Đánh giá viên aerogel canxi Alginate uống bằng miệng về sự thay đổi của hệ vi sinh vật đường ruột, chức năng gan và thận của chuột Wistar

Liên hệ: ali.ma@wecistanche.com

Mohammad AA Al-Najjar và cộng sự

trừu tượng

Nghiên cứu này đánh giá tác dụng của canxi alginate aerogel như một chất vận chuyển thuốc tiềm năng, trên gan vàchức năng thận, và trên hệ vi sinh vật đường ruột của chuột Wistar. Các nghiên cứu alginate aerogel được điều chế dưới dạng các hạt nano bằng kỹ thuật cắt tia, và chúng được đặc trưng về diện tích bề mặt cụ thể, hình thái bên ngoài và sự phân bố kích thước hạt. Đối với nghiên cứu in vivo, canxi alginate aerogel được dùng bằng đường uống, gan vàchức năng thậnđã được thử nghiệm trong một tuần và trong bốn tuần trong hai nghiên cứu khác nhau. Trong quá trình nghiên cứu in vivo ngắn hạn, các mẫu phân được thu thập để chiết xuất DNA của vi khuẩn, sau đó là phân tích trình tự gen 16S rRNA để phát hiện những thay đổi trong hệ vi sinh vật đường ruột. Kết quả cho thấy rằng aerogel alginate được điều chế có diện tích bề mặt riêng BET trung bình khoảng 540 m2 / g, với thể tích lỗ 7,4 cc / g và chiều rộng lỗ 30–50 nm. Nghiên cứu in vivo tiết lộ rằng các mức độ được nghiên cứuquả thậnvà men gan không vượt quá mức cao nhất của giới hạn bình thường. Nghiên cứu về hệ vi sinh vật đường ruột cho thấy các mô hình khác nhau; một số nhóm vi khuẩn, chẳng hạn như Clostridia và Bacteriodia, tăng lên trongaerogelvà tiếp tục tăng sau khi ngừng tập aerogel. Trong khi các nhóm khác như Erysipelotrichia và vi khuẩn Candidatus Sacha tăng lên trongaerogelđiều trị và sau đó giảm trở lại sau một tháng. Các thành viên của lớp Bacilli cho thấy một xu hướng duy nhất, đó là, sau khi là nhóm dồi dào nhất (63 phần trăm) vào thời điểm 0, mức độ phong phú tương đối của họ giảm đáng kể cho đến khi đạt <5 phần="" trăm;="" đó="" là="" trường="" hợp="" ngay="" cả="" sau="" khi="" ngừng="" điều="" trị="" bằng="">

Cistanchetubulosa ngăn cảnquả thậnbệnh, tác dụng phụ của cistanche, bấm vào.

Giới thiệu

AerogelThuật ngữ này được xuất hiện lần đầu tiên vào năm 1931 bởi Samuel Kistler, người đã định nghĩa chúng là những vật liệu giữ nguyên cấu trúc mạng và lỗ rỗng của chúng khi trao đổi chất lỏng lỗ rỗng của chúng với khí [1]. Sau 60 năm khám phá của họ,aerogelđược đề xuất cho các ứng dụng phân phối thuốc và y sinh do diện tích bề mặt bên trong lớn và cấu trúc lỗ rỗng [2]. Các tính năng nổi bật của lớp vật liệu này không chỉ cho phép tăng hiệu quả tải mà còn cải thiện tính khả dụng sinh học, độ ổn định và động học giải phóng của các phân tử được tải

Nghiên cứu trênaerogelđể sử dụng thuốc uống ban đầu tập trung vào việc sử dụng silicaaerogelvì tính linh hoạt và hóa học sol-gel nổi tiếng của chúng, cũng như khả năng tạo dẫn xuất [3]. Tuy nhiên, việc sử dụng silica aerogel trong các công thức dược phẩm được thiết kế để uống vẫn gây ra những lo ngại nhất định vì khả năng phân hủy sinh học hạn chế của chúng. Do đó, cần phát triển thêm một chất mang aerogel vừa tương thích sinh học vừa có thể phân hủy sinh học. Điều này có thể thực hiện được bằng cách sử dụng các vật liệu hữu cơ tự nhiên hoặc polyme phân hủy sinh học, chẳng hạn như alginate [4] axit hyaluronic [5], chitosan, cellulose [6] và protein [7].

