Ảnh hưởng của áp lực tưới máu đối với sự mất tế bào bạch cầu trong thận chuột được tưới máu biệt lập

edmund.chen@wecistanche.com

trừu tượng

Cơ sở / Mục tiêu: Các tế bào nang bị mất trong hầu hết các bệnh cầu thận, dẫn đến xơ cứng cầu thận và tiến triểnbệnh thận. Người ta thường giả định rằng tế bào podocytes tiếp xúc với dòng lọc và do đó chịu lực cắt đáng kể dẫn đến sự tách rời của chúng khỏi màng đáy cầu thận (GBM). Trong bối cảnh này, hiệu quả của quá trình bàn chân đã được đề xuất như một phản ứng thích ứng tiềm năng để tăng sự kết dính của tế bào podocytes với GBM. Phương pháp: Chúng tôi đã kiểm tra những giả thuyết này bằng cách sử dụng quang học bù trừ quang học và phân tích hình thái kích thước 3- độ phân giải cao trong con chó được tưới máu cô lậpquả thận.Chúng tôi đã nghiên cứu động lực học của sự tách bạch cầu ở các áp suất tưới máu khác nhau (50, 300 và hơn 450 mmHg) ở chuột già hoặc trẻ khỏe mạnh (20 so với 71 tuần tuổi), hoặc chuột được tiêm huyết thanh kháng GBM để gây ra bàn chân toàn cầu. quá trình hiệu quả. Kết quả: Kết quả cho thấy các tế bào podocytes khỏe mạnh ở chuột non được gắn chặt vào GBM và ngay cả áp suất siêu thập phân cũng không gây ra sự tách rời đáng kể. So với chuột non, ở chuột già và chuột bị viêm thận do GBM và quá trình giãn nở ở chân, hiện tượng mất dần dần tế bào podocytes đã xảy ra trước khi truyền dịch. Áp lực tưới máu cao dẫn đến sự mất mát bổ sung tương đối nhỏ của tế bào podocytes ở những con chuột già. Ở những con chuột bị viêm thận do GBM, sự mất podocyte bổ sung đáng kể xảy ra vào thời điểm ban đầu này khi tăng áp lực tưới máu lên 300 mmHg hoặc cao hơn. Kết luận: Công trình nghiên cứu này cung cấp bằng chứng thực nghiệm đầu tiên cho thấy tế bào podocytes có khả năng chống lại áp lực tưới máu tăng đột biến trong một ex vivo được phân lậpquả thậnmô hình tưới máu. Chỉ trong bệnh cầu thận, số lượng đáng kể các tế bào vỏ bị thương mới tách ra sau khi tăng áp lực tưới máu cấp tính.

Từ khóa:Tăng huyết áp cầu thận; Tăng lọc cầu thận; Ứng suất cơ học; Sự tiến triển; Bệnh thận mãn tính

