Nồng độ Iopromide cao gây ra quá trình chết và tự động trong tế bào thận phôi của con người thông qua việc kích hoạt một con đường căng thẳng tế bào phụ thuộc ROS
Mar 24, 2022
Trừu tượng.Việc sử dụng phương tiện cản quang có chứa i-ốt có thể làm giảmchức năng thận. Tuy nhiên, không có báo cáo nào đề cập đến độc tính trên thận của liều cao thuốc cản quang có i-ốt trong bình thườngquả thậntế bào và các cơ chế phân tử liên kết của nó. Vật liệu và Phương pháp: Sự tăng sinh tế bào được đánh giá bằng xét nghiệm MTT. Sự chết của tế bào được đánh giá bằng cách kiểm tra các thay đổi hình thái và xét nghiệm TUNEL. Autophagy được phát hiện thông qua nhuộm màu cam acridine và nhuộm lysotracker. Sản xuất oxy phản ứng của các loài và hoạt động AKT kinase đã được kiểm tra. Kết quả: loperamide gây chết tế bào và kích hoạt quá trình apoptosis và autophagy ở tế bào HEK 293. Khả năng tồn tại của tế bào được phục hồi đáng kể khi có chất ức chế pan-caspase hoặc chất thu hồi ROS, N-acetyl-L-cysteine. Hoạt động của KT kinase được tìm thấy bị giảm trong các tế bào HEK 293 được xử lý bằng iopromide. Kết luận: Nồng độ iopromide cao gây ra tổn thương tế bào, apoptosis và autophagy thông qua các con đường gây căng thẳng tế bào kích hoạt AKT và ROS điều hòa trong các tế bào HEK 293.
CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN CHỨC NĂNG KIDNEY / RENAL
Roentgen phát hiện ra tia X vào cuối thế kỷ 19, sau đó là sự ra đời của phương tiện tương phản chứa i-ốt (ICCM) vào đầu thế kỷ 20 *, mở ra một lĩnh vực nghiên cứu mới trong khoa học y tế ({{ 4}}). Các chất cản quang có chứa iốt được đưa vào cơ thể con người qua các tĩnh mạch và được sử dụng để kiểm tra chẩn đoán X quang của hệ tiết niệu, tim, hệ thống não tủy và mạch máu ở các bộ phận khác nhau của cơ thể. ICCM tăng cường độ tương phản giữa mô bình thường và tổn thương, cung cấp thông tin về các đặc điểm hình thái của tổn thương, cải thiện độ nhạy của việc khám và độ chính xác của chẩn đoán. Tác dụng tăng cường hình ảnh của chất tương phản làm cho nhiều mô và tổn thương tế bào có thể nhìn thấy được (5-8). Cơ chế dược lý chính là các phân tử i-ốt trong chất cản quang chứa i-ốt hấp thụ năng lượng tia X, làm cho các phân tử i-ốt phát huy tác dụng che chắn tia X đặc biệt. Do đó, một hình ảnh mật độ cao màu trắng xuất hiện trên X-quangphim, do đó cung cấp sự tăng cường mô chứa máu trong hình ảnh (3,5,9,10).
Các chất cản quang chứa iốt được phân loại theo cấu trúc hóa học, độ thẩm thấu và vị trí tiêm. Dựa trên cấu trúc hóa học, chất cản quang chứa i-ốt được chia thành bốn loại: cấu trúc monome ion, cấu trúc dimer ion, cấu trúc monome không ion và cấu trúc dimer không ion. Dựa trên độ thẩm thấu, chất cản quang chứa i-ốt được chia thành ba loại: phương tiện tương phản osmolar cao (HOCM), phương tiện tương phản osmolar thấp (LOCM) và phương tiện tương phản iso-osmolar (IOCM). Dựa trên vị trí tiêm, chất cản quang chứa i-ốt được chia thành hai loại: chất cản quang nội mạch và chất cản quang dưới nhện (1). Nói chung, chất cản quang không chứa iốt ion thể hiện độ thẩm thấu thấp hơn chất cản quang chứa iốt ion. Ngoài ra, các chất cản quang không chứa iốt ion ít độc hơn và gây ra các tác dụng dị ứng (11, 12). Tiêm ICCM vào khoang dưới nhện phải thể hiện độc tính thần kinh thấp và độ thẩm thấu thấp (13,14).
CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN BỆNH KIDNEY / RENAL
Phản ứng có hại của thuốc (ADR) của chất cản quang chứa iốt bao gồm phản ứng dị ứng và phản ứng hóa học. Các triệu chứng chính của phản ứng dị ứng là sốt, buồn nôn, nôn, chóng mặt, phát ban trên da, ngứa, hắt hơi và nghẹt mũi (4,11,12). Sẩn, mày đay, ớn lạnh, tức ngực, sốc, ngừng tim phổi và tử vong có thể xảy ra trong trường hợp phản ứng dị ứng nghiêm trọng (8, 11,12). Các phản ứng có hại và tỷ lệ tử vong của ICCM không ion nội mạch tương ứng là khoảng 2 đến 7 phần nghìn và 2 đến 9 phần triệu (15-23). Các phản ứng hóa học có hại chủ yếu dẫn đến bệnh thận do thuốc cản quang (CIN). CIN là sự suy giảm củachức năng thậnvà trở nên tồi tệ hơnchức năng thậnsau khi sử dụng các chất cản quang có chứa i-ốt. Cơ chế bệnh lý có thể bao gồm co mạch,thậnthay đổi lưu lượng máu hoặc độc tính trực tiếp đối vớithậntế bào hình ống (15-27). Năm 2006, Lameire et al. chỉ ra rằng CIN gây ra các tác động độc hại trực tiếp lênthậntế bào hình ống hoặc tình trạng thiếu oxy trongthậntủy (4,28). Những nguyên nhân chính củathậnthiếu oxy tủy bao gồm giảm lưu lượng máu, giảm vận chuyển oxy và tăng tiêu thụ oxy. Những yếu tố này có thể liên quan đến sự gia tăng áp suất thẩm thấu, độ nhớt và cảm ứng của prostaglandin E2 bởi ICCM (4,28).Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng môi trường tương phản thẩm thấu thấp hoặc đẳng áp ở nồng độ trên 75 mg I / ml (cao gấp sáu lần so với nồng độ liều bình thường) có thể ức chế sự tăng sinh tế bào và gây chết tế bào ởquả thậnô (KRK 52- E, LLC-PK1, HKCS, HK -2). Các loại tế bào chết bao gồm apoptosis và autophagy (29-35). Tuy nhiên, các cơ chế chi tiết vẫn chưa rõ ràng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu các cơ chế phân tử, bao gồm tổn thương tế bào, quá trình chết theo chương trình tự chết (apoptosis) và tự động chết (autophagy), gây ra bởi iopromide, một LOCM, trong các tế bào HEK 293.
Từ khóa:Iopromide; thận phôi người 293 tế bào; sự chết tế bào; các loại oxy phản ứng; quả thận; thận
Nguyên liệu và phương pháp
Dòng tế bào và nuôi cấy. Phôi thai con ngườiquả thận(HEK) Dòng tế bào 293 được mua từ Trung tâm Nghiên cứu và Thu thập Bioresource (Tân Trúc, Đài Loan, Trung Hoa Dân Quốc). Tế bào được duy trì trong môi trường Eagle đã sửa đổi (DMEM) của Dulbecco được bổ sung 10% huyết thanh bò thai ở 37C trong tủ ấm với 5% thuốc thử và hóa chất CO. Iopromide (Ultravist) được lấy từ Tiến sĩ Yuh-Feng Tsai thuộc Khoa X quang chẩn đoán, Bệnh viện Shin Kong Wu Ho Su Memorial. Ngoại trừ trường hợp được chỉ định, thuốc thử hóa học được mua từ Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, Hoa Kỳ).Hình thái và khả năng sống của tế bào. Tế bào HEK 293 (0. 8 × 1 0 4 tế bào / giếng) được nuôi trong 96 đĩa giếng trong 24 giờ và được xử lý với các nồng độ khác nhau (0,25,50,100 và 200 mg / ml) của iopromide trong 24 hoặc 48 giờ. Hình thái tế bào được kiểm tra để đánh giá quá trình chết rụng hoặc tự chết bằng kính hiển vi ánh sáng ở độ phóng đại 200x (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Đức). Khả năng sống của tế bào được đánh giá bằng cách sử dụng xét nghiệm MTT (thiazolyl xanh tetrazolium bromide) như đã mô tả trước đây (36). Trong thời gian ngắn, các tế bào được trộn với MTT trong 4 giờ. Độ hấp thụ ở bước sóng 570 nm được đo bằng đầu đọc vi tấm đa chế độ SpectraMax iD3 (Molecular Devices Ltd., San Jose, CA, USA). Phần trăm khả năng sống sót của tế bào được tính bằng cách đặt nhóm đối chứng chưa được xử lý thành 100 phần trăm.