Alginate (Alg), được chiết xuất từ ​​tảo nâu, là một chất đồng trùng hợp mạch thẳng bao gồm các monome ß -1, 4- axit D-mannuronic và axit -L-guluronic, là những đơn phân giống như khối đồng nhất hoặc không đồng nhất xen kẽ nhau . Alginate đã được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm vì nó không độc hại, rẻ tiền, có thể phân hủy sinh học và tương thích sinh học [8, 9]. Các cation đa hóa trị, chẳng hạn như Ca2 cộng, Ba2 cộng, hoặc Sr2 cộng, có thể tạo ra liên kết chéo ion của Alg, chuyển nó từ dạng hòa tan sang dạng không hòa tan (gel).

Alg đã được sử dụng rộng rãi trong các sản phẩm thực phẩm và như một chất phụ gia dược phẩm, chẳng hạn như chất tạo gel và chất phân hủy viên nén [10, 11]. Nó cũng đã được sử dụng trong các ứng dụng y sinh, bao gồm phân phối thuốc và kỹ thuật mô [12]. Giống như các chất xơ ăn được khác, Alg và các dẫn xuất oligomer của nó có khả năng chống lại sự tiêu hóa bởi các enzym nội sinh của con người. Tuy nhiên, nó có thể được tiêu hóa đáng kể bởi hệ vi sinh vật đường ruột của con người [13]. Mặc dù tầm quan trọng của nó, người ta vẫn biết rất ít về hệ vi sinh vật đường ruột chịu trách nhiệm cho sự phân hủy của Alg.

Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) đã tuyên bố về sự an toàn của axit alginic và các muối của nó, cũng như các sản phẩm lên men của chúng. Các thử nghiệm in vivo đối với sự hấp thu và bài tiết của dung dịch nước và huyền phù của axit alginic và muối của nó ở động vật cho thấy chúng không có khả năng bị hấp thu hoặc chuyển hóa bởi các enzym có trong đường tiêu hóa bất kể dạng sử dụng trong quá trình sử dụng. Tuy nhiên, chúng sẽ bị phân hủy một phần bởi quá trình lên men trong quá trình di chuyển qua ruột già do tác động của hệ vi sinh vật đường ruột kỵ khí, gây ra sự phình to của manh tràng được EFSA coi là một quá trình thích ứng liên quan đến liều lượng cao được thử nghiệm như phụ gia thực phẩm [14] . Tuy nhiên, không có nghiên cứu in vivo nào trước đây đã kiểm tra tác dụng của canxi alginate (Ca-Alg) ở dạng aerogel đối vớigan thận,hoặc cộng đồng vi khuẩn trong ruột.

Hệ vi sinh vật đường ruột là một thành phần thiết yếu của hệ tiêu hóa của con người, vì chúng giúp phân hủy thức ăn ăn vào, đặc biệt là những thức ăn mà cơ thể con người không có các enzym cần thiết [15, 16]. Hệ vi sinh vật đường ruột cũng có thể ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh bằng cách cạnh tranh với chúng về nguồn dinh dưỡng hoặc bằng cách sản xuất các chất hóa học để ức chế sự phát triển của chúng. Tuy nhiên, người ta đã chỉ ra rằng sự thoái hóa của các chất xơ tiêu hóa được ăn vào, chẳng hạn như Alg, xảy ra chủ yếu bởi vi khuẩn lên men trong ruột kết [17]. Các sản phẩm của quá trình này là các axit béo chuỗi ngắn (SCFA), có lợi cho tình trạng viêm ruột kết và hoạt động như chất chống ung thư. Brownlee và cộng sự. báo cáo rằng quá trình ủ bệnh của Alg và hệ vi sinh vật trong phân người đã chứng minh rằng hầu hết sự phân hủy Alg đi kèm với sự thay đổi trong hệ vi sinh vật đường ruột. Ngoài ra, việc ủ như vậy dẫn đến việc sản xuất SCFA và khí sau 24 giờ [17].

Nguyên liệu và phương pháp

Vật liệu

Muối natri axit alginic được cung cấp bởi BASF, Đức. Clorua vôi (CaCl2) được mua từ Th. Geyer GmbH & Co. KG, Đức. Carbon dioxide (độ tinh khiết 99,5%) được cung cấp bởi Praxair (Đức), ethanol 99,8% thu được từ Carl Roth (Đức). Tất cả các hóa chất được sử dụng như là nhận được. Bộ dụng cụ chẩn đoán thương mại được sử dụng để đo ALP và bộ dụng cụ creatinine được mua từ Biostsystems SA, Tây Ban Nha. Bộ cách ly MO BIO'S PowerMax SoilDNA được mua từ Phòng thí nghiệm MO BIO, Hoa Kỳ. Nước khử ion được sử dụng trong suốt quá trình nghiên cứu.

