Kháng thể kích thích miễn dịch Liên kết với nhau Tạo ra sự kích hoạt dòng tủy mạnh mẽ và khả năng miễn dịch lâu bền chống khối u (Phần 2)

Để tìm hiểu thêm thông tin, xin vui lòng liên hệdavid.wan@wecistanche.com

Thảo luận:

Các kết quả được trình bày ở đây cung cấp bằng chứng thuyết phục ủng hộ ISAC như một công nghệ mới cho liệu pháp miễn dịch khối u. Mô hình in vitro của ISAC đã chứng minh khả năng của chúng để kích hoạt các APC nguyên sinh dòng tủy của con người theo cách phụ thuộc Fc R và TLR và tăng cường sự trình bày chéo của kháng nguyên bằng cách sử dụng hệ thống mô hình OVA của chó. Sự kích hoạt thông qua điều hòa phân tử kích thích vũ trụ CD40 không chỉ được quan sát trong ống nghiệm mà còn được thấy trên các APC dòng tủy cư trú của khối u trong cả mô hình khối u xenograft và mô hình khối u tổng hợp. kháng thể đơn dòng nhắm mục tiêu khối u ở dạng ISAC đã thay đổi kết quả kích thích miễn dịch và hiệu quả tổng thể thường được dự đoán trước với thuốc chủ vận TLR. So sánh giữa phân phối trastuzumab tại chỗ kết hợp với T785 với phân phối toàn thân của T 785- ISAC đã chứng minh rằng chỉ ISAC mới thành công trong việc giảm gánh nặng khối u. Việc phân phối hỗn hợp tại chỗ không mang lại lợi ích gì trong mô hình xenograft khối u HCC1954, với các tác dụng tương đương với trastuzumab đơn thuần. Phát hiện này hỗ trợ rằng không chỉ phân phối tại chỗ mà còn phân phối đồng thời kháng thể và chất chủ vận TLR là cần thiết cho hiệu quả điều trị quan sát được với ISAC. Dữ liệu cơ học được tạo ra trong mô hình xenograft khối u HCC1954 đã chứng minh yêu cầu in vivo đối với tương tác Fc R và tương tác TLR để đạt hiệu quả, vì cả TLRnull-ISAC và ISAC không hoạt động Fc đều không kiểm soát được sự phát triển của khối u. Hơn nữa, việc sử dụng ISAC có hệ thống dẫn đến hiệu quả chống khối u bền vững ở các mô hình khối u tổng hợp HER2 ở chuột và các mô hình ung thư vú HER2 cộng với người có khả năng kháng điều trị bằng kháng thể không liên hợp. HER2 được chọn làm kháng nguyên đích cho các nghiên cứu tiền lâm sàng in vivo vì liệu pháp bổ trợ tân dược, bổ trợ và liệu pháp đầu tay cho bệnh nhân ung thư vú tiến triển tại chỗ hoặc di căn bị chi phối bởi các kháng thể nhắm mục tiêu HER 2- không được thiết kế để kích thích miễn dịch hệ thống và các kháng thể ngăn chặn điểm kiểm tra tế bào T được chấp thuận đã có hiệu quả tối thiểu ở những bệnh nhân này. Những bệnh nhân này có thể được hưởng lợi từ ISAC giữ lại chức năng của các kháng thể mẹ và thêm tiềm năng kích thích miễn dịch đáng kể. Như với bất kỳ liệu pháp miễn dịch nào, khả năng tạo ra hoặc làm trầm trọng thêm các kháng thể chống thuốc vẫn tồn tại và trong trường hợp của ISAC, cuối cùng có thể phụ thuộc vào khả năng sinh miễn dịch của kháng thể mẹ. Những đánh giá này được thực hiện tốt nhất trên lâm sàng và trastuzumab có thể là lựa chọn lý tưởng để khảo sát vì tỷ lệ sinh miễn dịch được báo cáo của Herceptin ™ ở bệnh nhân là dưới 1%. Dữ liệu in vivo chứng minh yêu cầu phân phối đồng thời kháng thể và tá dược được hỗ trợ thêm bằng công việc mô tả chi tiết tín hiệu nội bào chi phối hoạt động của ISAC thông qua tín hiệu Fc R và TLR đồng thời. Trong khi các nghiên cứu bổ sung có thể làm sáng tỏ thêm động lực phát tín hiệu ISAC nội bào, các nghiên cứu được mô tả ở đây nêu bật những lợi thế về tín hiệu tiềm năng của việc kết hợp chất chủ vận TLR với kháng thể, như thường được quan sát thấy khi kháng thể tiếp xúc với mầm bệnh trong quá trình miễn dịch bảo vệ. PBMC của con người đã được sử dụng để tiếp tụchiểu và phân biệt hoạt động của hỗn hợp và ISAC. Kết quả cho thấy dấu hiệu khuếch đại sau khi kích thích ISAC so với dấu hiệu được tạo ra bởi hỗn hợp các thành phần riêng lẻ, hỗ trợ thêm cho khả năng tăng cường hoạt động thông qua sự liên hợp hóa học của kháng thể và chất chủ vận TLR. Mặc dù không thể đo lường hiệu lực cụ thể của TLR7 và TLR 8- của ISAC bằng cách sử dụng các ô báo cáo HEK293, nhưng minh họaquá trình phosphoryl hóa IRF do ISAC tạo ra -7 cho thấy chủ nghĩa TLR7 / 8 đang hoạt động, vì IRF -7 được biết là hạ nguồn của tín hiệu hướng TLR7 và TLR8 MyD 88- 30. Dữ liệu chỉ ra rằng ISAC không chỉ làm tăng tín hiệu của các con đường chuẩn liên quan đến con đường TLR và Fc R mà còn làm giảm ngưỡng kích hoạt theo cặp cần thiết để kích hoạt quá trình phosphoryl hóa các protein tín hiệu xuôi dòng như protein ribosome S6, một cơ quan điều hòa chính của quá trình dịch protein trong tế bào. Điểm DREMI cao, được đo đặc biệttrong bạch cầu đơn nhân cũng như trong DC, hỗ trợ sự phụ thuộc có điều kiện mạnh mẽ gây ra bởi kích thích với ISAC mà không thấy trong hỗn hợp. Hiện tượng này có thểđược tạo điều kiện thuận lợi bởi những thay đổi nội bào về sự phong phú, bản địa hóa và / hoặc tuyển dụng các thụ thể trong endosome, nhưng cần phải điều tra thêm để xác nhận một cơ chế chính xác. Quan trọng là, phân tích DREMI đã xác định các mối quan hệ nhất quán với các đối tác tín hiệu đã biết là kết quả của kích thích ISAC. Bằng cách ức chế đã biết của nóvai trò trong tín hiệu NF-κB chuẩn 49, chúng tôi quan sát thấy sự phụ thuộc giảm (tức là điểm DREMI)giữa pIRF7 và chất ức chế kappa B (IκB) khi tế bào dòng tủy được kích thích bằng ISAC. Nói chung, những kết quả này hỗ trợ một phản ứng nội bào được khuếch đại và duy trì thông qua các phân tử con đường dẫn truyền tín hiệu có liên quan ở hạ nguồn của kích thích ISAC ngoài sự hiệp lực giữa các con đường tín hiệu liên quan đến TLR và Fc R.