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN BỆNH KIDNEY / RENAL

Giới thiệu

Tăng áp và tăng lọc cầu thận làm tổn thương cầu thận dẫn đến bệnh cầu thận tiến triển. Người ta tin rằng áp lực tưới máu tăng lên làm bộc lộ các búi gây căng thẳng cơ học tăng thách thức sự kết dính của các tế bào podocytes với màng đáy cầu thận (GBM), góp phần vào sự tách rời của chúng [1, 2]. Podocytes là những tế bào sau nguyên phân, có khả năng biệt hóa cao, rất cần thiết cho một hàng rào lọc cầu thận còn nguyên vẹn. Mất tế bào podocyte rất có thể là kết quả của sự tách rời các tế bào sống sót khỏi GBM chứ không phải là quá trình chết hoặc hoại tử [3-6] vì có thể nuôi cấy các tế bào podocyte được thu hồi từ nước tiểu của bệnh nhân [4]. Việc tách các tế bào podocytes còn tồn tại khỏi GBM có thể do các cơ chế gắn kết bị suy giảm hoặc các lực thay đổi cơ học. Suy giảm khả năng gắn vào GBM có thể do tổn thương tế bào hoặc giảm biểu hiện của các phân tử kết dính và chủ yếu liên quan đến các bệnh cầu thận viêm. Đối với các lực cơ học liên quan đến podocyte, có hai yếu tố quyết định chính, đó là áp suất lọc và lưu lượng dịch lọc [7-9]. Áp suất lọc tạo ra ứng suất thành chu vi và hoạt động như một lực bóp méo GBM. Sự thay đổi của áp suất thủy tĩnh xuyên màng được bù đắp một cách hiệu quả bởi khả năng GBM hoạt động như một màng đàn hồi và giãn nở hoặc co lại trong diện tích bề mặt [8, 1 0]. Mặt khác, dòng dịch lọc qua GBM tạo ra các lực tiếp tuyến trên bề mặt của tế bào vỏ, tức là ứng suất cắt. Chúng ta biết từ các nghiên cứu in vitro rằng tế bào vỏ rất dễ bị ứng suất cắt tách ra khỏi chất nền của chúng khi tiếp xúc với ứng suất cắt lớn hơn 0,025 Pa [11] và sử dụng một kiểu hình trung gian có thể giúp chúng chống lại các lực bắt nguồn từ dòng chảy [12]. Tăng huyết áp cầu thận có ảnh hưởng đến tế bào podocytes thông qua tăng áp lực lọc và / hoặc tăng lọc hay không vẫn chưa rõ ràng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cung cấp phân tích đầu tiên về khả năng của tế bào podocytes để chống lại các lực cơ học tăng lên trong mô hình ex vivo. Sự mất tế bào podocyte được định lượng với độ phân giải cao bằng cách sử dụng phương pháp xóa mô và phân tích hình thái 3- chiều ở chuột trẻ và khỏe mạnh

Nguyên liệu và phương pháp

Tất cả các thí nghiệm trên động vật đều được tiến hành theo hướng dẫn của luật pháp Đức vì quyền lợi của động vật và đã được Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (Az 84-02. 04. 2015.A469) chấp thuận. Chuột được nuôi trong một cơ sở không có mầm bệnh cụ thể với quyền tiếp cận miễn phí với thức ăn và nước và chu kỳ 12- giờ ngày / đêm. Việc chọn giống và phân loại kiểu gen được thực hiện theo quy trình chuẩn. Chuột Pod-rtTA / LC1 / R26R / H2BeGFP trên nền tảng di truyền FVB / N đã được mô tả trước đây [13]. Để kích hoạt biểu hiện gen chuyển của Pod-rtTA-eGFP, những con chuột đã nhận doxycycline qua ad libitum nước uống trong 7 ngày (2 g / l, 5% sucrose, tránh ánh sáng) sau đó là thời gian rửa trôi 1 tuần như các báo cáo trước đó. Viêm thận chống GBM được gây ra bằng cách tiêm vào màng bụng duy nhất 5 mg / g huyết thanh gây độc cho thận thể trọng như đã mô tả trước đây [14].

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG KIDNEY / RENAL

Tưới máu thận

Cô lậpquả thậnmô hình tưới máu đã được sử dụng như được mô tả ở những nơi khác [15]. Tóm lại, những con chuột bị mê hoặc bằng cách tiêm xylazine / ketamine vào màng bụng (0, 1ml / 10g trọng lượng cơ thể), và sau đó thận được tưới máu bằng dung dịch Krebs-Henseleit đã được sửa đổi phức tạp (Bảng 1) bổ sung 5 phần trăm albumin huyết thanh bò (BSA) ở 37 độ để bắt chước mô hình sinh lý trong quá trình thử nghiệm. Giãn mạch tối đa củaquả thậnmạch máu được gây ra bằng cách 1. tiêm dưới da verapamil (50µl) ngay sau khi khởi mê và 2. thêm papaverine vào dung dịch truyền dịch. Sau khi truyền dịch ban đầu trong 5 phút ở 50 mmHg, một lectin được đánh dấu huỳnh quang (Communis I - RCA120; Vector Laboratories: RL -1082; 4 ul trong 986 ul nước muối) được tiêm để gắn nhãn các tế bào nội mô.Thậnđược tưới thêm 5 phút bằng dung dịch Krebs-Henseleit đã được sửa đổi với 5% BSA. Sau đó, tráiquả thậnmà đóng vai trò là kiểm soát được ghép nối trong mọi thử nghiệm đã bị loại bỏ sau khi thắt chặt bên trái một cách cẩn thậnthậntàu, cắt thành từng lát và ngâm trực tiếp trong 3% paraformaldehyde (PFA) trong nước muối đệm phốt phát (PBS). Bên phảiquả thận was perfused either for additional 5 minutes at 300 mmHg or with supramaximal pressure (>>300mmHg, áp suất lọc được ước tính là trên 400 mmHg), áp dụng bằng tay, tổng thể tích của dung dịch truyền 50 ml. Cácthậnđược tưới máu với áp suất không đổi là 50 mmHg hoặc 300 mmHg bằng cách sử dụng một máy bơm điều chỉnh áp suất (Universal Perfusion Systems UP -100, Hugo-Sachs Electronics, Đức). Sau đó, bên phảiquả thậnđã được loại bỏ, cắt thành các lát 2 mm, và ngâm trong 3 phần trăm paraformaldehyde (PFA) trong nước muối đệm phốt phát (PBS).

