóm đối chứng có các biến chứng liên quan đến ung thư và do đó bị loại khỏi phân tích cuối cùng. Độ tuổi tối thiểu, trung bình và tối đa của nhóm đối chứng lần lượt là 18, 64,5 và 82 tuổi. Đối với nhóm CFS, các giá trị này là 26, 59 và 76 năm. Biểu đồ phân bố tần số theo độ tuổi ở cả hai nhóm đều thể hiện độ lệch tương tự nhau và thử nghiệm phân tích Bland–Altman sau đó cho thấy rằng mức trung bình của các khác biệt gần bằng 0 cho thấy rằng không có sai lệch nào liên quan đến tuổi tác. Nhóm đối chứng bao gồm 44% nam và 56% nữ, trong khi nhóm CFS bao gồm 41% nam và 59% nữ. Tất cả bệnh nhân đều là người da trắng và sống ở khu vực địa lý Bắc Nevada và California.

Nhóm bệnh nhân ME/CFS được ghi danh dựa trên tiêu chí Canada 2003 và Fakuda cho ME/CFS. Đồng thời cũng đáp ứng tiêu chuẩn chẩn đoán SCID (tên mới ME/CFS do Viện Y học thành lập). Các biện pháp kiểm soát có độ tuổi/giới tính phù hợp với các đối tượng CFS, những người cũng được mời cùng với các bệnh nhân đến Phòng khám Nội khoa của Tiến sĩ Peterson.

Các tập hợp con CFS + OI và CFS + OI_SFN được thiết lập thông qua hồ sơ xét nghiệm chẩn đoán (hoàn thành đánh giá biểu đồ y tế) và mối tương quan lâm sàng. Ví dụ: những người mắc OI đã đến văn phòng với kết quả xét nghiệm nạc dương tính đã được sửa đổi của NASA (hiển thị OI) và tất cả đều được điều trị tăng thể tích qua đường tĩnh mạch (nước muối). Bệnh nhân SFN đã có mẫu sinh thiết. Đối với các đối tượng CFS + OI + SFN được đưa vào, báo cáo của Bệnh viện Đa khoa Đại chúng đã được ghi lại, trong đó nhuộm màu đỏ Congo để đếm mật độ tế bào thần kinh được thực hiện ở mô cơ mắt cá chân bên.

Mức BH4 cao trong các mẫu huyết thanh của bệnh nhân ME/CFS: Tổng cộng, 32 đối tượng CFS và 34 đối tượng đối chứng đã được đưa vào nghiên cứu (Bảng 1) để đo nồng độ BH4 trong huyết thanh bằng ELISA cạnh tranh. Đường cong chuẩn của ELISA BH4 là đường cong hàm mũ có độ dốc âm được bắt nguồn từ sáu nồng độ tăng dần của chuẩn BH4 (5, 10, 25, 50, 10{{52 }} và 150 ng/mL). Độ dốc và điểm giao nhau của đường chuẩn được sử dụng để đo mức BH4 tuyệt đối từ giá trị OD. Pha loãng hàng loạt các mẫu huyết thanh sau đó là xét nghiệm ELISA BH4 cho thấy rằng pha loãng huyết thanh theo tỷ lệ 1:2 mang lại kết quả tương phản nhất so với mẫu trắng hoặc nền. Do đó, tất cả các mẫu huyết thanh đều được pha loãng theo tỷ lệ 1:2. Điều thú vị là, phân tích ELISA mù đôi, sau đó là xét nghiệm Mann–Whitney U không tham số [* p < 0,05 (=0.033); U=304.5] tiết lộ rằng mức BH4 cao hơn đáng kể ở n=32 bệnh nhân CFS so với n=28 đối tượng kiểm soát (Hình 1A). Bốn đối tượng (n=4) trong nhóm đối chứng đã bị loại vì họ mắc bệnh ung thư từ trước. Vì các đối tượng được đưa vào ngẫu nhiên không phân biệt tuổi tác và giới tính nên tiếp theo chúng tôi muốn phân tích mối tương quan giữa mức BH4 với độ tuổi và giới tính của đối tượng. Theo đó, phân tích tương quan Spearman không tham số (Hình 1B) cho thấy rằng không có mối tương quan giữa mức độ BH4 và độ tuổi của đối tượng' (Spearman r=−0.1657; p=0.1835). Tiếp theo, chúng tôi so sánh mức độ BH4 giữa đối tượng nam và nữ (Hình 1C). Để đánh giá tầm quan trọng giữa nam và nữ (tác nhân số 1 là giới tính), cũng như giữa đối chứng và CFS (tác nhân số 2 là tình trạng sức khỏe), phân tích ANOVA hai chiều đã được thực hiện. Theo đó, đối tượng nam và nữ không có sự khác biệt đáng kể về nồng độ BH4 (p > 0,05; =0.3496). Tuy nhiên, có sự khác biệt đáng kể về BH4 giữa đối tượng kiểm soát và đối tượng CFS (p < 0,05; =0.0375) bất kể sự khác biệt về giới tính.