Bấm vào đây để tìm hiểu thêm về Cistanche

Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng các tương tác Fc-Fc R chức năng là cần thiết để kích hoạt các APC dòng tủy qua trung gian ISAC. Fc IgG1 bản địa, có ái lực cao nhất với Fc R hoạt hóa của các isotype IgG tồn tại tự nhiên, vượt trội hơn các isotype IgG khác có ái lực thấp hơn đối với Fc R hoạt hóa. Tăng cường hơn nữa tương tác Fc-Fc R thông qua hiệu lực tăng cường fucosyl hóa trong khi giảm hiệu lực tương tác Fc-Fc R thông qua glycosyl hóa làm giảm hiệu lực. Như mong đợi, tín hiệu Syk sau khi tham gia Fc R cùng với chủ nghĩa TLR tiếp theo được yêu cầu đối với ISAC để tạo ra kích thích tối đa. Những phát hiện này được hỗ trợ bởi các nghiên cứu chứng minh sự tăng cường đáng kể kích thích dòng tủy sau khi đồng kích thích với IgG liên kết tấm và chất chủ vận TLR PAM3CSK 50. Chúng cũng gợi ý rằng liên kết chéo Fc rộng rãi hơn, trên bề mặt tế bào đích hoặc trong thiết lập tấm in vitro , có thể xảy ra, hoặc các mạng báo hiệu vi sai được tham gia, tuân theo sự kích thích của ISAC thay vì hỗn hợp các thành phần. Bản dịch của nền tảng ISAC in vivo lần đầu tiên được đánh giá với HER2 của người cộng với các dòng tế bào khối u ở chuột thiếu tế bào B, T và NK đầy đủ chức năng. Đáng chú ý, trastuzumab ISAC hiệu quả hơn đáng kể so với trastuzumab trên nhiều khối u với các mức độ biểu hiện HER2 khác nhau. Hơn nữa, dữ liệu đã chứng minh sự phụ thuộc vào việc nhắm mục tiêu khối u đối với tác dụng chống khối u của ISAC, vì isotype-ISAC không thể gây ra sự thoái lui và thanh thải khối u. Trong khi mô hình in vitro cho thấy sự cần thiết đối với hoạt động TLR và Fc R để kích hoạt hiệu lực của ISAC, các mô hình như vậy không thành công trong việc đo lường sự phụ thuộc vào việc nhắm mục tiêu kháng nguyên ISAC. Không có sự khác biệt nào được đo lường giữa ISAC được nhắm mục tiêu và isotype T 785- trong các xét nghiệm dựa trên đĩa với APC dòng tủy khỏe mạnh của người được đồng nuôi cấyvới các tế bào khối u (dữ liệu không được hiển thị).Sự thiếu phụ thuộc mục tiêu được đo trong ống nghiệm có thể do nhiều yếu tố: APC dòng tủy được tìm thấy để điều chỉnh Fc Rs trên bề mặt tế bào sau khi nuôi cấy trong ống nghiệm, điều này có thể tăng cường khả năng IgG hòa tan liên kết với Fc R, dẫn đến tín hiệu khuếch đại từ ISAC isotype.Ngoài ra, các văn hóahệ thống thiếu IgG nội sinh và các yếu tố huyết thanh bổ sung hiện diện trong cơ thể sống có thể cạnh tranh với Fc R in vivo và làm giảm các hiệu ứng được thấy với ISAC isotype.Tuy nhiên, các mô hình in vivo đã chứng minh sự phụ thuộc của ISAC vào việc nhắm mục tiêu khối u để có hiệu quả chống khối u.Các ISAC isotype không chỉ cho thấy ít tác động đến sự phát triển của khối u trong các nghiên cứu về hiệu quả, mà còn không gây ra tác động đến mức độ di truyền trong các khối u, như được thể hiện trong các mô hình khối u xenograft và syngeneic.Ngoài việc chứng minh hiệu quả phụ thuộc vào mục tiêu in vivo, T 785- ISAC được động vật dung nạp và gây giảm cân tối thiểu, cho thấy ít dấu hiệu về tác dụng ngoài mục tiêu và các tác dụng ngoại ý ở chuột.Những dữ liệu này hỗ trợ thêm khả năng của ISAC nhắm mục tiêu khối u được phân phối có hệ thống di chuyển đến khối u và gây ra phản ứng chống khối u tiền viêm tại chỗ.

