Tác dụng của Glyeoside của Cistanche đối với khả năng học tập nhận thức và độ dẻo của khớp thần kinh ở chuột mô hình thiếu ngủ

TÓM TẮT

Khách quan:Để khám phá xem liệu glycoside của cistanche có thể cải thiện chức năng học tập và nhận thức của chuột mô hình thiếu ngủ hay không bằng cách điều chỉnh độ dẻo của khớp thần kinh.

Phương pháp: Năm mươi con chuột Wistar đực được chia ngẫu nhiên thành nhóm kiểm soát trống ( Control), nhóm kiểm soát nền tảng ( PC), nhóm mô hình ( Model),glycoside của nhóm cistanche (GC), và nhóm estazolam ( Est ). Mô hình thiếu ngủ của chuột được chuẩn bị bằng phương pháp môi trường nước đa nền tảng đã được sửa đổi. Mê cung nước Morris và thử nghiệm ngoài trời được sử dụng để phát hiện chức năng nhận thức không gian và sự thay đổi cảm xúc của chuột. Nhuộm Nissl được sử dụng để quan sát những thay đổi về hình thái và số lượng tế bào thần kinh trong cơ thể.vùng CA hồi hải mã của chuột. Western blot và R'T - PCR được sử dụng để phát hiện mức độ biểu hiện của synolinehysin(SY'N), chất đậm đặc màng sau synap 95 ( PSD -95 ), vàyếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ não (BDNF). 

Kết quả;Kết quả mê cung nước Morris cho thấy so với nhóm Control,khả năng học tập và nhận thức của chuộttrong nhóm Model đã giảm đáng kể ( P<0. 05 ), and the learning and memory function of rats wascải thiện điều trị GC ( P <0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05 ), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05 ), the resting time increased ( P <0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T - PCR showed that the mức độ biểu hiện protein và gen của BDNF, SYN và PSD -95trong nhóm Mlodel đã giảm đáng kể ( P<0. 05 ), while after treatment with GCs, the expression levels ofBDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05). Conclusion: Glycosides of cistanche may af. feet synaptic plasticity by regulating the expression of synaptic-related markers, thereby improving the learning and cognitive function of sleep deprivation model rats.

THẢO DƯỢC CISTANCHE CÔNG THỨC BỔ SUNG CHOCẢI THIỆN CHỨC NĂNG HỌC TẬP VÀ NHẬN THỨC

TỪ KHÓAGlycoside của cistanche; Hồi hải mã; Thiếu ngủ; Học tập và trí nhớ; Sự lo lắng; Độ dẻo synap

Rối loạn giấc ngủ (SD)là mộtrối loạn chức năng của giấc ngủ bất thườngdo hàng loạt yếu tố phức tạp gây ra nhưmất ngủ, sự mơ màng, Vàdễ dàng thức tỉnh. Trong những năm gần đây,tỷ lệ mắc SDđã và đang tăng dần. Các nghiên cứu liên quan đã báo cáo rằng SD có thể gây rabệnh tim mạch,rối loạn chức năng trao đổi chất,bệnh miễn dịch, Vàhệ thống thần kinh trung ươngbệnh thoái hóa như bệnh Alzheimer [1]. SD có thể gây tổn thương oxy hóa cho các tế bào thần kinh vùng đồi thị, gây rối loạn chức năng nhận thức và tạo ra những thay đổi về tâm trạng như lo lắng và trầm cảm [2]. Cistanche Deserticola là một dược liệu quý có thể dùng làm thuốc và thực phẩm ở Trung Quốc. Nó có tác dụng bổ thận và bổ sung khí, làm ẩm ruột thúc đẩy nhu động ruột và tăng cường dương. Chiết xuất chính của Cistanche Deserticola, glycoside của cistanche (GC), có tác dụng chống oxy hóa, chống apoptotic, bảo vệ gan và bảo vệ thần kinh [3]. Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy GC có thể cải thiện chức năng học tập và nhận thức của chuột SAMP8 bằng cách đóng vai trò chống oxy hóa và chống apoptotic [4].