Phương pháp

Chuẩn bị các hạt aerogel.

Bước đầu tiên trong quá trình chuẩn bị các hạt aerogel là chuẩn bị dung dịch gốc; cho rằng bột natri alginat (Alg) đã được thêm vào nước cất ở nồng độ 1% w / w và được khuấy từ tính qua đêm ở nhiệt độ phòng. Để chuẩn bị các hạt hydrogel, phương pháp được mô tả bởi Preibisch et al. [18] đã được theo sau, sử dụng Máy cắt phản lực Loại S từ genia Lab, Braunschweig (Đức). Trong quá trình cắt tia, dung dịch alginat được phun ra qua một vòi phun (đường kính 350 μm) bằng không khí nén (1–3 bar) để tạo thành một tia (tốc độ dòng chảy khối lượng 1 g / s). Máy bay phản lực được cắt thành các hạt riêng biệt bằng một đĩa quay (40 dây với đường kính dây 100 μm của đĩa cắt, tỷ lệ hình trụ là 5). Sau khi đi qua đĩa, dung dịch polyme rơi xuống bể tạo gel với dung dịch CaCl2 5 g / L. Để tránh kết tụ các hạt gel, thể tích của bể tạo gel ít nhất gấp bốn lần tổng thể tích của dung dịch biopolyme đã xử lý và nội dung của bể được khuấy bằng thanh từ tính (60 vòng / phút). Khoảng cách giữa vòi phun và bể tạo gel được giữ ở mức 50–70 cm. Sau khi thu thập các hạt gel, tiếp tục khuấy trong 60 phút để đảm bảo gel hóa hoàn toàn và tránh kết tụ. Các hạt gel sau đó được tách ra khỏi bể gel hóa thông qua quá trình lọc và được tiến hành để trao đổi dung môi.

Trao đổi dung môi (nước thành etanol) được thực hiện theo từng bước trên các hạt thu được (30,60, 90, 100% v / v etanol). Để đảm bảo sự trao đổi hoàn toàn, tỷ trọng của chất lỏng ngâm sau bước trao đổi dung môi cuối cùng được đo bằng máy đo tỷ trọng (DMA4500, Anton PaarCompany, Austria). Mật độ sau đó được tính toán lại thành hàm lượng etanol. Các hạt alcolgel thu được cuối cùng được đóng gói vào giấy lọc, và được làm khô bằng CO2 siêu tới hạn trong nồi hấp ở nhiệt độ không đổi là 50C và áp suất 120 bar. Lưu lượng CO2 liên tục (20–80 g / phút) được thiết lập cho đến khi chiết xuất hoàn toàn etanol (2–4 giờ). Sau đó, khử áp suất chậm của nồi hấp (1-3 bar / phút) được thực hiện. Khi đã đạt đến áp suất xung quanh, nồi hấp được mở ra và các vi cầu aerogel chứa canxi alginat (sau đây được gọi là Ca-Alg) được thu thập và bảo quản trong các hộp kín ở điều kiện khô ráo.

Đặc tính của các hạt aerogel

diện tích bề mặt cụ thể của các hạt aerogel được đo bằng hấp phụ / giải hấp nitơ ở nhiệt độ thấp (BET) (Quantachrome Nova 3000e, Odelzhausen, Đức và Micromeritics TriStar II 3020, Đức). Trước khi đo, các mẫu được làm khô trong 20 điều kiện chân không (< 1="" mpa)="" at="">

Việc khảo sát hình thái bên ngoài của các hạt aerogel đã chuẩn bị được thực hiện thông qua phân tích bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) (Zeiss Supra VP55, Jena, Đức) ở điện áp gia tốc 3 kV và khoảng cách làm việc là 9. 0 - 9,4 mm. Các mẫu được tráng vàng (độ dày 10nm) trước khi chụp ảnh để giảm thiểu việc sạc và cải thiện độ tương phản của hình ảnh.