Tầm quan trọng của các chức năng tác động qua trung gian tế bào dòng tủy đã được chứng minh trong các nghiên cứu làm suy giảm tế bào, trong đó sự suy giảm clodronate của các tế bào thực bào làm giảm khả năng của ISAC trong việc gây ra sự thanh thải khối u.Điều thú vị là, mặc dù ban đầu các khối u thoái triển sau khi cạn kiệt các tế bào dương tính Gr1, các khối u sau đó lớn dần lên.Hiện tượng này có thể xảy ra do sự cạn kiệt các tiền chất của tế bào thực bào như bạch cầu đơn nhân, sau này có thể biệt hóa thành các tế bào thực bào chức năng và trưởng thành 51.Những hiểu biết sâu hơn về phân tử và tế bào thu được khi định lượng mức mRNA và những thay đổi sau khi điều trị ISAC.Những dữ liệu này đã được chứng thực thêm bằng hóa mô miễn dịch cũng như định lượng protein, cho thấy có sự xâm nhập của các tế bào dòng tủy vào khối u.với việc sản xuất cytokine TNF chống viêm và thuốc hóa trị dòng tủy CCL2 (MCP -1) và CCL4 (Mip1b).

Hình 2: ISACS gợi ra các mẫu tín hiệu riêng biệt trong các APC dòng tủy. tỷ lệ trong 15 phút. (a) Tỷ lệ arcsinh trung bình của ISAC so với tín hiệu được đo sau khi kích thích hỗn hợp đối với các phosphoprotein khác nhau như được mô tả bằng bản đồ nhiệt, với màu vàng cho thấy tín hiệu tăng và màu xanh cho thấy tín hiệu giảm. (b) Biểu đồ đo tế bào dòng chảy đại diện cho pIRF7 và pRPS6 trong bạch cầu đơn nhân và cDCs. (c) Sự thay đổi lần lượt của tín hiệu gây ra được tính bằng tỷ lệ arcsinh so với điều khiển không được kích thích. Sự phosphoryl hóa IRF7 và ERK1 / 2 được đo trong bạch cầu đơn nhân và cDCs sau ISAC hoặc kích thích hỗn hợp. Dữ liệu từ một thử nghiệm với sáu nhà tài trợ (trung bình và SEM); *P<0.05,><0.01,><0.001,><0.0001. (d)="" representative="" drevi="" plots="" following="" dremi="" analysis="" with="" the="" area="" under="" the="" curve="" (auc)="" and="" inflection="" point="" (ip)="" denoted.="" drevi="" plots="" were="" visually="" inspected="" for="" curve="" fit="" and="" signal-to-noise,="" and="" inflection="" points="" were="" calculated="" for="" those="" with="" proper="" sigmoidal="" curve="" fits="" (n/a="" indicates="" no="" curve="">