Xét nghiệm ghi nhãn đầu cuối deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end (TUNEL). Để phát hiện đứt gãy DNA, người ta đã sử dụng Bộ phát hiện tế bào chết tại chỗ (Roche, Mannheim. Đức) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, tế bào HEK 293 được gieo mầm trong 24 giờ sau đó được xử lý với iopromide 50 mgI / ml trong 48 giờ nữa. Tế bào được cố định và nhuộm bằng đầu dò fluorescein. Các tế bào dương tính với TUNEL được phân tích bằng máy đo tế bào hình ảnh nâng cao NucleoCounter NC -3000 (ChemoMetee A / S, Allerod, Đan Mạch). Cường độ huỳnh quang tương đối được tính toán bằng cách sử dụng tỷ lệ giữa giá trị trung bình của cường độ huỳnh quang của mẫu so với của các tế bào đối chứng không được xử lý. Cường độ huỳnh quang tương đối được biểu thị bằng sự thay đổi lần lượt (37).Xét nghiệm hoạt động caspase 3/7 và caspase 9. Để xác định những thay đổi trong hoạt tính của enzym caspase, FAM FLICA Caspases -3 / 7 Assay Kit và FAM FLICAw Caspases -9 Assay Kit (MyBioSource, San Diego, CA, USA) đã được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, tế bào HEK 293 được cấy vào 6- đĩa giếng ở mật độ 1 × 106 tế bào / giếng trong 24 giờ và được xử lý bằng iopromide (50 mglI / ml hoặc 100 mglI / ml) trong 48 giờ nữa. Các mẫu được đánh giá như mô tả trước đây (36, 37) và được phân tích bằng máy đo tế bào hình ảnh nâng cao NucleoCounter NC -3000 (ChemoMetec A / S).
CISTANCHE SẼ CẢI THIỆN KIDNEY / RENAL THẤT BẠI
Nhuộm acridine da cam (AO). AO được sử dụng để kiểm tra xem các bào quan có tính axit (AVO) có được hình thành trong iopromide hay khôngtế bào được xử lý. Tóm lại, tế bào HEK 293 được gieo mầm trong 24 giờ, sau đó điều trị bằng iopromide (50 mgl / ml) trong 48 giờ nữa. Các mẫu đã được chuẩn bị như đã mô tả trước đây (37,38). Cường độ huỳnh quang đỏ được đo và phân tích bằng máy đo tế bào hình ảnh nâng cao NucleoCounter * NC -3000 (ChemoMetec A / S). Màu đỏ tươi có huỳnh quang thể hiện sự hình thành các không bào tự thực có tính axit, Cường độ huỳnh quang tương đối được tính toán bằng cách sử dụng tỷ lệ giữa giá trị trung bình của cường độ huỳnh quang của mẫu so với của các tế bào đối chứng không được xử lý. Cường độ huỳnh quang tương đối được biểu thị bằng sự thay đổi nếp gấp.
Nhuộm màu đỏ LysoTracker. Tế bào EK 293 được xử lý với 50 mgl / ml iopromide trong 48 giờ, và các mẫu được chuẩn bị như mô tả trước đây (37,38). Cường độ huỳnh quang được đo và phân tích bằng máy đo tế bào hình ảnh nâng cao NucleoCounter NC -3000 (ChemoMetec A / S). Màu đỏ tươi huỳnh quang thể hiện các bào quan có tính axit trong tế bào. Cường độ huỳnh quang tương đối được tính toán bằng cách sử dụng tỷ lệ giữa giá trị trung bình của cường độ huỳnh quang của mẫu so với của các tế bào đối chứng không được xử lý. Cường độ huỳnh quang tương đối được biểu thị bằng sự thay đổi nếp gấp.