Do đoàn hệ hiện tại bị hạn chế nghiêm ngặt trong cùng khu vực địa lý, dân tộc và từ hoạt động hành nghề của một bác sĩ duy nhất, nên phân tích so sánh theo cặp về BH4 giữa các trường hợp và đối chứng phù hợp với độ tuổi và giới tính sẽ có tính thuyết phục hơn. Tổng cộng có 15 cặp được so sánh (Hình 1D). Một bài kiểm tra xếp hạng có chữ ký theo cặp đối sánh Wilcoxon không tham số cho thấy bệnh nhân CFS có BH4 cao hơn đáng kể (** p<0.01; =0.0015) than age- and gender-matched controls. Collectively, our results suggest that the BH4 level is significantly higher in CFS patients compared to healthy control subjects, irrespective of age and gender differences.

CFS patients with OI have upregulated levels of BH4 in serum: Next, we wanted to analyze BH4 levels between control (n = 10) and CFS patients with OI (n = 10). An unpaired t-test revealed that CFS + OI patients had significantly higher BH4 [t1,18 = 2.499; * p < 0.05 (=0.0223)] levels compared to control subjects (Figure 2A). Table 2 displays that all controls were carefully matched with CFS + OI subjects in terms of age and gender. Moreover, a Kolmogorov–Smirnov normality distribution analysis followed by a Q-Q (quantile-quantile) plot (Figure 2B) indicated that all data points were normally distributed [p >alpha ({{0}}.05)]. Vì tất cả các mẫu CFS và đối chứng đều phù hợp với độ tuổi và giới tính nên phân tích so sánh theo cặp đã được thực hiện. Thử nghiệm t ghép đôi tiếp theo (t1,9=3.834; ** p < 0.01=0.004) chỉ ra rằng các mẫu huyết thanh CFS + OI có BH4 cao hơn đáng kể so với các mẫu huyết thanh đối chứng (Hình 2C ). Kiểm tra thống kê cột tích lũy (Hình 2D) tiết lộ thêm rằng 7 trong số 10 bệnh nhân CFS + OI có mức BH4 cao hơn đáng kể so với mức trung bình (=99,63 ng/mL). Mặt khác, chỉ có 2 trong số 10 đối tượng kiểm soát có BH4 cao hơn giá trị trung bình. Nói chung, những dữ liệu này cho thấy bệnh nhân CFS + OI có BH4 cao hơn đáng kể so với đối tượng kiểm soát.

Một tập hợp con bệnh nhân CFS (n=12) có cả NTCH và SFN. So sánh nồng độ BH4 (Hình 3A) giữa đối tượng khỏe mạnh và đối tượng CFS + OI + SFN cho thấy bệnh nhân CFS + OI + SFN có mức BH4 cao hơn đáng kể [t1,22=2.371; * P<0.05 (=0.0269)]. Table 3 shows that the cohort of 24 serum samples (n = 12 Control + n = 12 CFS + OI + SFN) was carefully selected based on age and gender. Subsequently, a Q-Q plot demonstrated all data points from both groups were normally distributed (Figure 3B). Since all subjects were matched in terms of age and gender, a paired analysis of control and CFS + OI + SFN subjects was performed. Accordingly, a significant difference in BH4  expression (* p < 0.05) was observed between these two groups (Figure 3C). A cumulative statistical analysis (Figure 3D) further indicated that n = 6 CFS + OI + SFN patients and n = 3 controls have higher BH4 levels than the median (=81.83 ng/mL) suggesting that the BH4  level is strongly elevated in serum samples of CFS + OI + SFN subjects.

Trong khi so sánh nồng độ BH4 giữa bệnh nhân CFS đơn thuần và bệnh nhân CFS + OI, chúng tôi quan sát thấy mẫu huyết thanh của bệnh nhân CFS + OI (n=14) có nồng độ BH4 cao hơn (Hình 4A) so với mẫu huyết thanh của đối tượng đối chứng (n {{ 6}}). Phân tích biểu đồ QQ cho thấy rằng việc phân phối dữ liệu là bình thường ở cả hai nhóm (Hình 4B), cho thấy thử nghiệm tham số có thể được áp dụng để so sánh các phương tiện. Theo đó, một thử nghiệm t không ghép đôi để phân tích tầm quan trọng của giá trị trung bình giữa các nhóm cho thấy sự khác biệt lớn [t1,22=2.592; * p < 0.05 (=0.0166)]. Thống kê cột của đoàn hệ đã chọn (n=22) chỉ ra rằng 9 trong số 14 bệnh nhân CFS + OI có nồng độ BH4 huyết thanh cao hơn so với mức trung bình là 119,7 ng/mL (Hình 4C). Kết hợp lại với nhau, kết quả của chúng tôi cho thấy bệnh nhân CFS mắc OI có nồng độ BH4 trong huyết thanh tăng cao. Nói chung, bản thảo hiện tại của chúng tôi xác định BH4 là một dấu ấn sinh học tiềm năng qua đường máu đối với bệnh nhân CFS + OI và CFS + OI + SFN.