Các thụ thể CCL2 và CCL4, CCR2 và CCR5 lần lượt được biểu hiện trên bạch cầu đơn nhân và đại thực bào, cho thấy những loại tế bào này có thể được tuyển chọn cho các khối u được điều trị bằng ISAC.Hơn nữa, mRNA Cxcl9 và Cxcl11, mã hóa các chemokine đặc hiệu của tế bào T và được biểu hiện bởi các DC trong TME, cũng được điều chỉnh bằng cách xử lý trastuzumab ISAC (Hình 23) 52,53.Trastuzumab ISAC với hiệu lực tăng lên, sử dụng chất chủ vận CL264, cho thấy hiệu quả nâng cao trong các mô hình khối u biểu hiện ít HER2 hơn.Điều này rất quan trọng vì những bệnh nhân có khối u biểu hiện HER2 thấp có nhiều lựa chọn điều trị hạn chế hơn và không đủ điều kiện để sử dụng trastuzumab hoặc các liệu pháp khác có chứa trastuzumab.Giảm cân thoáng qua khoảng 5-10 phần trăm và tăng tiết TNF toàn thân đã được quan sát thấy ở động vật được điều trị bằng cả ISAC có mục tiêu và isotype CL 264-, cho thấy các tác dụng có thể xảy ra ngoài mục tiêu ngoài tác dụng chống hoạt động của khối u được quan sát.Dữ liệu tổng hợp được trình bày trong các mô hình xenograft cho thấy rằng quá trình thực bào qua trung gian ISAC là một cơ chế hiệu quả để loại bỏ khối u, nhưng cơ chế này có thể được tăng cường sau khi trình bày kháng nguyên của tân sinh khối u đối với tế bào T ở vật chủ có năng lực miễn dịch.Để đạt được mục tiêu này, khả năng của ISAC trong việc thúc đẩy miễn dịch chống khối u ở chuột hoang dã đã được nghiên cứu với ISAC chống rHER2 ở hai loại khác nhaurHER 2- thể hiện các mô hình tổng hợp (MMC và CT 26- rHER2). Cả T785 và CL264 chứa ISAC đều được đánh giá trong mô hình MMC tổng hợp dựa trên biểu hiện kháng nguyên cao của rHER2, vì cả ISAC hiệu lực thấp hơn và cao hơn đều được công nhận là có hiệu quả với mật độ kháng nguyên cao trên tế bào khối u. Cả hai ISAC rHER2 đều dẫn đến việc loại bỏ hoàn toàn khối u ở động vật mang khối u lớn (350-950 mm3) trong mô hình MMC trong khi kháng thể không liên hợp không thể kiểm soát sự phát triển của khối u. Phân tích mức phiên mã mRNA trong mô hình MMC cho thấy một sự thay đổi đáng kể trong quy định củanhiều gen vào thời điểm 24 giờ sau khi điều trị với ISAC rHER2 T 785- được nhắm mục tiêu liên quan đến kháng thể rHER2 hoặc ISAC isotype, bao gồm trong các gen liên quan đến sinh học tế bào tủy, sinh học TLR và các phản ứng miễn dịch thích ứng. Sự thâm nhiễm ngày càng tăng của các tế bào biểu hiện CD11c- và F4 / 80- được phát hiện bằng hóa mô miễn dịch, tương tự như xu hướng được thấy trong mô hình khối u xenograft HCC1954. Hơn nữa, sự thâm nhập tế bào T CD8 đã được quan sát bằnghóa mô miễn dịch, hỗ trợ tạo ra phản ứng miễn dịch thích ứng sau điều trị ISAC.

Ngoài tầm quan trọng đã được chứng minh của các tế bào thực bào trong mô hình xenograft, các nghiên cứu về sự suy giảm trong mô hình khối u tổng hợp MMC cho thấy sự phụ thuộc mạnh mẽ vào các tế bào thực bào, vì sự suy giảm sử dụng các liposome nạp clodronate làm giảm tác dụng chống khối u qua trung gian ISAC. Hơn nữa, các nghiên cứu tổng hợp đã chứng minh vai trò quan trọng của tế bào T đối với hiệu quả của ISAC. Sự thanh thải khối u do ISAC điều khiển phụ thuộc nhiều vào hoạt động của tế bào T CD8, vì sự suy giảm của tế bào T CD8 đã ức chế hiệu quả chống khối u. Dữ liệu cho thấy rằng hoạt động của tế bào T được điều khiển thông qua sự kích hoạt qua trung gian TLR của các tế bào dòng tủy do ISAC kích thích. Yêu cầu như vậy đối với tế bào T, có lẽ liên quan đến sự trình bày các kháng nguyên liên quan đến khối u bởi các tế bào dòng tủy được ISAC kích thích, hỗ trợ rằng ISAC có khả năng làm trung gian cho hoạt động chống khối u của chúng thông qua ít nhất hai cơ chế: thực bào và trình bày kháng nguyên. Trong khi các tế bào thực bào cung cấp phản ứng chống khối u sớm sau khi điều trị ISAC, việc mồi kháng nguyên của tế bào T cuối cùng cung cấp khả năng thanh thải khối u và các hiệu ứng lâu bền được đo trong các mô hình có đầy đủ năng lực miễn dịch. Sự kết hợp này rất được mong đợi đối với bệnh nhân ung thư vì điều trị ISAC có thể dẫn đến khả năng miễn dịch chống khối u mạnh mẽ và bền vững. 264- Điều trị ISAC đã được điều chỉnh lại, sau 30 ngày kể từ ngày không có khối u, với dòng tế bào mẹ CT26 không rHER2 biểu hiện. rHER 2- Động vật được chữa khỏi bằng CT26 được bảo vệ khỏi thử thách với CT26 trong khi động vật chưa có khối u không thể từ chối sự phát triển của khối u. Ngoài ra, để cho thấy khả năng bảo vệ đặc hiệu đối với dòng tế bào khối u CT26, 4T1 đã được cấy đồng thời vào sườn bên của những con chuột thử thách CT26 của bố mẹ. Mặc dù khối u CT26 không phát triển ở những con chuột được cô ấy chữa khỏi bằng CT26, sự phát triển của khối u 4T1 không bị cản trở và do đó cung cấp bằng chứng cho thấy khả năng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên và phụ thuộc vào phản ứng miễn dịch thích ứng. Hơn nữa, những nghiên cứu này cho thấy ISAC nhắm mục tiêu khối u làm trung gian cho bộ nhớ miễn dịch không chỉ đối với kháng nguyên khối u được nhắm mục tiêu ban đầu mà còn với các kháng nguyên không được nhắm mục tiêu. Những dữ liệu này cũng gợi ý rằng các tế bào dòng tủy có thể trình bày các kháng nguyên liên quan đến khối u thúc đẩy các phản ứng CTL bổ sung. Ý nghĩa của những phát hiện này chứng minh rằng, ngay cả khi kháng nguyên khối u được nhắm mục tiêu sau đó được điều chỉnh giảm hoặc không thể liên kết với ISAC, thì bộ nhớ miễn dịch đã được sử dụng và có khả năng duy trì một phản ứng lâu dài. Câu trả lời này không phải làgiới hạn đối với kháng nguyên được ISAC nhắm mục tiêu mà còn đối với các kháng nguyên biểu hiện khối u bổ sung, không xác định.Tổng hợp lại, những dữ liệu này chỉ ra rằng ISAC tạo ra sinh học khác biệt về mặt định tính và định lượng liên quan đến hoạt hóa tế bào và trình bày kháng nguyên, tăng sinh tế bào T và khả năng miễn dịch chống khối u lâu bền.