Phát hiện sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS) Để phát hiện tác động của iopromide đối với việc sản xuất ROS, các tế bào HEK 293 đã được xử lý với iopromide 50 mgl / ml trong 24 giờ. Các mẫu đã được chuẩn bị như mô tả trước đây （37,38）. Tóm lại, 50 μM CM-H5DCFDA (Chỉ báo ứng suất oxy hóa chung) (Abcam, Cambridge, Vương quốc Anh) đã được thêm vào và các tế bào được ủ trong 30 phút ở 37 độ C. Cường độ huỳnh quang của tế bào được đo bằng NucleoCounter NC {{10 }} n máy đo tế bào hình ảnh nâng cao (ChemoMetec A / S).
Thử nghiệm hoạt tính AKT kinase in vitro. Để xác định những thay đổi trong hoạt động AKT kinase, Bộ xét nghiệm AKT Kinase (Công nghệ tín hiệu tế bào, Beverly, MA, Hoa Kỳ) đã được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tế bào HEK 293 (2 × 1 0 6 tế bào / đĩa) được gieo vào đĩa 10 cm trong 24 giờ và được xử lý bằng iopromide 50 hoặc 100 mgI / ml trong 24 giờ. Tế bào được thu hoạch và xử lý như đã mô tả trước đây (39). Tóm lại, 200 mg protein từ mỗi mẫu được tạo kết tủa miễn dịch với 2 mg kháng thể kháng AKT qua đêm. Các chất kết tủa miễn dịch AKT được trộn với glycogen synthase kinase -3 / chất nền trong 30 phút ở 30 độ. Các mẫu được áp dụng cho 10 phần trăm SDS-PAGE và cường độ tương đối của phospho-GSK -3 a / (Ser219) được xác định so với đối chứng không được xử lý. Phân tích thống kê. Dữ liệu thu được từ ít nhất ba thí nghiệm độc lập và được biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Sự khác biệt thống kê được đánh giá bằng cách sử dụng thử nghiệm t của Student so với nhóm đối chứng không được xử lý. Giá trị p nhỏ hơn 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê (37).
Kết quả
cung cấp sự tăng sinh tế bào HEK 293 bị ức chế đáng kể. Để khảo sát ảnh hưởng của iopromide đối với sự tăng sinh tế bào, các tế bào HEK 293 đã được xử lý bằng iopromide 0, 25,50,100 và 200 mgI / ml trong 24 (Hình 1A) hoặc 48 giờ (Hình 1B). Khả năng sống của tế bào được đo bằng xét nghiệm MTT. Nồng độ ức chế nửa tối đa (ICso) lần lượt là 187 ± 3,45 mgl / ml và 53,10 ± 1,87 mgl / ml ở 24 và 48 giờ điều trị iopromide (Hình 1). Kết quả của chúng tôi cho thấy iopromide ức chế sự tăng sinh tế bào. Ngoài ra, sự thay đổi hình thái trong tế bào HEK 293 được quan sát thấy khi tế bào được điều trị bằng iopromide ở nồng độ cao hơn 50 mgI / ml trong 48 giờ (Hình 2A). Một số tế bào co lại và đạt được hình dạng tròn, cho thấy rằng các tế bào có thể đã trải qua quá trình apoptosis. Trong khi đó, một số tế bào hiển thị không bào, điều này ngụ ý rằng các tế bào có thể đã trải qua quá trình tự động (Hình 2B).
hứa hẹn gây ra cái chết của tế bào. Để điều tra xem liệu có phải do iopromide gây ra cái chết của tế bào hay không, chúng tôi đã phát hiện ra các đứt gãy DNA trong các tế bào HEK 293 được xử lý iopromide bằng cách sử dụng xét nghiệm TUNEL. Cường độ huỳnh quang TUNEL tương đối tăng lên trong các tế bào HEK 293 được xử lý bằng iopromide, do đó cho thấy sự hiện diện của một số lượng lớn các tế bào apoptotic (Hình 3A và B). Caspase là chất trung gian quan trọng của quá trình apoptosis. Trong quá trình apoptosis, các caspase được kích hoạt và bắt đầu một chuỗi các hoạt động xúc tác. Các hoạt động của enzym Caspase được xác định trong các tế bào HEK 293 được xử lý với 50 hoặc 100 mgI / ml iopromide trong 48 giờ bằng bộ dụng cụ xét nghiệm caspase. Hoạt động của Caspase -9 và Caspase -3 / enzyme đã tăng cao (Hình 4A và B), do đó chỉ ra rằng iopromide gây ra cái chết tế bào. Hơn nữa, chất ức chế pan-caspase (Z-VAD-FMK) đã ngăn chặn cái chết của các tế bào HEK 293 được xử lý bằng iopromide (Hình 5). Những dữ liệu này tiết lộ rằng iopromide gây ra quá trình apoptosis.