Hình ảnh 3D và phân tích tính toán PFA đắm mìnhquả thậncác lát được ủ trên máy lắc cơ học trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các mẫu cố định được rửa trong 1x PBS và đặt trong máy lắc cơ học qua đêm ở nhiệt độ phòng.Quả thậncác lát sau đó được đặt trong etanol 100% cao cấp (Merck; 100983) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng với lắc nhẹ (ít nhất 1 lần đổi thành etanol tươi), tiếp theo là ngâm trực tiếp trong Ethyl Cinnamate (ECi) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 112372) và được để qua đêm trong máy lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng dưới ánh sáng. Độ trong mờ của mô đạt được trong vòng chưa đầy 1 giờ. Đối với kính hiển vi dựng đứng, chúng tôi sử dụng các buồng chế tạo trong nhà dùng một lần như đã mô tả trước đây [16]. Hầu hết các thí nghiệm được thực hiện bằng 2- kính hiển vi photon (LaVision BioTec TriMScope, "Medizinische Fakultät RWTH Aachen, IZKF Aachen, Core Facilities). Phần mềm hình ảnh Fiji được sử dụng để di chuyển qua trục Z của mỗi chồng phần quang nối tiếp và để phân lập các cầu thận riêng lẻ thông qua cắt xén 3D [16]. 40 cầu thận mỗiquả thận(20 vỏ dưới vỏ và 20 vỏ ngoài) đã được chọn để phân tích. Vì vậy, trong tổng số 1200 cầu thận được phân tích trong nghiên cứu này để thu được kết quả với độ chính xác vừa đủ. Podocytes được xác định là tế bào cộng với eGFP. Việc định lượng thể tích mao mạch, thể tích cầu thận cũng như số lượng nhân (chấm) và thể tích được thực hiện bằng phần mềm phân tích và dựng hình 3D (Imaris v9.1; Bitplane AG, Zurich, Thụy Sĩ) Khoảng cách của tế bào nang từ cực mạch máu được tính bằng cách sử dụng Bitplane XTension "Điểm gần nhất. Khoảng cách". Tự động định lượng podocytes được thực hiện như đã mô tả trước đây [17]. Phân tích hình ảnh được thực hiện bằng Imaris (Biplane AG Zurich, Thụy Sĩ). Mỗi cầu thận được xác định bởi tiểu động mạch hướng tâm đánh dấu lectin của nó. 20 vỏ dưới vỏ và 20 vỏ ngoài (được xác định bằng khoảng cách của chúng với bề mặt vỏ não).

CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN ĐAU KIDNEY / RENAL

Kính hiển vi ánh sáng & Miễn dịch huỳnh quang

Đối với kính hiển vi ánh sáng, 4% formalin có đệm cố địnhquả thậncác mảnh được khử nước, nhúng trong parafin và nhuộm bằng axit định kỳ – Schiff (PAS). Tỷ lệ phần trăm cầu thận bất thường / bị thương được tính toán dựa trên việc xác định 50 mặt cắt cầu thận đại diện cho mỗi con chuột được chọn trong quá trình đi bộ có hệ thống quathậnvỏ não. Giao thức miễn dịch huỳnh quang tiêu chuẩn của chúng tôi [18] được thực hiện trên các đoạn nhúng parafin 2 μm. Các kháng thể sau đã được sử dụng: kháng GFP đa dòng ở gà (ab13970; Abcam), kháng synaptopodin đơn dòng của chuột (sc -515842; Công nghệ sinh học Santa Cruz), chống chuột đa dòng p57 của thỏ (sc -8298; Santa -Cruz Biotechnology), chống WT1 đa dòng cho thỏ (sc -192; Công nghệ sinh học Santa-Cruz), chống gà lừa Cy2 (703-225-155; Dianova, Hamburg, Đức), IgG1 chống chuột cho dê Alexa Fluor546 (A -21123; Thermo Fischer), chống thỏ đa dòng AF555 (A31572; Life Technologies, Carlsbad, CA).