Các nghiên cứu liên quan đã chỉ ra rằng rối loạn chức năng nhận thức do SD gây ra có liên quan chặt chẽ đến độ dẻo của khớp thần kinh [5]. Tuy nhiên, có rất ít báo cáo về cơ chế mà GC điều chỉnh độ dẻo của khớp thần kinh và cải thiện khả năng học tập, suy giảm trí nhớ cũng như suy giảm nhận thức ở chuột do thiếu ngủ. Do đó, nghiên cứu này nhằm mục đích khám phá liệu GC có ảnh hưởng đến độ dẻo của khớp thần kinh hay không bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện của các dấu hiệu liên quan đến khớp thần kinh, từ đó cải thiện chức năng học tập và nhận thức của chuột với các mô hình thiếu ngủ, đồng thời cung cấp các ý tưởng và kế hoạch điều trị mới cho GC để điều trị việc học tập và nhận thức. suy giảm do rối loạn giấc ngủ.

1 Vật liệu và phương pháp

1.1 Động vật thí nghiệm

Chuột Wistar đực từ 6 đến 8 tuần tuổi, nặng 280 đến 300 g, được mua từ Sibeifu Bắc Kinh, có giấy phép sản xuất động vật [SCXK (Bắc Kinh) 2019-0010]. Tất cả các động vật được giữ trong Trung tâm Thí nghiệm Động vật của Trường Cao đẳng Y tế Baotou trong các điều kiện sau: nhiệt độ (24 ± 1) độ, độ ẩm 50% đến 55%, 12 giờ sáng và 12 giờ tối, không hạn chế thức ăn và nước uống. Thí nghiệm này đã được ủy ban đạo đức trường học phê duyệt [Baoyi Lunshen 2022 số (63)].

1. 2 Thuốc thử và dụng cụ chính

Tổng số glycoside của Cistanche Deserticola được mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Thành Đô Xiyu Cistanche (số lô: KSM20220609011); Viên Estazolam được mua từ Tập đoàn Dược phẩm CSPC Ouyi Pharmaceutical (số lô: 044220343); đệm nạp protein (P1015), đệm ly giải RIPA (R0010), dung dịch phát quang hóa học (PE0010), v.v. đều được mua từ Beijing Solebao; chất mật độ sau synap trong kháng thể 95 (PSD-95) (AB192757) và kháng thể synolinehysin (SYN) (ab32127) đã được mua từ Abcam, Công ty Hoa Kỳ; yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ não (BDNF) (48503-2) và -actin (52901) được mua từ Công ty SAB, Hoa Kỳ; Kháng thể thứ cấp IgG kháng thỏ (SA{14}}) được mua từ Công ty Proteintech, Hoa Kỳ; chuột melatonin (MT) và Bộ nghiên cứu khoa học ELISA (MM{15}}R1) đã được mua từ Công ty TNHH Công nghiệp xét nghiệm miễn dịch enzyme Giang Tô. Máy cắt paraffin (Leica, Đức); kính hiển vi quang học (Leica, Đức);

Mê cung nước Morris, hộp thử nghiệm ngoài hiện trường (Thượng Hải Xinruan); thiết bị điện di dọc (Công ty Liuyi Bắc Kinh); máy lắc khử màu (Công ty Liuyi Bắc Kinh); hệ thống phân tích hình ảnh protein (Công nghệ Tanon Thượng Hải); thiết bị PCR định lượng huỳnh quang (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1.3 Phương pháp thí nghiệm

1.3.1 Phân nhóm động vật và quản lý thuốc

50 chuột Wistar đực được chia ngẫu nhiên thành nhóm đối chứng trống (Nhóm kiểm soát), nhóm kiểm soát nền tảng (Kiểm soát nền tảng, nhóm PC), nhóm mô hình (Nhóm mô hình), tổng số glycoside của nhóm Cistanche Deserticola (nhóm GCs) , 50 mg/kg) và nhóm estazolin (Nhóm Est, 0,54 mg/kg), với 10 con chuột trong mỗi nhóm. Nhóm Đối chứng và nhóm PC được truyền nước muối 0,9%. Tất cả các nhóm được cho ăn vào lúc 7 giờ sáng hàng ngày sau khi quá trình mô hình bắt đầu và quá trình này kéo dài trong 21 ngày.