lopromide kích hoạt autophagy để bảo vệ các tế bào khỏi quá trình apoptosis. Autophagy hoạt động như một "con dao hai lưỡi" và phá hủy các cơ quan bị hư hỏng hoặc lão hóa để phản ứng với các tác nhân gây căng thẳng bên ngoài, bao gồm stress oxy hóa hoặc sự tích tụ của các tập hợp protein. Gần đây, autophagy cũng được chứng minh là có liên quan đến quá trình chết tế bào do căng thẳng. Để giải quyết vai trò của autophagy đối với cái chết của tế bào HEK 293 do iopromide gây ra, chúng tôi đã kiểm tra sự hình thành của các túi autophagy bằng cách sử dụng các xét nghiệm nhuộm AO và LysoTracker Red. Các không bào tự thực được quan sát thấy trong các tế bào HEK 293 được xử lý với 50 mgl / ml iopromide (Hình 6A). Iopromide (50 mgI / ml) làm tăng cường độ huỳnh quang của các bào quan có túi axit (AVO) và giảm
Cường độ huỳnh quang AO trong tế bào HEK 293 (Hình 6B và C). Ngoài ra, LysoTracker Red còn được sử dụng để xác định các khoang dưới tế bào có tính axit trong các tế bào sống. Số lượng các lysosome có tính axit và cường độ huỳnh quang tăng lên trong các tế bào được xử lý iopromide (Hình 7).
Để làm rõ mối quan hệ giữa tự chết và tự chết, các tế bào HEK 293 đã được xử lý trước bằng các chất ức chế tự chết 3- Methyladenine (3- MA) hoặc bafilomycin A1 (Baf). Các tế bào sau đó được xử lý bằng iopromide (50 mg / ml) trong 48 giờ nữa. Khả năng sống sót của tế bào được đánh giá bằng xét nghiệm MTT. Khả năng sống sót của tế bào tiếp tục giảm xuống còn 30 phần trăm khi điều trị bằng iopromide và 3- Ma so với 53 phần trăm ở nhóm điều trị chỉ dùng iopromide (Hình 8A). Trong khi đó, khả năng sống sót của tế bào tiếp tục giảm xuống còn 18% khi điều trị bằng iopromide và Baf so với 53% ở nhóm điều trị chỉ dùng iopromide (Hình 8B). Những kết quả này gợi ý rằng quá trình apoptosis HEK 293 do iopromide gây ra được trung gian thông qua việc cảm ứng tự thực hiện
Một nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng quá trình sản xuất ROS được tạo ra bởi môi trường tương phản có i-ốt (40). Thật vậy, việc xử lý tế bào HEK 293 với iopromide 50 mgI / ml đã làm tăng sản xuất ROS 165% (Hình 9A và B). N-acetyl-L-cysteine (NAC), một chất thu hồi ROS, ngăn chặn quá trình sản xuất ROS và khôi phục sự phát triển của tế bào (Hình 9C). Sản xuất ROS có liên quan đến stress oxy hóa, dẫn đến sự bất hoạt của con đường tín hiệu AKTvà cảm ứng apoptosis (37). Để kiểm tra xem hoạt động AKT kinase có bị ức chế trong các tế bào HEK 293 được xử lý bằng iopromide (50 mgl / ml) hay không, chúng tôi đã đo hoạt tính AKT kinase. Hoạt động AKT kinase được tìm thấy bị giảm trong các tế bào được xử lý bằng iopromide, điều này ngụ ý rằng tín hiệu AKT đã bị chặn (Hình 10A).