Methods and Materials: Antibody Conjugation & Characterization For conjugation of adjuvants to the antibody, adjuvants were first synthesized to include a linker flanked by a reactive group. Conjugates produced using two-step methods were first synthesized through the modification of mAb lysine residues with a heterobifunctional crosslinker SATA. Deprotection of the acetylated thiol exposed a reactive thiol which was then reacted at room temperature for 2-4 hours with an adjuvant-linker flanked by a thio-reactive maleimide. For constructs produced using a single-step conjugation method, TFP esters were then conjugated to an IgG1 antibody. The TFP esters were dissolved in anhydrous DMSO to make a 20 mM stock solution and 5-10 molar equivalents (relative to the antibody) were added to the IgG antibody at 10 mg/mL in PBS. The conjugation reaction was performed at 4-40°C for 2-12 hours. The resulting immunoconjugates were buffer exchanged into PBS (pH 7.4) through desalting (Zeba Columns, Thermo Fisher Scientific) or dialysis to remove excess small molecular weight impurities. The final protein concentration was determined by measuring the absorbance at 280 nm on a Nanodrop 1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific). The yields were >75 phần trăm dựa trên protein phục hồi. Phân tích SEC phát hiện sự hiện diện tổng hợp tối thiểu và DAR được xác định bằng phân tích LC / MS. ISAC tinh khiết đã được lọc qua bộ lọc vô trùng 0. 2 μm và được lưu trữ ở -20 độ cho đến khi sử dụng. Tế bào báo cáo của EK Reporter AssayHEK293 thể hiện TLR7 của người hoặc TLR8 của người được mua từ Invivogen (hub-htlr7 hoặc hub-htlr8) và các giao thức của nhà cung cấp đã được tuân theo để truyền bá và thử nghiệm tế bào. Tóm lại, các tế bào đã được phát triển đến 80-85 phần trăm hợp lưu ở 5 phần trăm CO2 trong DMEM được bổ sung với 10 phần trăm FBS, Zeocin và Blasticidin. Sau đó, tế bào được gieo vào 96- đĩa phẳng ở 4x104 tế bào / giếng với chất nền có chứa môi trường phát hiện HEK và các phân tử kích thích miễn dịch. Hoạt động được đo bằng đầu đọc đĩa ở bước sóng 620-655 nm. }), FCGR2A (CD32a, cat # 1257- FC -050), FCGR2B (CD32b, cat # 1875- FC -050), FCGR3A (CD16a, cat # {{34 }} FC -050). Phân tích liên kết được thực hiện trên thiết bị Biacore T200 trong bộ đệm HBS-EP cộng (GE BR100669) bằng cách sử dụng chip CM5 (GE BR100530) có chứa kháng thể kháng HIS cố định (HIS Capture kit, GE 28995056 ). Rituximab hoặc Rituximab-ISAC đã tiêm qua các tế bào dòng có chứa FCGR được bắt giữ hoặc chỉ kháng thể kháng His trên bề mặt tham chiếu. Dữ liệu được tham chiếu kép vớibề mặt chống His và một mũi tiêm chỉ đệm. Một phương pháp chuẩn độ động học được sử dụng và các bề mặt được tái tạo giữa các chu kỳ bằng cách tiêm 10 mM glycine, pH 1,5. Dữ liệu phù hợp bằng cách sử dụng phần mềm đánh giá Biacore T200 (V3.1) sử dụng khớp động học (1: 1) cho FCGR1 và FCGR3A (trung bình 6 lần chạy) và ái lực ở trạng thái ổn định (1: 1) cho FCGR2A và FCGR2B (trung bình 3 lần chạy ).