Kính hiển vi điện tử

Các mảnh nhỏ của vỏ não được cố định trong dung dịch Karnovsky và nhúng vào Epon (Serva, Heidelberg, Đức). Các phần siêu mỏng được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử truyền qua ZEISS Leo 9 0 6 ở 6 0 kV bằng độ phóng đại từ 3597-6000 x. Các mẫu được rửa trong 0,1 M phosphat của Soerensen (Merck, Darmstadt, Đức), sau khi cố định trong 1% OsO 4 (Roth, Karlsruhe, Đức) trong dung dịch đệm sucrose 17% (Merck, Darmstadt, Đức) và khử nước bằng loạt etanol tăng dần ( 30, 50, 70, 90 và 100 phần trăm) trong 10 phút mỗi. Bước cuối cùng lặp lại 3 lần. Các mẫu thử đã khử nước được ủ trong propylen oxit (Serva, Heidelberg, Đức) trong 30 phút, trong hỗn hợp nhựa Epon (Serva, Heidelberg, Đức) và propylen oxit (1: 1) trong 1 giờ và cuối cùng trong Epon nguyên chất trong 1 giờ. Quá trình trùng hợp epon được thực hiện ở 90 độ trong 2 giờ. Các mặt cắt siêu mỏng (70-100 nm) được cắt bằng máy siêu mỏng (Reichert Ultracut S, Leica bằng dao kim cương (Leica) và được chọn trên lưới Cu / Rh (HR23 Maxtaform, Plano, Wetzlar Đức). Độ tương phản được tăng cường bởi nhuộm với 0,5% uranyl axetat và 1% xitrat chì (cả EMS, Munich, Đức). Các mẫu được xem ở điện áp gia tốc 60 kV bằng kính hiển vi điện tử truyền qua Zeiss Leo 906 (Carl Zeiss, Oberkochen, Đức).

Phân tích thống kê

Các phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm GraphPad Prism v8. Tất cả các giá trị được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± SD. Để so sánh 2 nhóm, một phép thử t đã được sử dụng. So sánh một số nhóm được thực hiện bằng cách sử dụng phân tích phương sai; Chỉnh sửa bài Tukey đã được sử dụng để so sánh nhiều lần. Tất cả các thử nghiệm đều là 2- và ý nghĩa thống kê được xác định là P <0.>

Kết quả

Phương pháp bán tự động để xác định số lượng tế bào podocytes trên mỗi cầu thận Ba nhóm đã được nghiên cứu, đó là chuột già và trẻ khỏe mạnh và chuột có chống viêm cầu thận GBM (♂: ♀ 1: 1). Những con chuột trẻ, khỏe mạnh được 15-21 tuần tuổi, trong khi những con chuột già (già) là 74 tuần tuổi. Quá trình bàn chân trên toàn cầu được tạo ra ở chuột 14-20 tuần qua một lần tiêm huyết thanh kháng GBM duy nhất 3 ngày trước khi thiết lập hệ thống truyền dịch cô lậpquả thậnmô hình (Hình. 1A), như đã mô tả trước đây [19].