Nồng độ BH4 tăng cao có thể liên quan đến tình trạng căng thẳng oxy hóa gia tăng: Để hiểu tầm quan trọng về mặt chức năng của BH4 tăng cao trong huyết thanh, chúng tôi đã khám phá khả năng tạo ra ROS của các mẫu huyết thanh của bệnh nhân CFS mắc OI (n=10). Các tế bào vi mô được truyền DCFDA đã được xử lý bằng các mẫu huyết thanh pha loãng theo tỷ lệ 1:2 từ 10 CFS + OI và 10 biện pháp kiểm soát phù hợp với độ tuổi/giới tính trong 90 phút, sau đó đo mức sản xuất ROS bằng đầu đọc tấm huỳnh quang (Ví dụ: Em { {12}} nm/535 nm) như được mô tả trong phần vật liệu và phương pháp. Như chúng tôi đã báo cáo trước đây [18], phân tích biểu đồ chỉ ra rằng khả năng sản sinh ROS của các mẫu huyết thanh CFS + OI cao hơn đáng kể so với các mẫu huyết thanh đối chứng (Hình 5A) [t1,18=2.541; p < 0,05 (=0.0205)]. Vì tất cả các điểm dữ liệu trong cả hai nhóm đều có phân phối chuẩn (Hình 5B), chúng tôi đã thực hiện kiểm tra tham số để nghiên cứu tầm quan trọng của giá trị trung bình giữa các nhóm. Điều thú vị là, phân tích thống kê tương quan Pearson trong đoàn hệ này cho thấy tồn tại mối tương quan tích cực vừa phải giữa nồng độ BH4 và sản xuất ROS, cho thấy rằng nồng độ BH4 tăng cao trong các mẫu huyết thanh CFS + OI có thể liên quan đến phản ứng oxy hóa tăng lên (Hình 5C).

Tổng hợp lại, bản thảo hiện tại của chúng tôi nhấn mạnh rằng bệnh nhân CFS có liên quan đến nồng độ BH4 tăng cao trong huyết thanh và sự điều hòa tăng lên đó được quan sát thấy rõ hơn ở bệnh nhân CFS mắc OI. Hơn nữa, BH4 tăng cao có thể liên quan đến phản ứng căng thẳng oxy hóa làm nổi bật vai trò tiềm năng của chuyển hóa BH4 trong cơ chế bệnh sinh của CFS và CFS với OI (Hình 5D).

3. Thảo luận

Sinh tổng hợp Tetrahydrobiopterin (BH4) là một quá trình trao đổi chất được điều hòa chặt chẽ trong sức khỏe và biểu hiện bất thường của nó có liên quan đến một loạt bệnh tật. Sự thiếu hụt của nó dẫn đến sự thiếu hụt trao đổi chất trong chuyển hóa axit amin [19,20], suy giảm điều hòa dopamine [21] và suy giảm lưu lượng máu [22,23] và có liên quan đến tăng huyết áp, tiểu đường, xơ vữa động mạch, lão hóa và rối loạn chuyển hóa khác. Mặt khác, quá trình sinh tổng hợp BH4 được điều hòa làm suy yếu quá trình sản xuất năng lượng của ty thể [24], gây ra căng thẳng oxy hóa [25] và làm tăng thêm sự suy giảm khả năng tự thực [26]. BH4 tăng cao cũng liên quan đến việc giảm huyết áp [27] bằng cách gây ra phản ứng giãn mạch thông qua kích hoạt NOS nội mô [28]. Do đó, quá trình sinh tổng hợp BH4 được điều hòa có thể trực tiếp thúc đẩy việc giảm huyết áp hoặc hạ huyết áp. Một nghiên cứu cho thấy sự thiếu hụt BH4 làm giảm tình trạng hạ huyết áp do LPS gây ra ở chuột [23]. Cho đến nay, vai trò của chuyển hóa BH4 vẫn chưa được khám phá ở bệnh nhân CFS, đặc biệt là bệnh nhân CFS mắc OI. Vì vậy, mục tiêu của chúng tôi là đánh giá biểu hiện BH4 huyết thanh ở nhóm bệnh nhân này. Đáng ngạc nhiên là phân tích ELISA của chúng tôi cho thấy các mẫu huyết thanh từ bệnh nhân CFS có nồng độ BH4 cao hơn đáng kể so với các đối tượng kiểm soát sức khỏe phù hợp với độ tuổi và giới tính. Theo đó, số liệu thống kê tương quan của Spearman chỉ ra rằng không có mối tương quan đáng kể nào giữa việc điều hòa tăng BH4 liên quan đến tuổi tác và giới tính, vô hiệu hóa khả năng suy giảm sinh tổng hợp BH4 liên quan đến tuổi hoặc giới ở những bệnh nhân này.

Tiếp theo, chúng tôi quan sát thấy rằng các mẫu huyết thanh của bệnh nhân CFS + OI cũng cho thấy mức độ BH4 tăng cao so với các mẫu huyết thanh của đối chứng phù hợp với độ tuổi và giới tính. Thống kê cột tích lũy của chúng tôi cho thấy rằng 7 trong số 10 bệnh nhân CFS + OI có nồng độ BH4 cao đáng kể, cho thấy rằng mức tăng BH4 trong huyết thanh có thể liên quan đến cơ chế bệnh sinh của OI. Kết quả đã được chứng thực thêm khi một nhóm nhỏ bệnh nhân CFS + OI mắc bệnh đa dây thần kinh sợi nhỏ (SFN) cũng cho thấy biểu hiện cao của BH4 trong mẫu huyết thanh của họ so với nhóm đối chứng phù hợp với độ tuổi và giới tính. Điều thú vị là, việc so sánh nồng độ BH4 trong huyết thanh giữa bệnh nhân chỉ CFS và bệnh nhân CFS mắc OI đã chứng minh rằng có nồng độ BH4 tăng cao đáng kể ở bệnh nhân OI.