Phép đo phân bố kích thước hạt được thực hiện ba lần cho mỗi mẫu bao gồm khoảng 10, 000 hạt. Phân tích hình ảnh động được thực hiện bằng aCamsizer XT với mô-đun X-Jet (Retsch GmbH, Đức) với áp suất không khí ở 50 kPa.

Các nghiên cứu về chức năng gan, thận và hệ vi sinh vật đường ruột

Một nghiên cứu thử nghiệm đã được thực hiện trên một số lượng nhỏ động vật được chia thành các nhóm khác nhau để bao gồm bốn mức liều lượng của các chất điều trị. Nó được tiến hành trong một thời gian ngắn (1 tuần) để xác định liều lượng tối đa có thể của Ca-Alg aerogel mà không có ảnh hưởng lớn đến chức năng thận hoặc gan, và không có dấu hiệu của bệnh tật hoặc tử vong. Liều lượng được lựa chọn cẩn thận dựa trên LD50 qua đường miệng được báo cáo của alginate (hơn 5, 000 mg / kg thể trọng) [19]. Tuy nhiên, liều tối đa có thể đạt được khi động vật bị kích động tối thiểu là 2, 000 mg / Kg trọng lượng cơ thể.

Trong phần thứ hai của nghiên cứu, các con vật được tiếp xúc với liều lượng cố định trong hai tuần. Về sự biến đổi tuổi, trọng lượng và điều kiện chăn nuôi trong nghiên cứu này, các hướng dẫn của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) đã được tuân thủ (mã số 206). Tất cả các giao thức thử nghiệm đã được phê duyệt bởi Ủy ban Đạo đức (IRB, Số phê duyệt: 2019- PHA -12, đính kèm trong Tệp S1) của Đại học Tư thục Khoa học Ứng dụng (ASU), Jordan. Tất cả các nhân viên trong nhà động vật tại ASU đều được đào tạo kỹ lưỡng để theo dõi bất kỳ thay đổi nào có thể xảy ra đối với động vật do hậu quả của việc can thiệp. Cụ thể, họ theo dõi các thông số như thay đổi cân nặng, hành vi bất thường, xù lông, giảm khả năng vận động, tư thế cơ thể hoặc biểu hiện của các dấu hiệu chất lỏng cơ thể cụ thể. Trong trường hợp có bất kỳ thay đổi bất thường nghiêm trọng nào về tình trạng động vật, chúng được phép sử dụng quy trình điểm cuối nhân đạo đã được Ủy ban Đạo đức tại ASU phê duyệt. Vào cuối các thí nghiệm, những con chuột đã chết vì tẩy độc khi gây mê toàn thân bằng cách sử dụng 2,5% natri thiopental (Phòng thí nghiệm Abbott, North Point, Hồng Kông) ở 20 mg / kg tiêm tĩnh mạch.

Động vật

Trong cả nghiên cứu in vivo ngắn hạn và dài hạn, Chuột Wistar 10 tuần tuổi, khỏe mạnh với trọng lượng trung bình 240 ± 37 g được nuôi ở nhiệt độ 21–23 ˚C và độ ẩm 35% –70%. trong các phòng được kiểm soát, với chu kỳ 12 giờ sáng - 12 giờ tối. Chuột được xác định và đặt riêng lẻ trong lồng có mặt thoáng để dễ quan sát mà không làm ảnh hưởng đến hành vi của chúng. Băm gỗ được sử dụng làm giường. Chuột được cho ăn theo chế độ ăn thương mại (Local Sup plier, Jordan) và nước ngọt được cung cấp miễn phí.

Số lượng chuột mỗi nhóm trong các thí nghiệm khác nhau được chọn theo công trình đã xuất bản trước đó (ví dụ; [20–22]), và tùy thuộc vào các quy định nghiêm ngặt về "chăm sóc và sử dụng động vật" trong nước và quốc tế, trong đó nhấn mạnh đến việc giảm thiểu số lượng động vật được sử dụng trong các nghiên cứu. Các chương trình này bao gồm nhưng không giới hạn, "Chương trình chăm sóc và sử dụng động vật" tại Đại học California, Berkeley (https://acuc.berkeley.edu/about.html) và hướng dẫn của Na Uy về việc sử dụng động vật (https: // www.forskningsetikk.no/en/guidelines/ khoa học và công nghệ / đạo đức-hướng dẫn-cho-việc sử dụng-động-vật-trong-nghiên cứu /).