Human Myeloid APC Isolation Myeloid APCs, which predominantly consisted of monocytes (>95%), were isolated from the whole blood of healthy donors (Stanford Blood Center) by density gradient centrifugation using a RosetteSep Human Monocyte Enrichment Cocktail (Stem Cell Technologies). Myeloid APCs were further isolated using a negative selection Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 depletion (Stem Cell Technologies) to a final purity of >90% được xác định bằng phương pháp đo tế bào dựa trên biểu hiện CD14, CD16, CD11c và HLA-DR. Tế bào được loại bỏ khỏi môi trường nuôi cấy, rửa sạch và tiếp tục lại trong PBS với 2 phần trăm FBS và 2 mM EDTA ở 1-10 x106 tế bào / mL. Trong một số trường hợp, các tế bào sau đó được dán nhãn với 2 μM CFSE trong 2 phút và sau đó được rửa một lần bằng RPMI -1640 (Lonza) được bổ sung 10% FBS (Atlanta Biologicals) và 100 U / mL Pen / Strep (Lonza). Sau đó, các tế bào được cố định trong 2% paraformaldehyde và rửa ba lần bằng PBS trước khi sử dụng tiếp. được bổ sung 10% FBS (Atlanta Biologicals), 1 mM Natri Pyruvate (Lonza), 100 μM axit amin không thiết yếu (Lonza) và 100 U / mL Pen / Strep (Lonza). Đối với các thí nghiệm đồng nuôi cấy tế bào đơn nhân và tế bào đơn nhân, tế bào đơn nhân được nuôi cấy với các tế bào khối u dị sinh cố định với tỷ lệ 3: 1. Sau đó, các tế bào được ủ với các chất kích thích hoặc kiểm soát miễn dịch trong 18-36 giờ ở 37 độ với 10 phần trăm CO2. Sự hoạt hóa tế bào được đo thông qua sự biểu hiện bề mặt tế bào của các dấu hiệu hoạt hóa và sản xuất cytokine. Mức độ biểu hiện của dấu hiệu bề mặt được đo bằng phương pháp đo tế bào dòng với các kháng thể chống lại CD40 (5C3, BD), CD 86 (IT2.2, BD), HLA-DR (L243, BD) và CD16 (3G8, BD), CD14 (MΦP9, BD) và CD123 (7G3, BD). PBMCs được phân tích bằng phương pháp đo tế bào dòng với các kháng thể chống lại các dấu hiệu kích hoạt nói trên cũng như các dấu hiệu dòng dõi CD19 (HIB19, BD), CD56 (B159, BD), CD3 (SK7, BD), CD4 (OKT4, BioLegend), CD8 (SK1, BD) và CD69 (FN50, BD). Trong tất cả các trường hợp, phần nổi trên bề mặt nuôi cấy tế bào được thu thập sau khi ủ 18 hoặc 36- giờ và sản xuất cytokine được đo bằng cách sử dụng bộ dụng cụ mảng hạt cytokine (Bộ dụng cụ Cytokine gây viêm ở người, BD Biosciences) và ELISA (Bộ dụng cụ TNF Human ELISA, eBiosciences) .Mass CytometryPBMCs được phân lập từ máu của người hiến khỏe mạnh và được kích thích bằng ISAC, hỗn hợp kháng thể và chất bổ trợ, hoặc không có kích thích trong 5-15 phút ở 37 độ. Sau khi kích thích, các tế bàođã được cố định bằng cách thêm 16 phần trăm PFA (Khoa học hiển vi điện tử) đến nồng độ cuối cùng là 1,6 phần trăm và ủ trong 1 0 phút ở nhiệt độ phòng (RT). Các tế bào cố định được rửa bằng môi trường nhuộm tế bào (CSM; PBS với 0. 5 phần trăm BSA và 0,02 phần trăm natri azide (tất cả Sigma) và được mã vạch bằng cách sử dụng phương pháp dựa trên palađi như đã mô tả trước đây 54. Các mẫu mã vạch được kết hợp thành một mẫu hỗn hợp để nhuộm bề mặt.

Quá trình nhuộm bề mặt được thực hiện bằng cách thêm kháng thể (Bảng bổ sung 2) trong CSM và ủ trong 3 {{1 0}} phút ở RT. Các kháng thể chống người được mua được mua liên hợp (Fluidigm) hoặc liên hợp với đồng vị kim loại nặng bằng cách sử dụng bộ dán nhãn kháng thể MaxPar X8 (Fluidigm) theo khuyến nghị của nhà sản xuất. Các tế bào nhuộm bề mặt được rửa một lần trong CSM và được thấm MeOH trong 10 phút trên đá. Các tế bào đã thấm được rửa hai lần bằng CSM và các kháng thể chống lại các kháng nguyên nội bào được thêm vào trong 30 phút ở RT. Tế bào được rửa sạch bằng CSM và cuối cùng được tiếp tục trong dung dịch xen kẽ (1,6% PFA trong PBS, 0,02% saponin (Sigma) và 0,5 μM iridium-intercalator (Fluidigm)) qua đêm ở 4 độ. Trước khi thu thập dữ liệu, các mẫu được rửa một lần trong CSM và hai lần trong ddH2O. Tất cả các mẫu được lọc qua bộ lọc tế bào (Falcon) và tiếp tục ở tốc độ 1x106 tế bào / mL trong ddH2O được bổ sung 1x hạt hiệu chuẩn 4 phần tử EQ (Fluidigm) và dữ liệu thu được trên máy đo khối lượng CyTOF2 (Fluidigm). Các phản hồi tín hiệu được đánh giá bằng cách sử dụng triển khai SPADE trong Citibank 29. Các phân tích được thực hiện trên tất cả các ô (không lấy mẫu xuống), chọn số lượng cụm đã nêu và sử dụng tất cả các điểm đánh dấu bề mặt có liên quan nhưng không có dấu hiệu nội bào để phân nhóm. Các dòng tế bào miễn dịch được chú thích dựa trên các mẫu biểu hiện protein bề mặt chiều cao của chúng. Các phân tích thống kê được thực hiện trong R, một môi trường phần mềm thống kê mã nguồn mở. Trong mỗi tập hợp con tế bào, nhóm xử lý và nhà tài trợ, sự thay đổi nếp gấp trung bình được tính cho hai mươi dấu hiệu phospho-protein sau: p-Src, p-STAT5, p-cMET, p-AKT, p-MAPKAPK2, p-SHP2, p -SLP76, p-IRF -7, p-ZAP70 / SYK, p-CREB, p-NFKB, p-PI3K, IKB (tổng cộng), p-PLCG1, p-ERK1 / 2, p-p38, p -BTK / ITK, p-S6, p-STAT3 và p-JNK / SAPK. Thay đổi lần đầu tiên trung bình được tính theo tổng số ô trong mỗi cụm, như được định nghĩa sau phân nhóm SPADE. Các bài kiểm tra t ghép đôi được thực hiện để ước tính sự khác biệt về thay đổi nếp gấp trung bình và để kiểm tra giả thuyết vô hiệu rằng không có sự khác biệt về thay đổi nếp gấp trung bình của mỗi điểm đánh dấu trong các điều kiện điều trị và kiểm soát.