BH4 tăng cao góp phần vào cơ chế bệnh sinh của ME/CFS như thế nào? Có nhiều con đường mà theo đó BH4 tăng cao có thể góp phần trực tiếp vào cơ chế bệnh sinh của ME/CFS (Hình 5D). Đầu tiên, sự điều hòa lại BH4 được báo cáo là gây ra sự suy giảm chuyển hóa năng lượng của ty thể thông qua việc ức chế phức hợp I và IV của chuỗi vận chuyển điện tử, dẫn đến giảm tiềm năng màng ty thể, giải phóng cytochrome C và apoptosis [24]. Phơi nhiễm BH4 cũng được báo cáo là gây ra stress oxy hóa [29]. Mặc dù về mặt sinh lý, BH4 hỗ trợ sản xuất NO nội mô bằng cách kích hoạt eNOS, quá trình oxy hóa BH4 bằng superoxide sẽ tách nó ra khỏi eNOS, gây ra căng thẳng oxy hóa cho mô tim và ảnh hưởng đến sức khỏe tim mạch (Hình 5C). Để hỗ trợ, kết quả của chúng tôi đã chứng minh rằng nồng độ BH4 tăng cao trong các mẫu huyết thanh CFS + OI có mối tương quan tích cực với khả năng tạo ra ROSinducing. Hơn nữa, BH4 cũng kích hoạt các mục tiêu của động vật có vú là phức hợp rapamycin1 (mTORC1) kinase để làm giảm khả năng tự thực. Trước đây, chúng tôi đã báo cáo rằng việc kích hoạt mTORC1 và sự suy giảm khả năng tự thực sau đó có thể liên quan đến sinh bệnh học ME / CFS. Cả suy giảm khả năng tự thực phụ thuộc mTORC{16}} [18] và sự thiếu hụt chuyển hóa năng lượng của ty thể [30] đã được báo cáo là góp phần vào cơ chế bệnh sinh của ME/CFS. Do đó, việc tăng nồng độ BH4 trong mẫu huyết thanh của bệnh nhân ME/CFS có thể gây ra stress oxy hóa và làm tăng sự tách cặp eNOS, sau đó là căng thẳng tim mạch, hạ huyết áp, nhiễm độc ty thể và suy giảm khả năng tự thực ở bệnh nhân CFS.

4. Vật liệu và phương pháp

Thu thập mẫu: Kế hoạch thu thập, khử nhận dạng và lưu trữ mẫu đã được thảo luận trước đây [18]. Tóm lại, các mẫu máu và dữ liệu bảng câu hỏi được thu thập dưới sự giám sát của Tiến sĩ Daniel Peterson (Nội khoa Sierra, Làng Incline, NV, Hoa Kỳ) (Western IRB) #20201812. Các mẫu máu được ly tâm và các mẫu huyết thanh được chia thành từng phần rồi đông lạnh ngay lập tức ở -80 ◦C. Mỗi mẫu được cấp một số nhận dạng duy nhất và được ghi lại cả vào sổ tay và Microsoft Excel kèm theo ngày và chữ ký theo giao thức đã được IRB phê duyệt. Các mẫu sau đó được chuyển đến cơ sở nghiên cứu của chúng tôi ở Wisconsin trên đá khô qua đêm. Sau khi nhận được, mẫu được xử lý và phân tích ngay lập tức. Bảng câu hỏi và dữ liệu lâm sàng không xác định được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu máy chủ Redcap truy cập hạn chế, an toàn do Nhân viên Nghiên cứu và Thành viên Lâm sàng tại Sierra Internal Medicine quản lý. Hồ sơ bệnh nhân được duy trì theo nguyên tắc chính sách quyền riêng tư do Sierra Internal Medicine đặt ra. Các tập hợp con bệnh nhân ME/CFS trong nhóm OI và OI + SFN được thiết lập bằng cách sử dụng đánh giá biểu đồ mù và phân tích sau phòng thí nghiệm đã được PI lâm sàng xác nhận. Bốn bệnh nhân ung thư được đưa vào phân tích này một cách mù quáng và đóng vai trò kiểm soát bệnh tích cực.

Tiêu chuẩn chẩn đoán NTCH bao gồm các phát hiện thích hợp (kết quả bảng nghiêng tim) từ việc xem xét biểu đồ lâm sàng. Ngoài ra, tại thời điểm lấy máu, bác sĩ lâm sàng đã hoàn thành bản phân tích nạc của NASA. Chẩn đoán SFN được thiết lập thông qua việc xem xét biểu đồ lâm sàng và kiểm tra mô học của sinh thiết bấm lỗ da được thu thập từ vùng trước xương chày. Sinh thiết da được đánh giá độc lập tại Bệnh viện Đa khoa Massachusetts để định lượng hình thái của các đầu dây thần kinh biểu bì nhằm nghiên cứu mật độ tế bào thần kinh trên diện tích bề mặt da.