Thảo luận
Ứng dụng nội mạch của phương tiện tương phản thẩm thấu thấp (LOCM) hoặc phương tiện tương phản đẳng áp (IOCM) gây ra bệnh thận nặng vàchấn thương thận(2,41,42) .LOCM cũng được biết là gây ra các phản ứng dị ứng. Tần suất phản ứng có hại của thuốc (ADR), phản ứng dị ứng nghiêm trọng của khả năng gây chết người với LOCM là 0. 2-0. 7 phần trăm, 1 đến 4/100, 000 và 2-9 / 1 000, 000, tương ứng (43). Trong bài đánh giá trước đây của chúng tôi, chúng tôi đã chỉ ra rằng IOCM gây ra bệnh thận và tổn thương thận thông qua việc tăng stress oxy hóa, tăng cường co mạch thận và gây tổn thương tế bào ống (43). Thiếu máu cục bộ ở tủy thận, sản xuất ROS, giảm sản xuất oxit nitric, và cảm ứng tổn thương biểu mô ống và nội mô mạch máu là những yếu tố nguy cơ gây tổn thương tế bào và mô (44,45). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát tác động gây độc tế bào của iopromide đối với quá trình tự chết và tự chết ở các tế bào HEK 293 bình thường. Kết quả của chúng tôi đã chứng minh rằng iopromide làm tăng đáng kể quá trình apoptosis và autophagy ở các tế bào HEK 293 thông qua việc cảm ứng một con đường phụ thuộc ROS.
Khi một tế bào nhận được các kích thích ngoại bào gây tổn hại, quá trình apoptosis hoặc autophagy được tạo ra như một phản ứng tích cực nhanh chóng đối với tổn thương. Nhiều nghiên cứu đã gợi ý rằng phương tiện tương phản có chứa i-ốt (ICM) có tác dụng gây độc tế bào vàthậntế bào biểu mô hình ống chết thông qua quá trình tự chết và / hoặc quá trình tự chết (46-49). Đồng nghiệp và cộng sự. đã chứng minh rằng iopromide, ioxaglate và ioxatalamate gây ra quá trình apoptosis trongthậntế bào trung bì, ống, biểu mô, nội mô và tế bào gan (50). Tan và cộng sự nhận xét rằng trong tế bào NRK -52 E, khả năng sống sót của tế bào giảm xuống 70% khi điều trị với 150 mgI / ml iopromide so với nhóm đối chứng (51). Ludwig và cộng sự. đã chứng minh rằng điều trị iopromide 120 mgl / ml trong 2 giờ gây ra sự phân mảnh DNA trong tế bào ống thận gần (HK -2) của con người (52). cách thức (Hình 1). Iopromide gây ra các thay đổi hình thái, phân mảnh DNA, apoptosis và autophagy trong các tế bào HEK 293 (Hình 2). Iopromide gây ra hoạt động caspase -3 / -7 và caspase -9 ở nồng độ 50 và 100 mgI / ml trong tế bào HEK 293 (Hình 4A và B). Ngoài ra, kết quả về khả năng sống của tế bào cho thấy độc tính tế bào do iopromide gây ra trong tế bào HEK 293 bị ức chế đáng kể khi bổ sung chất ức chế pan-caspase (Hình 5). Những kết quả này chỉ ra rằng iopromide gây ra tổn thương DNA và làm chết tế bào apoptotic qua trung gian hoạt động caspase 9 và caspase 3 / -7.