Quy trình thí nghiệm mô hình khối u Xenograft Các dòng tế bào u được mua từ ATCC (NCI-N87, HCC1954 và COLO205) hoặc AddexBio (JIMT -1) và được nuôi trồng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tế bào được thu hoạch khi chúng đạt đến độ hợp lưu 80-90 phần trăm bằng cách tách ra với Accutase (Stemcell), rửa sạch bằng PBS, tiếp tục ở 40 x 106 tế bào / mL trong PBS và đặt trên đá không quá hai giờ. Ngay trước khi cấy, các tế bào lơ lửng được trộn với một thể tích tương đương của Cultrex PathClear BME, Loại 3 (Hệ thống R&D) và 100 μL hỗn hợp (2 x 106 tế bào) được cấy dưới da vào sườn bên phải của 6-8- tuần -này chuột cái như sau: Tế bào NCI-N87 và COLO205 được cấy vào chuột NSG (Phòng thí nghiệm Jackson), các tế bào HCC1954 và JIMT -1 được cấy vào loại trực tiếp kép Rag2 / IL2rg (Taconic) và HCC1954 (để đánh giá với T 785- ISAC) được cấy vào NSG hoặcSCID / chuột màu be (Phòng thí nghiệm Jackson hoặc Taconic và Envigo). Kích thước khối u được ghi lại hai lần một tuần và được ước tính theo công thức sau: (dài x rộng2) / 2. Sau khi khối u đạt đến kích thước 50-100 mm3, thường trong vòng một tuần kể từ khi cấy ghép khối u, các phương pháp điều trị sẽ được bắt đầu. Các con chuột được phân ngẫu nhiên theo kích thước khối u vào các nhóm điều trị trước khi điều trị ban đầu. Trastuzumab (EirGenix; EG12014), Trastuzumab ISAC, hoặc Isotype ISAC được bào chế trong PBS ở mức 1 mg / mL và được dùng với liều 5 mg / kg trong màng bụng mỗi năm ngày (Q5D) với tổng số sáu liều. Những con chuột có khối u vượt quá 2000 mm3 đã bị chết.

Quy trình thí nghiệm làm cạn kiệt tế bào HCC1954 và MMC Để làm cạn kiệt đại thực bào và các tế bào thực bào khác, những con chuột mang khối u HCC1954 hoặc MMC đã được điều trị bằng cách tiêm vào màng bụng hai ngày trước khi điều trị ISAC ban đầu với liponat clodronat hoặc liposome kiểm soát không chứa clodronat như một đối chứng âm tính (Encapsula, Catalog # CLD -8901) và sau đó được điều trị hai lần một tuần trong tổng số ba tuần. Để làm cạn kiệt bạch cầu trung tính, chuột được điều trị bằng kháng thể cạn kiệt 1A8 để chỉ làm cạn kiệt Ly6G cộng với bạch cầu trung tính (Danh mục BioXCell # BE 0075-1) hoặc RB 6-8 C5 để làm cạn kiệt các tế bào Gr1 cộng, bao gồm Ly6G cộng với bạch cầu trung tính và Ly6C cộng tế bào (BioXCell Catalog # BE0075) hoặc isotype kiểm soát 2A3 và LTF -2 (BioXCell Catalog # BE0089 và BE0090, tương ứng) hai ngày trước khi điều trị ISAC ban đầu, sau đó điều trị hai lần một tuần trong ba tuần. Sự cạn kiệt tế bào trong máu đã được xác nhận bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (Hình 24). Quy trình phân tích uumor Cytokine & mRNA Các khối u được cấy như mô tả trước đó và được thu thập để phân tích tại các thời điểm chỉ định sau điều trị. Đối với phân tích hóa mô miễn dịch và mRNA, các khối u được tách ra, và mRNA được phân tích bằng bảng điều khiển cấu hình miễn dịch ung thư di căn chuột NanoString. Phân tích dữ liệu được thực hiện với Phần mềm Phân tích Nâng cao nSolver theo khuyến nghị của nhà sản xuất. Các đồ thị núi lửa được vẽ bằng gói ggplot2 trong R. Để thu được dịch lọc khối u để phân tích cytokine, các mảnh khối u được giữ trong một chất đệm được tạo sẵn (1 Viên nén ức chế men Pierce (Thermo Fisher, Catalog # A32965) được hòa tan trong 20 mL T- Thuốc thử chiết xuất protein mô PER, Thermo Fisher, Catalog # 78510) trong Ống GentleMACS M (Miltenyi, Catalog # 130-093-236) ngay sau khi mổ. Sau đó, các mẫu khối u được phân tách bằng Máy phân ly GentleMACS Octo. Tất cả các mẫu được kéo nhỏ trong 5 phút ở 300g sau đó. Các chất nổi sau đó được thu thập vào các ống vi li tâm và được quay lại bằng máy li tâm siêu nhỏ. Phân tích cytokine được thực hiện trên các chất nổi trên bề mặt bởi MSD. Hóa mô miễn dịch được thực hiện bằng cách sử dụng hematoxylin và eosin để xác định cấu trúc mô, cũng như các dấu hiệu sau được chỉ định trong các nghiên cứu: CD11c (CST Catalog # 87585) và CD8 (CST Catalog # 98941).