1.3. 2. Xây dựng mô hình động vật thiếu ngủ

Mô hình thiếu ngủ được thiết lập bằng phương pháp môi trường nước đa nền tảng đã được sửa đổi [6]. Thiết bị thí nghiệm là một bể chứa nước bằng nhựa polyetylen hình chữ nhật có kích thước 130 cm × 50 cm × 45 cm. Một cái bục nhỏ có đường kính 5 cm và cao 20 cm được đặt trong bể nước. Nền của nhóm PC có đường kính 10 cm và cao 20 cm. Bể chứa nước được đổ đầy nước đến độ sâu khoảng 18 cm và nhiệt độ nước được duy trì ở mức (20 ± 1) độ. Một tuần trước khi bắt đầu thí nghiệm, chuột được đặt trong hộp cấm ngủ mỗi ngày trong 60 phút để làm quen với môi trường. Sau khi mô hình được thành lập, ngoại trừ nhóm Control, chuột của mỗi nhóm được đặt trên bục nhỏ vào thời gian từ 8 giờ sáng đến 8 giờ tối hàng ngày để không ngủ trong 21 ngày liên tục.

Tất cả chuột đều có quyền truy cập miễn phí thức ăn và nước uống và di chuyển tự do trên nền tảng. Chu kỳ sáng tối mỗi ngày là 12 giờ.

1. 3. 3 Thí nghiệm mê cung nước Morris

Mê cung nước Morris được chia thành 4 khu vực, chứa đầy nước và nền tảng được đặt ở góc phần tư thứ 4. Mặt nước cao hơn mặt sàn khoảng 2cm. Melanin ăn được ở cấp thực phẩm được thêm vào nước và nhiệt độ nước được duy trì ở mức (25 ± 1). (1) Thí nghiệm định vị điều hướng: Chọn trung tâm của từng khu vực và thả chuột nhẹ nhàng xuống nước. Họ được phép tự do khám phá. Thời gian để chuột tìm thấy bệ mục tiêu trong vòng 60 giây đã được ghi lại. Những con chuột không tìm thấy bệ sẽ được dẫn đến bệ và ở lại trong 20 giây. Việc đào tạo được tiếp tục trong 5 ngày. (2) Thử nghiệm khám phá không gian: Vào ngày thứ 6, bệ được dỡ bỏ và chuột được đặt trong nước từ tâm góc phần tư thứ 2 dựa vào tường. Số lần chuột đi qua bục trong vòng 120 giây và thời gian chúng ở góc phần tư thứ 4 đã được ghi lại.

1. 3.4 Thí nghiệm ngoài đồng

Một hộp thí nghiệm 100 cm × 100 cm × 50 cm đã được sử dụng và đáy hộp được chia thành 9 lưới. Mỗi nhóm chuột được đưa trước vào phòng thí nghiệm ngoài trời để thích nghi với môi trường trong nhà trong 60 phút. Khi bắt đầu thí nghiệm, chuột thử nghiệm lần lượt được đặt vào các góc cố định của hộp thí nghiệm ngoài trời và số lần đứng, khoảng cách di chuyển và thời gian tĩnh của chuột trong vòng 5 phút được ghi lại bằng phần mềm phân tích hành vi. Môi trường được yêu cầu phải yên tĩnh trong quá trình thí nghiệm và thiết bị thí nghiệm được lau lần lượt bằng nước và cồn giữa hai thí nghiệm để tránh mùi của con chuột đầu tiên ảnh hưởng đến khả năng phán đoán hành vi của con chuột tiếp theo.