Để xác định ảnh hưởng của áp lực tưới máu trong thượng thận đối với tế bào podocytes,thậnphải chịu áp lực tưới máu khác nhau trong những người bị cô lậpquả thậnmô hình tưới máu. Đầu tiên, cả haithậnluôn được truyền ở 50 mmHg trong 5 phút. Để kiểm tra xem liệu giải pháp truyền dịch của chúng tôi có bảo tồn được tính toàn vẹn của cầu thận ở trạng thái sống sót khôngthận, 2 con chuột được truyền dịch ở áp suất không đổi 100 mmHg trong 90 phút. Sự tưới máu, lưu lượng nước tiểu (25 µl / phút / gr trọng lượng cơ thể) cũng như độ thanh thải inulin (22 µl / phút) vẫn ổn định trong suốt thời gian (Hình bổ sung 1 - cho tất cả các tài liệu bổ sung, xemwww.cellphysiolbiochem.com).Trên chuột thí nghiệm, sau khi truyền dịch ban đầu ở 50 mmHg, tráiquả thận was removed and served as a control in all experiments. Next, constant pressure of 300 mmHg or a pressure significantly higher than 300 mmHg (>>300 mmHg; áp suất lọc siêu thập phân khoảng 450 - 500 mmHg) được áp dụng cho phần bên phải còn lạiquả thậntrong 5 phút. (Hình 1B). Trong tưới máu cô lậpthận, podocytes được xác định bằng cách sử dụng ghi nhãn hạt nhân với eGFP-histone ở chuột chuyển gen của chúng tôi biểu hiện eGFP dưới promoter podocin (eGFP: Pod-rtTA mouse). Số lượng tế bào sinh dục được định lượng bằng cách sử dụng sự kết hợp giữa ghi nhãn trao đổi chất in vivo này và phép đo hình thái 3D (Hình 1C).

Mất tế bào podocyte ở chuột già và khỏe mạnh

Healthy mice contained 87.46 ± 5.66 (SD) podocytes per glomerulus at baseline (i.e.at physiological perfusion pressure of 50 mmHg) (Fig. 2A). Juxtamedullary glomeruli were larger than those in the outer cortex (Supplementary Fig. 2), but this was not associated with higher podocyte numbers (87.0± 23.65 vs. 90.1 ± 18.49, respectively, Fib 2B). No differences in the number of podocytes related to sex were observed (see below). In young mice, there was no significant loss of podocytes at high (300 mmHg) or maximal (>>300 mmHg) perfusion pressures (85.62 ± 10.83 and 81.98 ± 6.45 podocytes per glomerulus, respectively) (Fig. 1A). On PAS sections, mild histological changwere observed particularly in aged mice (Fig. 2A), which were independent of perfusion pressures. In addition, tubular dilatation and interstitial edema were apparent as a result of perfusion. In humans, older age (53 ± 10 years) has been associated with absolute and relative podocyte depletion [20]. Compared to young mice, our mice aged 72 weeks contained significantly lower numbers of podocytes per glomerulus at baseline (52.81 ± 13.8 SD), indicating that about 40% of the podocytes had been lost. Perfusion at high or maximal pressures resulted in only a very mild reduction of podocyte numbers (48.65 ± 16.8 SD and 41.06 ± 17.7 SD, respectively). Because of the precision of the counting method (absolute podocyte numbers in 40 glomeruli per mouse) [21], the loss of podocytes of 7.9% and 22% after perfusion with 300 or >>300 mmHg tương ứng so với ban đầu cho thấy rằng sự gia tăng nhỏ của sự mất tế bào podocyte khi áp suất cao hơn không phải là một phát hiện ngẫu nhiên. Trên các phần PAS, những thay đổi nhẹ ở cầu thận đã được quan sát thấy ở những con chuột già lúc ban đầu (giãn nở trung bì và thỉnh thoảng xơ cứng, Hình 2F). Một

Mất bạch cầu sau chấn thương cấp tính

Huyết thanh kháng GBM đã được áp dụng cho những con chuột trẻ khỏe mạnh để gây ra tổn thương đáng kể và cụ thể cho tế bào vỏ. Tại thời điểm rất sớm (tức là 3 ngày) sau khi khởi phát viêm cầu thận chống GBM, quá trình bàn chân tổng quát đã được quan sát thấy ở tất cả các cầu thận bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (Hình 3A-D). Trong tưới máu cô lậpthậnobtained from these mice, at baseline (i.e. perfusion with 50mmHg) podocyte numbers per glomerulus were reduced by 20% compared to controls (69.76 ± 7.07 vs 87.46 ± 5.66, respectively) (Fig. 3E). Perfusion with higher pressures (300 and >>300 mmHg) resulted in significant further reductions of podocyte numbers per glomerulus (50.84 ± 7.82 and 53.18 ± 4.26, respectively), i.e. 27% and 24% additional reduction (Fig. 3E). When analyzing individual glomeruli, the anti-GBM mice, perfusion with >>300 mmHg gây mất hơn 80% podocyte ở một số ít các cầu thận (Hình 3E). Điều này phù hợp với bản chất trọng tâm của mô hình chống bệnh GBM. Trong các cầu thận cận tủy, mất tế bào podocyte rõ ràng hơn so với cầu thận dưới vỏ (tương ứng là 56,66 ± 16,9 và 47,35 ± 17,07) (Hình 3F)