ELISA cạnh tranh BH4: Mức BH4 được đo và định lượng trong các mẫu huyết thanh của bệnh nhân ME-CFS và các đối chứng khỏe mạnh phù hợp với lứa tuổi theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Bộ ELISA cạnh tranh Human BH4; Nhà cung cấp: MyBioSource, Inc, San Diego, CA 92195, USA; Cat #MBS733839). Bộ sản phẩm đã được xác nhận trong phòng thí nghiệm của chúng tôi (máy đọc đĩa đa phương thức Perkin Elmer Victor X3, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) và có đường cong chuẩn (R2=0.98) và độ nhạy thấp tới 1 ng/mL sự tập trung liên quan đến kiểm soát tích cực. Tóm lại, các mẫu huyết thanh được pha loãng với chất pha loãng xét nghiệm (hoặc 1× PBS) và sau đó được nhỏ vào một đĩa vi thể đã được phủ trước bằng kháng thể kháng BH4 đa dòng. Sau 30 phút ủ mẫu, liên hợp BH{17}}HRP được thêm vào đĩa và ủ thêm 1 giờ ở 37 ◦C. Các mẫu huyết thanh còn lại được gạn và rửa trên đĩa bằng dung dịch đệm rửa 1× (cách khác là với 1× PBS-T) ba lần, mỗi lần năm phút bằng pipet đa kênh. Sau khi rửa, mỗi giếng được phản ứng với chất nền TMB trong 10 phút trong bóng tối. Sự phát triển màu sắc diễn ra sau 10 phút ủ cơ chất trong điều kiện lắc. Liên hợp BH{26}}HRP sẽ cạnh tranh với BH4 huyết thanh để liên kết với kháng thể sơ cấp được phủ. Do đó, càng nhiều BH4 huyết thanh trong mẫu thì càng ít liên kết với BH{30}}HRP và do đó tạo ra ít màu hơn. Tổng cộng có 66 mẫu huyết thanh (34 bệnh nhân ME-CFS đối chứng) đã được thu thập (chi tiết trong phần "lấy mẫu") với các hướng dẫn quy định phù hợp của tổ chức và được phân tích trong các điều kiện GLP. Việc phân phối mẫu là ngẫu nhiên và xét nghiệm được làm mù đôi, như được mô tả trong phần "điều chỉnh kích thước mẫu".

Chứng minh cỡ mẫu và phân tích thống kê: Cỡ mẫu được chứng minh bằng phương trình sau. Cỡ mẫu {{0}} n=z2p(1−p)/ε2=1.282∗0.95∗(1−0. 95)/0.052=32. Z là điểm z, là 1,28 cho lũy thừa 0,8. p là tỷ lệ dân số; đối với khoảng tin cậy 95%, p sẽ là {{20}},95. ε là biên độ sai số, là 0,05. Do đó, để đạt được ý nghĩa về sự khác biệt về giá trị trung bình giữa các nhóm với p < 0,05, tổng số n=32 mẫu cho mỗi nhóm đã được đưa vào. Để so sánh giữa bệnh nhân đối chứng và bệnh nhân CFS + OI, n=10 mẫu mỗi nhóm đã được đưa vào. Một cỡ mẫu tương tự đã được đưa vào khi so sánh các nhóm kiểm soát và kiểm soát +OI + SFN. Việc tính toán cỡ mẫu được thực hiện dựa trên ε=0.05 và p=0.99. Thử nghiệm Mann–Whitney U không tham số đã được áp dụng để kiểm tra tầm quan trọng của giá trị trung bình giữa hai nhóm bất cứ khi nào hai nhóm hiển thị phân phối dữ liệu bình thường và giống hệt nhau; mặt khác, một bài kiểm tra t không ghép đôi tham số đã được thực hiện. Để phân tích ghép đôi giữa các nhóm, thử nghiệm t ghép đôi tham số được thực hiện nếu điểm dữ liệu từ cả hai nhóm được phân phối bình thường; mặt khác, bài kiểm tra xếp hạng Wilcoxon đã được thực hiện để đánh giá tầm quan trọng giữa các nhóm. ANOVA hai chiều với Bonferroni hoặc Tukey sau hoc đã được áp dụng để kiểm tra tầm quan trọng của giá trị trung bình ở hơn hai nhóm coi giới tính (nam hoặc nữ) và sức khỏe (khỏe mạnh hoặc CFS) là tác nhân. Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện trong phần mềm GraphPad Prism phiên bản 9.5.1 (733) (Boston, MA 02110, USA).

Xét nghiệm ROS:Các tế bào vi mô phôi người HMC3 đã được nuôi cấy và di chuyển bằng môi trường DMEM hoàn chỉnh. Tóm lại, các tế bào HMC3 được mạ trong một đĩa 96 giếng để nghiên cứu đo huỳnh quang ROS. Các tế bào đã tăng trưởng đến độ hợp lưu 75–80% và được ủ bằng đầu dò DCFDA (Cat# ab113851; Abcam, Cambridge, UK) trong 45 phút ở 37 ◦C trong bóng tối. Môi trường tiêu chuẩn được thay thế bằng 100 µL (độ pha loãng 1:2=50 µL huyết thanh + 50 µL môi trường) của môi trường bổ sung huyết thanh trong 90 phút để đạt được giá trị huỳnh quang tối ưu. Vào cuối thời gian ủ bệnh, môi trường được hút và sau đó được đo ở mức phát xạ kích thích bằng bộ lọc 485 nm và 535 nm trong máy đọc đĩa PerkinElmer Victor X3 (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA).