Thí điểm nghiên cứu in vivo (liều lặp lại 7 ngày)

Liều uống lặp lại trong thời gian một tuần đã được thực hiện để xác định liều aerogel tối đa có thể chứng minh được tính an toàn ở chuột Wistar. Ca-Alg aerogel được dùng bằng đường uống ở bốn mức liều 50, 100, 250 và 500 mg tương ứng với liều trung bình lần lượt là 200, 400,1000 và 2000 mg / Kg (trọng lượng cơ thể). Kết quả được so sánh với hai nhóm đối chứng dương tính được cung cấp 50 và 500 mg natri alginat nguyên sơ (Na-Alg) tương ứng với các mức liều trung bình tương ứng là 200 và 2000 mg / Kg thể trọng. Cuối cùng, tất cả các nhóm điều trị Ca-Alg aerogel và Na-Alg trước đó được chuyển sang nhóm đối chứng (giả dược). Nhóm thứ hai nhận được dung dịch đệm phosphat với liều lượng tương đương với liều lượng tối đa khi nó được sử dụng như một hệ thống phương tiện cho các chất thử nghiệm. Các nhóm đối chứng và điều trị cho nghiên cứu thí điểm bao gồm 4 con chuột / nhóm (hai con cái và hai con đực / nhóm). Bột rắn của Ca-Alg aerogel và Na-Alg tương ứng được lơ lửng trong dung dịch đệm phosphat (pH 7,4) và trộn đều trực tiếp trước khi uống vì chuột không chịu ăn chúng ở trạng thái khô. Đối với tất cả các nhóm, việc dùng thuốc cho chuột được bắt đầu vào cùng một thời điểm mỗi ngày bằng cách sử dụng thiết bị đo miệng.

Nghiên cứu tiếp xúc in vivo dài hạn (nghiên cứu liều lặp lại trong 15 ngày)

Dựa trên các kết quả từ phần trước, liều 250 mg Ca-Alg aerogel đã được chọn để đánh giá thêm trong nghiên cứu phơi nhiễm lâu dài (15 ngày) Chuột Wistar được quan sát thấy có bất kỳ tác dụng nào tức thời hoặc chậm về thận và / hoặc gan. các hiệu ứng có thể xảy ra khi tiếp xúc với Ca-Alg aerogel hoặc khi tiếp xúc với Na-Alg tương ứng. của. Đối với mỗi chất được thử nghiệm, ba nhóm động vật được sử dụng bao gồm một nhóm kiểm soát, điều trị và một nhóm vệ tinh. Nhóm đối chứng bao gồm 6 con chuột Wistar / nhóm (3 con đực và 3 con cái), trong khi nhóm xử lý và vệ tinh bao gồm 10 con chuột Wistar / nhóm (5 con đực và 5 con cái). Những con chuột Wistar trong các nhóm điều trị nhận được liều hàng ngày 250 mg chất thử nghiệm (Ca-Alg aerogel hoặc Na-Alg) trong 15 ngày, và chúng bị hy sinh vào ngày 16. Trong khi các nhóm vệ tinh được điều trị trong cùng một thời gian. như đối với các nhóm điều trị, nhưng được theo dõi thêm 15 ngày sau khi điều trị, và họ đã hy sinh vào ngày thứ 30.

Điều đáng nói là không thể tiến hành song song hai nghiên cứu Ca-Alg aerogel và Na-Alg. Vì lý do này, không thuận tiện khi sử dụng một nhóm điều khiển cho cả hai. Các nhóm đối chứng này chỉ được uống đệm phosphat trong 15 ngày và sau đó được theo dõi thêm 14 ngày. Là một thử nghiệm ngắn hạn, bột rắn của Ca-Alg aerogel và Na-Alg cũng được lơ lửng trong dung dịch đệm phosphat (pH 7,4) và trộn đều trực tiếp trước khi uống. Đối với tất cả các nhóm, việc sử dụng cho chuột được bắt đầu vào cùng một thời điểm mỗi ngày bằng cách sử dụng thiết bị đo miệng.

Quan sát hành vi và lâm sàng

Theo hướng dẫn 407 của OECD, động vật được theo dõi hàng ngày về bất kỳ dấu hiệu lâm sàng bất thường hoặc thay đổi hành vi nào trong suốt thời gian nghiên cứu, đặc biệt chú ý trong bốn giờ đầu tiên sau khi sử dụng chất thử nghiệm. Các động vật trong nhóm vệ tinh và nhóm đối chứng được quan sát thêm trong 15 ngày nữa mà không cần điều trị. Nhóm vệ tinh cho phép phát hiện bất kỳ dấu hiệu lâm sàng nào xuất hiện muộn cho thấy tác động của gan và / hoặc thận thông qua việc đo nồng độ Alkaline Phosphatase (ALP) và creatinine.