By transmission electron microscopy (TEM), specific changes were observed after high perfusion pressures, in particular focal podocyte detachment from the GBM and denuded basement membrane (Fig. 3D). Cellular debris was present within the capillaries as well as within Bowman's space (>>300 mmHg); nội mô không cho thấy những thay đổi đáng kể. Nhuộm PAS xác định sự giãn nở của ống thận. Ba ngày sau khi tiêm huyết thanh kháng GBM, không có tổn thương hình lưỡi liềm nào phát triển (Hình 3G-I). Con đực cho thấy mức độ mất tế bào podocyte cao hơn so với con cái (63,71 ± 2,11 so với 75,81 ± 3,83 podocytes trên mỗi cầu thận), điều này phù hợp với nhận xét rằng chuột đực nhạy cảm hơn với kháng huyết thanh kháng GBM và hình thành nhiều nếp gấp tế bào hơn trong quá trình bệnh (Hình 3J). Tuy nhiên, sự mất thêm tế bào podocytes sau khi áp lực tưới máu cao là tương tự ở nam và nữ (Hình 3J).

Hình 3. Mất tế bào sinh dưỡng sau chấn thương cấp tính. (AB) Kính hiển vi điện tử truyền qua từ một điều khiểnquả thận per- fused at a low pressure and after supramaximal pressure (>>300 mmHg) shows normal foot process architecture. (C-D) Transmission electron microscopy reveals the typical finding of foot process effacement after injection of anti-GBM serum at baseline. After perfusion with higher pressure, areas of denuded basement membrane were observed. (E) Total number of podocytes per mouse in anti-GBM mice at baseline and under higher (300 mmHg) or supramaximal pressures (>> 300 mmHg); (each circle represents 1 kidney; n=7 control kidneys with 50mmHg, n=8 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=4 kidneys with 300 mmHg or >> 300mmHg). (F) Total number of podocytes per glomerulus in juxtamedullary and subcortical glomeruli; each circle represents 1 subcortical glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse) and each triangle represents 1 juxtamedullary glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse). (G-I) Histologic staining of anti-GBM mice at baseline identified protein casts, whereas three days after injection of anti-GBM serum no crescentic lesions could be found. After perfusion with higher pressure, tubule-interstitial dilatation and edema were observed. (J) Total podocyte number per mouse between males and females; each circle represents 1 kidney (n=4 control kidneys with 50mmHg, n=4 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=2 kidneys with 300 mmHg or >>300mmHg). Để so sánh nhiều ANOVA. ****P<0.0001, ***p ="" <="" 0,0001,=""><0.01,><0.05 and="" ns="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="">

Truy tìm các podocytes bị mất trong ống

eGFP cộng với podocytes thường xuyên được quan sát thấy trong lòng của các ống lượn gần, nơi chúng dường như bám vào đường viền bàn chải của các tế bào ống lượn gần (Hình 4A). Những tế bào podocytes này không bị rửa trôi khi được tưới máu quá mứcquả thậns, thay vào đó, chúng dính khá chặt vào viền bàn chải để chịu được dòng chảy bất thường của nước tiểu ban đầu ở áp suất tưới máu rất cao. Để xác nhận danh tính của chúng, các tế bào podocyte đã được nhuộm đồng thời với các dấu hiệu đặc trưng cho podocyte (tức là, p57, synaptopodin và WT -1) cùng với eGFP hạt nhân đánh dấu dòng dõi di truyền (Hình 4B). Số lượng tế bào podocyte thấp hơn đáng kể ở những cầu thận có các tế bào podocyte kết dính trong ống lượn gần được liên kết, và sự hiện diện của các tế bào podocyte trong các ống tương quan nghịch với số lượng tế bào podocyte trên mỗi cầu thận (Hình 4C).