Sự đóng góp của tác giả:AR hình thành ý tưởng, thiết kế, thực hiện nghiên cứu và viết bản thảo. CGG đã thực hiện nghiên cứu và viết bản thảo. RW đã giúp thu thập mẫu máu và lưu giữ hồ sơ bệnh nhân. DP là một PI lâm sàng, người chịu trách nhiệm thu thập mẫu sinh học, bảng câu hỏi và phê duyệt IRB. Tất cả các tác giả đã đọc và đồng ý với phiên bản đã xuất bản của bản thảo.

Kinh phí:Công trình này được hỗ trợ bởi Simmaron Research Inc., một tổ chức nghiên cứu phi lợi nhuận 501C, Incline Village, NV 89451, nhờ nguồn tài trợ từ Giải thưởng Ramsay 2023 đến AR của sáng kiến ​​Solve ME và Quỹ Hesse Sibylla, Quebec, QC, Canada.

Tuyên bố của Ban Đánh giá Thể chế:Không có phần nào của bài viết nghiên cứu này, bao gồm cả hình ảnh và văn bản, đã được xuất bản hoặc sao chép trước đây trong bất kỳ cuốn sách, bài báo hoặc tài liệu đã xuất bản nào khác. Hình ảnh là nguyên bản và không sao chép từ bất kỳ nguồn nào khác. Đây không phải là một thử nghiệm lâm sàng mà là một nghiên cứu quan sát mang tính thể chế. Việc thu thập mẫu sinh học, hướng dẫn câu hỏi, lưu trữ hồ sơ và tạo số nhận dạng duy nhất được thực hiện bởi Western IRB, giao thức số 20201812 (Ngày gia hạn hiện tại số 21/7/23).

Tuyên bố đồng ý sau khi được thông báo:Tất cả các tác giả đã đồng ý xuất bản bài viết đánh giá này.

Tuyên bố về tính sẵn có của dữ liệu:Không có bảng dữ liệu điện tử liên quan đến bài viết này. Không có dữ liệu trong kho lưu trữ điện tử.

Xung đột lợi ích:AR, CGG, RW và DP là nhân viên của Simmaron Research INC, một tổ chức nghiên cứu phi lợi nhuận 501C. Các tác giả tuyên bố không có xung đột lợi ích.

Các từ viết tắt

ME/CFS=Viêm não tủy hoặc hội chứng mệt mỏi mãn tính; OI=Không dung nạp tư thế đứng; SFN=bệnh đa dây thần kinh sợi nhỏ; BH4=tetrahydrobiopterin; eNOS=tổng hợp oxit nitric nội mô; KHÔNG=Oxit nitric. ROS=Các loại oxy phản ứng. ME/CFS=Viêm não tủy hoặc hội chứng mệt mỏi mãn tính; OI=Không dung nạp tư thế đứng; SFN=bệnh đa dây thần kinh sợi nhỏ; BH4=tetrahydrobiopterin; eNOS=tổng hợp oxit nitric nội mô; KHÔNG=Oxit nitric; và ROS=các loại oxy phản ứng.

Người giới thiệu

1. Lim, EJ; Ahn, YC; Jang, ES; Lee, SW; Lee, SH; Son, CG Đánh giá có hệ thống và phân tích tổng hợp về mức độ phổ biến của hội chứng mệt mỏi mãn tính/viêm não tủy cơ (CFS/ME). J. Dịch. Med. 2020, 18, 100. [Tham khảo chéo]

2. Sơn, C.-G. Đánh giá về mức độ phổ biến của mệt mỏi mãn tính trên toàn thế giới. J. Med Hàn Quốc. 2012, 33, 25–33.

3. Natelson, BH; Lin, J.-MS; Blate, M.; Khan, S.; Chen, Y.; Unger, ER Đánh giá sinh lý về khả năng không dung nạp tư thế đứng trong hội chứng mệt mỏi mãn tính. J. Dịch. Med. 2022, 20, 95. [Tham khảo chéo]

4. Bateman, L.; Tốt nhất, AC; Bonilla, HF; Chheda, BV; Chu, L.; Curtin, JM; Dempsey, TT; Dimmock, TÔI; Dowell, TG; Felsenstein, D. Viêm não cơ/hội chứng mệt mỏi mãn tính: Những điều cần thiết trong chẩn đoán và quản lý. Trong Kỷ yếu của Phòng khám Mayo; Elsevier: Amsterdam, Hà Lan, 2021; trang 2861–2878.