1. 3. 5 Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA)

Phát hiện nồng độ MT huyết thanh ở chuột Chuột được gây mê bằng cách tiêm trong phúc mạc và 5 mL máu được thu thập từ động mạch chủ bụng. Sau khi đợi 30 phút ở nhiệt độ phòng, máu được ly tâm để thu được huyết thanh. 40 μL chất pha loãng mẫu được thêm vào từng giếng, sau đó thêm 10 μL mẫu cần kiểm tra. Sau khi niêm phong bằng màng niêm phong, tấm được ủ ở 37 độ trong 30 phút. Rửa 5 lần, thêm 50 µL dung dịch ghi nhãn enzyme và đậy kín đĩa bằng màng dán và ủ ở 37 độ trong 30 phút. Rửa 5 lần, sau đó lần lượt thêm dung dịch tạo màu và dung dịch chấm dứt phản ứng. Giá trị OD của mỗi giếng được đo bằng máy dán nhãn enzyme ở bước sóng 450 nm.

1. 3. 6 Nhuộm Nissl

Ba con chuột được chọn từ mỗi nhóm và mô não được loại bỏ bằng cách chặt đầu và cố định bằng dung dịch polyoxyetylen 4%. Mô được khử nước, ngâm trong dung dịch sáp, nhúng và cắt bằng phương pháp thông thường. Các lát cắt được giữ với độ dày 5 μm, rửa sạch bằng PBS, nhuộm màu xanh lam 0,1% toluidine trong 0,5 giờ, phân biệt bằng cồn 95%, khử nước bằng cồn 100%, được làm trong suốt bằng xylen và bịt kín bằng keo trung tính. Những thay đổi về hình thái và số lượng tế bào thần kinh ở vùng CA1 của đồi hải mã chuột được quan sát dưới kính hiển vi và hình ảnh được thu thập.

1. 3. 7 Thí nghiệm Western blot

Bốn con chuột được chọn từ mỗi nhóm và vùng hải mã được phân lập bằng cách chặt đầu. Mô hồi hải mã được trộn với dung dịch đệm ly giải RIP A trong môi trường tắm nước đá và mô được ly tâm để thu được chất nổi phía trên. Nồng độ protein được phát hiện bằng phương pháp BCA. 20 mg protein đã được thêm vào với chất đệm nạp protein để điện di. Sau khi quá trình điện di protein hoàn tất, màng được chuyển ở dòng không đổi 300 mA, được chặn bằng sữa bột gầy 5%, kháng thể chính được ủ ở 4 độ qua đêm và kháng thể thứ cấp được ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Sau khi sử dụng dung dịch hiện màu, các dải protein được phân tích thống kê bằng hệ thống phân tích hình ảnh phát quang hóa.

1. 3. 8 Thí nghiệm RT-PCR

Ba con chuột được chọn từ mỗi nhóm để chuẩn bị đồng nhất mô hồi hải mã. Tổng số RNA trong dịch mô được chiết xuất bằng phương pháp Trizol và đo nồng độ. Một bộ tổng hợp cDNA nhịn ăn đã được sử dụng để sao chép ngược và phản ứng khuếch đại định lượng huỳnh quang được thực hiện bằng cách sử dụng bộ định lượng huỳnh quang để phát hiện mức độ biểu hiện tương đối của mRNA protein liên quan đến khớp thần kinh. Kết quả được phân tích bằng cách sử dụng 2-ΔΔCt. Trình tự mồi được thể hiện trong Bảng 1.

Bảng 1 Trình tự mồi RT-PCR

1.4 Phương pháp thống kê

Các kết quả dữ liệu tuân theo phân phối chuẩn được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (x ± s) và phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm GraphPad Prism 9.5. Phân tích phương sai một chiều được sử dụng để so sánh giữa nhiều mẫu và P < 0.05 chỉ ra rằng sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.