Ưu tiên mất tế bào podocytes ở vị trí ven dương

Finally, we investigated whether podocyte loss driven by an acute increase in perfusion pressures might occur in preferential locations of the glomerulus (i.e. at the vascular pole vs. the tubular pole of the glomerular tuft). To analyze the spatial distribution of podocyte detachment, the vascular pole was marked in each glomerulus (acquired in 3D) based on the lectin signal and the distance of each podocyte from the vascular pole was determined semi-automatically. The individual distances from the vascular pole were separated into quartiles (Fig. 4E). As depicted in Fig. 4E, the majority of podocytes clustered in the 2 middle quartiles (i.e. quartile 2 and 3). Less than 12 % of the podocytes localized to either in the first, i.e. vascular pole, or the fourth quartile, i.e. most distant from the vascular pole. Upon perfusion with pressures >>300 mmHg, không có thay đổi đáng kể nào trong sự phân bố không gian của tế bào vỏ được quan sát thấy ở chuột trẻ và khỏe mạnh. Ở những con chuột già, khoảng cách podocyte từ cực mạch máu nói chung tăng lên, rất có thể phản ánh sự phì đại cầu thận, trong khi sự tăng tưới máu dẫn đến sự tách rời ưu tiên của các tế bào podocyte gần cực mạch máu (phần tư thứ nhất giảm từ 11,5% xuống 4,9% ở chuột già, Hình 4E ). Tương tự, một sự tách rời ưu tiên của các tế bào podocytes gần cực mạch máu đã được quan sát thấy trong các tế bào podocytes bị tràn dịch (anti-GBM, phần tư thứ nhất giảm từ 25 xuống 5%).

Thảo luận

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xem xét các tác động cấp tính của việc tăng áp suất lọc và lưu lượng lọc đối với sự mất tế bào podocyte trong thận chuột được tưới máu cô lập, sử dụng phương pháp chính xác nhất hiện nay để xác định số lượng podocyte. Phát hiện chính đầu tiên trong nghiên cứu của chúng tôi là các tế bào podocytes khỏe mạnh không dễ bị ứng suất cắt cấp tính in vivo, như các nghiên cứu nuôi cấy tế bào đã đề xuất trước đây [11]. Trước sự ngạc nhiên của chúng tôi, ngay cả áp lực siêu sinh lý (hơn 450 mmHg) cũng không gây ra sự tách bạch cầu đáng kể. Thay vào đó, kính hiển vi điện tử truyền qua cho thấy rằng cả ba lớp của hàng rào lọc vẫn được bảo quản tương đối tốt. Những con chuột già hơn cho thấy số lượng podocyte giảm (như đã báo cáo trước đây) và điều này chỉ liên quan đến sự gia tăng rất hạn chế tính nhạy cảm với áp lực tưới máu cao. Phát hiện chính thứ hai là tổn thương podocyte trước đó làm cho các podocyte dễ bị tách ra ở áp suất tưới máu cao. Những con chuột chống GBM cho thấy các quá trình bàn chân trên toàn cầu bùng phát ba ngày sau khi tiêm kháng huyết thanh kháng GBM và số lượng đáng kể tách ra ở áp suất tưới máu cao. Ở những con chuột già, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng sinh lý học của tế bào podocyte được bảo quản tương đối tốt, khiến chúng ít bị tách rời hơn. Bằng cách áp dụng phương pháp đếm bán tự động, mỗi cầu thận được phân tích riêng biệt (tổng số 1200 cầu thận được phân tích). Chúng tôi xác nhận rằng cầu thận cận tủy có thể tích lớn hơn cầu thận dưới vỏ. Điều thú vị là số lượng podocyte là như nhau, cho thấy mật độ podocyte bị giảm ở các cầu thận cận tủy. Ngoài ra, cầu thận vỏ cũng dễ bị tổn thương hơn khi tăng áp lực lọc so với cầu thận dưới vỏ. Những phát hiện này có thể giải thích một phần, tại sao các tổn thương FSGS có thể được quan sát với tần suất cao hơn ở các cầu thận lớn như vậy [22, 23].