5. Basantsova, NY; Starshinova, AA; Dori, A.; Zinchenko, YS; Yablonskiy, PK; Shoenfeld, Y. Định nghĩa, chẩn đoán và điều trị bệnh lý thần kinh sợi nhỏ. Thần kinh. Khoa học. 2019, 40, 1343–1350. [Tham khảo chéo]

6. Shoenfeld, Y.; Ryabkova, VA; Scheibenbogen, C.; Chi nhánh, L.; Martinez-Lavin, M.; Ikeda, S.; Heidecke, H.; Watad, A.; Bragazzi, NL; Chapman, J. Các hội chứng phức tạp về đau mãn tính, mệt mỏi và suy giảm nhận thức có liên quan đến chứng mất tự chủ tự miễn và bệnh lý thần kinh sợi nhỏ. Phòng khám. Miễn dịch. 2020, 214, 108384. [Tham khảo chéo]

7. Leonardi, L.; Adam, C.; Beaudonnet, G.; Beauvais, D.; Cauquil, C.; Không, A.; Morassi, O.; Benmalek, A.; Trassard, O.; EchanizLaguna, A.; et al. Sự lắng đọng amyloid trên da và mất sợi thần kinh là dấu hiệu khởi phát và tiến triển của bệnh lý thần kinh trong bệnh amyloidosis transthyretin di truyền. Euro. J. Thần kinh. 2022, 29, 1477–1487. [CrossRef] [PubMed]

8. Ichinose, H.; Nomura, T.; Sumi-Ichinose, C. Chuyển hóa tetrahydrobiopterin: Sự liên quan của nó đối với các tế bào thần kinh monoaminergic và rối loạn thần kinh. Chem. Khuyến nghị 2008, 8, 378–385. [CrossRef] [PubMed]

9. Hạ, T.; Xám, DW; Shiman, R. Điều hòa phenylalanine hydroxylase của gan chuột. III. Kiểm soát xúc tác bằng (6R)-tetrahydrobiopterin và phenylalanine. J. Biol. Chem. 1994, 269, 24657–24665. [Tham khảo chéo]

10. Nagatsu, T.; Nagatsu, I. Tyrosine hydroxylase (TH), đồng yếu tố tetrahydrobiopterin (BH4), các enzyme liên quan đến catecholamine khác và gen người của chúng về thuốc và liệu pháp gen của bệnh Parkinson (PD): Tổng quan và triển vọng lịch sử. J. Truyền thần kinh. 2016, 123, 1255–1278. [Tham khảo chéo]

11. Sawada, M.; Sugimoto, T.; Matsuura, S.; Nagatsu, T. (6R)-Tetrahydrobiopterin làm tăng hoạt động của tryptophan hydroxylase trong lát raphe chuột. J. Hóa thần kinh. 1986, 47, 1544–1547. [Tham khảo chéo]

12. Chen, D.-D.; Chen, L.-Y.; Xie, J.-B.; Thục, C.; Dương, T.; Chu, S.; Nguyên, H.; Chen, AF Tetrahydrobiopterin điều chỉnh chức năng oxy hóa khử eNOS. Curr. Dược phẩm. Des. 2014, 20, 3554–3562. [CrossRef] [PubMed]

13. Higashi, Y.; Sasaki, S.; Nakagawa, K.; Kimura, M.; Noma, K.; Hara, K.; Jitsuiki, D.; Goto, C.; Oshima, T.; Chayama, K. Tetrahydrobiopterin cải thiện tình trạng suy giảm khả năng giãn mạch phụ thuộc vào nội mạc liên quan đến lão hóa thông qua việc tăng sản xuất oxit nitric. Xơ vữa động mạch 2006, 186, 390–395. [Tham khảo chéo]

14. Vương, WZ; Phương, XH; Stephenson, LL; Khiabani, KT; Zamboni, WA Tác dụng của việc bổ sung BH4 sau khi thiếu máu cục bộ kéo dài ở cơ xương. Vi phẫu 2007, 27, 200–205. [Tham khảo chéo]

15. Yang, Y.-M.; Hoàng, A.; Kaley, G.; Sun, D. eNOS tách rời và rối loạn chức năng nội mô ở các mạch máu già. Là. J. Physiol.-Tim Circ. Physiol. 2009, 297, H1829–H1836. [Tham khảo chéo]

16. Karbach, S.; Wenzel, P.; Người phục vụ, A.; Munzel, T.; Daiber, A. eNOS tách rời các bệnh tim mạch - vai trò của stress oxy hóa và viêm nhiễm. Curr. Dược phẩm. Des. 2014, 20, 3579–3594. [Tham khảo chéo]

17. Sindler, AL; Delp, MD; Reyes, R.; Ngô, G.; Muller-Delp, JM Ảnh hưởng của quá trình lão hóa và luyện tập thể dục đối với việc tách rời eNOS trong các tiểu động mạch kháng cơ xương. J. Physiol. 2009, 587, 3885–3897. [Tham khảo chéo]

18. Gottschalk, G.; Peterson, D.; Knox, K.; Maynard, M.; Whelan, RJ; Roy, A. Tăng ATG13 trong huyết thanh của bệnh nhân ME/CFS kích thích phản ứng căng thẳng oxy hóa trong các tế bào vi mô thông qua kích hoạt thụ thể cho các sản phẩm cuối glycation tiên tiến (RAGE). Mol. Tế bào. Khoa học thần kinh. 2022, 120, 103731. [CrossRef] [PubMed]