Hóa sinh huyết thanh và phân tích phân

Tây ban nha. Các mẫu máu được thu thập từ các tĩnh mạch xoang quỹ đạo của chuột Wistar, sau đó được sử dụng để tách huyết thanh. Huyết thanh thu thập được từ các mẫu sau đó được chuyển vào các ống Eppendorf vô trùng và được bảo quản trong tủ đông lạnh sâu để kiểm tra thêm các thông số sinh hóa. Các mẫu phân cũng được thu thập mỗi ngày thứ hai để điều tra sự thay đổi cấu trúc quần xã vi sinh vật. Phân được gom lại trong các ống 15 ml có nắp vặn vô trùng sạch sẽ và được giữ trực tiếp ở -20 ˚C cho đến khi tất cả các mẫu được thu thập. Đối với nghiên cứu liều lặp lại 15- ngày, chỉ các mẫu máu được thu thập hàng tuần để đo mức Alkaline Phosphatase (ALP) và creatinine, vào ngày 0, ngày 7, ngày 14, ngày 21 và ngày 30 (ngày 21 và ngày 30 chỉ áp dụng cho nhóm đối chứng và nhóm vệ tinh).

Phân tích cộng đồng vi sinh vật đường ruột

Tách chiết DNA từ các mẫu phân đã thu thập được thực hiện bằng Bộ phân lập DNA MO BIO'S PowerMaxSoil (Phòng thí nghiệm MO BIO, Hoa Kỳ), theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, quá trình tinh chế và giải trình tự DNA bộ gen (gDNA) được tiến hành bằng cách sử dụng Mr. DNA Lab (Molecular Research LP, USA). Việc khuếch đại PCR của gen 16S rRNA và giải trình tự tiếp theo của nó được thực hiện bằng Illumina. Các mồi PCR vùng biến đổi V4 của gen 16SrRNA mod ill27F (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG) / ill519R và mod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) có mã vạch trên mồi phía trước được sử dụng trong 30 chu kỳ bằng HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, USA). Sau khi khuếch đại, các sản phẩm PCR được kiểm tra trong gel agarose 2% để xác định mức độ thành công của quá trình khuếch đại và cường độ tương đối của các dải.

Sau đó, sản phẩm PCR tổng hợp và tinh khiết được sử dụng để chuẩn bị thư viện DNA Illumina. Giải trình tự được thực hiện với MR DNA trên phương pháp giải trình tự vi sinh vật (MiSeq) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dữ liệu theo trình tự được xử lý bằng đường ống phân tích DNA MR. Tóm lại, các trình tự đã được nối với nhau, sau đó bị cạn kiệt mã vạch, sau đó, các trình tự <150 bpas="" cũng="" như="" các="" trình="" tự="" có="" lệnh="" gọi="" cơ="" sở="" không="" rõ="" ràng="" sẽ="" bị="" loại="" bỏ.="" các="" chuỗi="" đã="" được="" ký="" hiệu="" và="" các="" đơn="" vị="" phân="" loại="" hoạt="" động="" (out)="" được="" tạo="" ra="" và="" các="" chimeras="" bị="" loại="" bỏ.="" các="" otu="" được="" xác="" định="" bằng="" cách="" phân="" nhóm="" ở="" độ="" phân="" kỳ="" 3="" phần="" trăm="" (tương="" tự="" 97="" phần="" trăm).="" các="" otu="" cuối="" cùng="" được="" phân="" loại="" theo="" phương="" pháp="" phân="" loại="" bằng="" blastn="" dựa="" trên="" cơ="" sở="" dữ="" liệu="" được="" quản="" lý="" có="" nguồn="" gốc="" từ="" rdp-ii="" và="" ncbi.="" một="" gói="" các="" phân="" tích="" thống="" kê="" khác="" nhau="" có="" trong="" phần="" mềm="" "r"="" đã="" được="" sử="" dụng="" để="" phân="" nhóm="" theo="" thứ="" bậc="" (phiên="" bản="" 3.5.1,="" gói="" thuần="">