Hình 4. Phát hiện podocytes ở prox liền kề. hình ống. (A) Hình ảnh đại diện cho thấy eGFP cộng với podocytes (màu xanh lá cây) trong ống. (B) Nhuộm miễn dịch huỳnh quang của tế bào podocytes được đồng đánh dấu bởi gen chuyển gen eGFP (xanh lục), và các dấu hiệu podocyte nội sinh p57 (đỏ), wt -1 (đỏ) và synaptopodin (tím). (C) Sự liên kết giữa số lượng tế bào podocyte trên mỗi cầu thận với số lượng tế bào podocyte được xác định trong ống (n =81 cầu thận từ chuột đối chứng, n=41 cầu thận từ chuột già và n=81 cầu thận từ chuột chống GBM). Đối với nhiều phép so sánh, ANOVA đã được sử dụng. ****P<0.0001,>< 0.01="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="" sd;="" in="" the="" graph,="" each="" circle="" represents="" 1="" podocyte;="" (d)="" schematic="" showing="" how="" the="" distance="" of="" podocytes="" from="" vascular="" pole="" was="" calculated.="" (e)="" distances="" of="" individual="" podocytes="" from="" the="" vascular="" pole.="" the="" individual="" distances="" from="" the="" vascular="" pole="" were="" separated="" into="">

Một hạn chế của nghiên cứu này là thời gian quan sát ngắn, vì không thể đưa ra kết luận nào liên quan đến sự thích nghi lâu dài của tế bào podocytes với việc tăng áp suất lọc. Người ta đã đề xuất rằng phản ứng đầu tiên của tế bào podocytes khi tiếp xúc với căng thẳng cắt là trải qua những thay đổi cấu trúc bảo vệ [8, 24]. Những thay đổi này bao gồm việc mất các khe lọc (tức là FPE) và thay thế các màng ngăn bằng cách tắc hoặc các mối nối chặt chẽ. Các điểm nối bao gồm trước đây đã được mô tả trong một số mô hình bệnh cầu thận [25-28]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của mình, chúng tôi quan sát thấy rằng các tế bào podocytes có FPE dễ bị áp lực=tưới máu cao hơn. Do đó, kết quả của chúng tôi cho thấy rằng những thay đổi thích ứng này không đủ để bảo vệ chống lại sự tách rời hoặc thậm chí có khả năng ngược lại, chúng khiến các tế bào podocytes dễ bị tách rời hơn. Tiếp theo, có thể lập luận rằng sự phân lập được tưới máuquả thậnkhông phải là một hệ thống sinh lý và áp suất được áp dụng cao hơn nhiều so với trong điều kiện in vivo. Theo hiểu biết của chúng tôi, không có mô hình nào khác sử dụngquả thậntồn tại cho phép điều tra trực tiếp ảnh hưởng của việc tăng áp lực tưới máu. Bằng cách sử dụng thuốc giãn mạch trước và trong khi truyền dịch, làm giãn tối đa các mạch trước cầu thận để cho phép dòng chảy không bị hạn chế (tăng lọc) và truyền tối đa áp lực tưới máu vào cầu thận. Trong nghiên cứu này, các tác động cấp tính của áp lực tưới máu cao hơn đã được nghiên cứu. Ảnh hưởng lâu dài của tăng tưới máu bệnh lý có thể nguy hiểm hơn, thậm chí dẫn đến mất nhiều tế bào podocyte hơn. Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng sự mất tế bào podocytes mãn tính này không phải do lực tuyệt đối của dòng lọc mỗi lần mà phần lớn là do những thay đổi thích nghi (nam tính) trong tế bào podocytes làm giảm khả năng tuân thủ GBM của chúng. Bệnh nhân mắc bệnh cầu thận được hưởng lợi từ điều trị hạ huyết áp bằng cách ngăn chặn những thay đổi cấu trúc thích ứng (ác) của tế bào vỏ.

Sự kết luận

Công trình nghiên cứu này cung cấp bằng chứng in vivo đầu tiên cho thấy các tế bào podocytes khỏe mạnh được gắn chặt một cách đặc biệt vào GBM trong thận của chuột khỏe mạnh và có thể chống lại áp lực tưới máu thậm chí rất cao. Lão hóa hoặc thậm chí rõ ràng hơn là tổn thương tế bào podocyte cấp tính với tràn dịch toàn cầu, làm cho các tế bào podocyte dễ bị tách ra khi tăng áp lực tưới máu.