19. Blau, N.; Thony, B.; Spada, M.; Ponzone, A. Tetrahydrobiopterin và hyperphenylalaninemias di truyền. Thổ Nhĩ Kỳ. J. Pediatr. 1996, 38, 19–35. [PubMed]

20. Birnbacher, R.; Scheibenreiter, S.; Blau, N.; Bieglmayer, C.; Frisch, H.; Waldhauser, F. Hyperprolactinemia, một công cụ trong kiểm soát điều trị thiếu hụt tetrahydrobiopterin: Nghiên cứu nội tiết ở một cô gái bị ảnh hưởng. Nhi khoa. Res. 1998, 43, 472–477. [Tham khảo chéo]

21. Hyland, K.; Kasim, S.; Egami, K.; Arnold, L.; Thiếu Jinnah, H. Tetrahydrobiopterin và mất dopamine trong mô hình chuột di truyền mắc bệnh Lesch-Nyhan. J. Kế thừa. Metab. Dis. 2004, 27, 165–178. [Tham khảo chéo]

22. Lý, L.; Chen, W.; Rezvan, A.; Jo, H.; Harrison, sự thiếu hụt DG Tetrahydrobiopterin và sự tách cặp tổng hợp oxit nitric góp phần gây ra chứng xơ vữa động mạch do dòng chảy bị xáo trộn. Xơ cứng động mạch. Huyết khối. Vasc. Biol. 2011, 31, 1547–1554. [Tham khảo chéo]

23. Chuaiphichai, S.; Starr, A.; Nandi, M.; Channon, KM; McNeill, E. Sự thiếu hụt tetrahydrobiopterin của tế bào nội mô làm suy giảm rối loạn chức năng mạch máu và hạ huyết áp do LPS gây ra. Vasc. Dược phẩm. 2016, 77, 69–79. [CrossRef] [PubMed]

24. Choi, HJ; Lee, SY; Cho, Y.; Không, H.; Kim, SW; Hwang, O. Tetrahydrobiopterin gây ra rối loạn chức năng ty thể trong các tế bào dopaminergic: Những tác động đối với bệnh Parkinson. Thuốc thần kinh. Int. 2006, 48, 255–262. [CrossRef] [PubMed]

25. Lee, SY; Trăng, Y.; Hee Choi, D.; Jin Choi, H.; Hwang, O. Tính dễ bị tổn thương đặc biệt của các tế bào thần kinh dopaminergic trung mô của chuột đối với tetrahydrobiopterin: Mối liên quan với bệnh Parkinson. Thuốc thần kinh. Dis. 2007, 25, 112–120. [Tham khảo chéo]

26. Kwak, SS; Suk, J.; Choi, JH; Dương, S.; Kim, JW; Sơn, S.; Chung, JH; Hồng, YH; Lee, Đ.H; Ahn, JK; et al. Cảm ứng autophagy do thiếu tetrahydrobiopterin. Tự thực 2011, 7, 1323–1334. [CrossRef] [PubMed]

27. Porkert, M.; Sher, S.; Reddy, U.; Cheema, F.; Niessner, C.; Kolm, P.; Jones, DP; Hooper, C.; Taylor, WR; Harrison, D.; et al. Tetrahydrobiopterin: Một liệu pháp hạ huyết áp mới. J. Hừm. Tăng huyết áp. 2008, 22, 401–407. [CrossRef] [PubMed]

28. Channon, K. Tetrahydrobiopterin: Chất điều hòa tổng hợp Nitric Oxide nội mô trong bệnh mạch máu. Xu hướng tim mạch. Med. 2004, 14, 323–327. [Tham khảo chéo]

29. Phùng, Y.; Phong, Y.; Gu, L.; Lưu, P.; Cao, J.; Zhang, S. Vai trò quan trọng của quá trình chuyển hóa Tetrahydrobiopterin (BH4) trong việc điều chỉnh độ nhạy phóng xạ: Trục BH4/NOS là Thiên thần hay Ác quỷ. Đằng trước. Oncol. 2021, 11, 720632. [Tham khảo chéo]

30. Mandarano, AH; Maya, J.; Giloteaux, L.; Peterson, DL; Maynard, M.; Gottschalk, CG; Hanson, MR Bệnh nhân viêm não tủy/hội chứng mệt mỏi mãn tính có biểu hiện thay đổi chuyển hóa tế bào T và mối liên hệ giữa cytokine. J. Lâm sàng. Điều tra. 2020, 130, 1491–1505. [CrossRef] [PubMed]

Tuyên bố miễn trừ trách nhiệm/Lưu ý của nhà xuất bản:Các tuyên bố, ý kiến ​​và dữ liệu trong tất cả các ấn phẩm chỉ là của (các) tác giả và (các) cộng tác viên chứ không phải của MDPI và/hoặc (các) biên tập viên. MDPI và/hoặc (các) biên tập viên từ chối trách nhiệm đối với mọi thương tích đối với người hoặc tài sản do bất kỳ ý tưởng, phương pháp, hướng dẫn hoặc sản phẩm nào được đề cập trong nội dung.

【Để biết thêm thông tin:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】