Gần đây, Lei Rong et.al. đã khẳng định rằng autophagy đóng một vai trò bảo vệ trong thương tích do iohexol và iodixanol gây ra ở ngườithậntế bào HK -2 biểu mô hình ống (47). Tuy nhiên, vẫn chưa rõ liệu autophagy có liên quan đến tổn thương tế bào HEK 293 bình thường do iopromide gây ra hay không. Để kiểm tra ảnh hưởng của iopromide đối với quá trình autophagy, chúng tôi sử dụng xét nghiệm nhuộm AO. AO là một đầu dò huỳnh quang màu lục lysosomotropic được proton hóa và mắc kẹt bên trong các bào quan có tính axit (AVO). Autophagy được đặc trưng bởi sự gia tăng hình thành các AVO. Do đó, AVO có thể được định lượng thông qua hình ảnh hoặc đo dòng chảy tế bào sau khi nhuộm tế bào bằng AO (41, 53-55). Như thể hiện trong Hình 6A và B, iopromide làm tăng cường độ huỳnh quang AVOs và giảm cường độ huỳnh quang AO của tế bào (Hình 6C) trong tế bào HEK 293. Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng iopromide gây ra quá trình tự động, như được đánh giá bằng cách sử dụng thử nghiệm nhuộm AO. Chúng tôi cũng chứng minh rằng iopromide làm tăng cường độ huỳnh quang của LysoTracker Red, do đó gợi ý rằng iopromide gây ra hoạt động của lysosome trong quá trình autophagy (Hình 7). Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng autophagy đóng một vai trò bảo vệ đối với cisplatin gây rathậntổn thương tế bào biểu mô hình ống (56-58). Để kiểm tra thêm vai trò của autophagy trong quá trình chết tế bào do iopromide gây ra, các tế bào HEK 293 đã được xử lý bằng chất ức chế autophagy 3- methyladenine (3- MA) hoặc bafilomycin A1 (Baf. Điều trị kết hợp (iopromide với {{ 6}} MA hoặc Baf) làm giảm đáng kể khả năng sống của tế bào khi so sánh với iopromide một mình (Hình 8), cho thấy rằng autophagy đóng vai trò bảo vệ trong tổn thương tế bào HEK 293 do iopromide gây ra.
ICM xâm nhập vào tế bào và gây ra những thay đổi trong chức năng ti thể, do đó dẫn đến tăng quá trình tạo ROS và chết tế bào apoptotic (59). Tana Xuexian và cộng sự. cũng cho thấy sự gia tăng đáng kể trong sản xuất ROS trong các tế bào NRK -52 E được xử lý bằng iopromide (60). Các chất chống oxy hóa, bao gồm natri bicacbonat, NAC, axit ascorbic (Vitamin C), statin và chất ức chế phosphodiesterase loại 5 đã được chứng minh là có tác dụng do ICM gây ra (61-65). Trong một nghiên cứu in vivo, NAC đã được chứng minh là hiệu quả hơn so với tăng hydrat hóa đơn thuần trong việc ngăn ngừa cấp tính do thuốc cản quangsuy thận(63). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh rằng iopromide gây ra sự sản sinh ROS trong tế bào HEK 293 (Hình 9A và B). Khả năng sống của tế bào được phát hiện tăng đáng kể ở nhóm iopromide cộng với NAC so với nhóm chỉ sử dụng iopromide (Hình 9C).Những thay đổi trong hoạt động AKT là điều cần thiết cho sự tồn tại của tế bào và đã được chứng minh là có thể điều chỉnh mạnh mẽ quá trình chết rụng và tự chết khi có ICM (66-68). Ở đây, chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của iopromide đối với việc điều hòa AKT trong tế bào HEK 293. Kết quả cho thấy sự giảm rõ rệt hoạt động AKT kinase trong các tế bào được xử lý iopromide so với các tế bào đối chứng. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng sự ức chế hoạt động AKT có tương quan với quá trình chết rụng do iopromide gây ra và quá trình tự chết, có thể được kiểm soát
thông qua con đường tín hiệu AKT. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng iopromide kích thích sản xuất ROS, ức chế hoạt động và tín hiệu AKT kinase. Con đường tín hiệu AKT tương quan thuận với sự tồn tại của tế bào và liên quan tiêu cực với quá trình chết và tự chết của tế bào.Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh rằng autophagy đã bảo vệ các tế bào khỏi quá trình apoptosis. Tổn thương tế bào và độc tính tế bào của tế bào HEK được bắt đầu bởi quá trình chết rụng do iopromide gây ra (Hình 10B). Kết luận, chúng tôi đã chứng minh rằng iopromide ức chế đáng kể khả năng tồn tại của tế bào HEK 293 và gây ra apoptosis và autophagy so với nhóm đối chứng trong ống nghiệm. Hơn nữa, nồng độ iopromide cao gây ra tổn thương tế bào, apoptosis và autophagy thông qua căng thẳng tế bào phụ thuộc ROS và ức chế con đường AKTsignaling ở các tế bào HEK 293 bình thường.