Hình 4: T 785- ISAC tạo ra khả năng miễn dịch chống khối u mạnh mẽ trong các mô hình xenograft khối u kháng trastuzumab. (Ad) chuột SCID / Beige hoặc NSG được cấy với dòng tế bào khối u HCC1954 và được phân ngẫu nhiên khi khối lượng khối u đạt 50 - 75 mm3. (a) Chuột được điều trị trong phúc mạc (IP) một lần với 5 mg / kg trastuzumab T 785- ISAC hoặc trastuzumab, hoặc với liều lượng tương đương theo mol với hỗn hợp trastuzumab và T785 tới ISAC thông qua tiêm trong khoang miệng (IT). Dữ liệu từ một thử nghiệm với n =3-5 con chuột mỗi nhóm. (b) Chuột được điều trị bằng cách tiêm trong phúc mạc với 5 mg / kg trastuzumab, trastuzumab-ISAC,rituximab, hoặc rituximab-ISAC Q5DX6 (n=5 con chuột mỗi nhóm). (c) Chuột được điều trị bằng cách tiêm trong phúc mạc với 5 mg / kg trastuzumab, trastuzumab T 785- ISAC, trastuzumab N297A-ISAC hoặc trastuzumab TLRnull-ISAC (n =5 con chuột mỗi nhóm). (d) Tế bào khối u HCC1954 được cấy vào chuột SCID / Beige và các tế bào quan tâm đã cạn kiệt trước và trong khi điều trị bằng trastuzumab T 785- ISAC (5 mg / kg, Q5DX3) bằng cách sử dụng kháng thể kháng Ly6G (kiểm soát IgG2a ở chuột) , liponat clodronat (liposome kiểm soát như đối chứng) hoặc kháng thể kháng Gr1 (kiểm soát IgG2b của chuột). Dữ liệu từ một thử nghiệm với n =4-6 con chuột mỗi nhóm. (e, f) Chuột loại kép NSG hoặc Rag2 / IL2rg được cấy dòng tế bào khối u JIMT -1 và được phân ngẫu nhiên khi thể tích khối u đạt 50 - 75 mm3. Những con chuột sau đó đã được điều trị bằng các phương pháp điều trị được chỉ định ở liều 5 mg / kg trong phúc mạc với tần số (e) Q5DX6hoặc (f) Q5DX5 (n =3-6 con chuột mỗi nhóm). (bf) Dữ liệu được hiển thị đại diện cho ít nhất hai thử nghiệm. (gj) Các khối u HCC -1954 được thu hoạch từ các nhóm chuột tại các thời điểm được chỉ định sau khi điều trị bằng một liều duy nhất 5 mg / kg ISAC hoặc kháng thể kiểm soát. Các khối u được xử lý để phân tích dòng chảy tế bào, định lượng mRNA NanoString, hoặc cố định formalin và nhúng parafin để hóa mô miễn dịch. (g) Biểu đồ núi lửa mô tả sự thay đổi biểu hiện gen theo lần log2 trong các khối u được điều trị so với đối chứng isotype được đo bằng NanoString vào 24 giờ (n =5 con chuột mỗi nhóm). Các thay đổi có giá trị p được điều chỉnh là <0. 05="" được="" hiển="" thị="" bằng="" màu="" đỏ.="" (h)="" điểm="" số="" chữ="" ký="" gen="" được="" định="" lượng="" bằng="" điểm="" lộ="" trình="" phân="" tích="" nâng="" cao="" nsolver="" cho="" các="" khối="" u="" được="" phân="" tích="" 24="" giờ="" sau="" khi="" điều="" trị="" (n="5" con="" chuột="" mỗi="" nhóm).="" (i)="" phân="" tích="" đo="" tế="" bào="" dòng="" chảy="" của="" thành="" phần="" tế="" bào="" khối="" u="" trong="" 24="" giờ="" và="" 7="" ngày="" sau="" khi="" điều="" trị="" (n="2-4" con="" chuột="" mỗi="" nhóm).="" dữ="" liệu="" đại="" diện="" cho="" ít="" nhất="" 2="" thí="" nghiệm.="" (j)="" hình="" ảnh="" đại="" diện="" cũng="" như="" định="" lượng="" f4="" 80="" và="" cd11c="" ihc="" của="" khối="" u="" được="" thu="" hoạch="" 9="" ngày="" sau="" mỗi="" lần="" điều="" trị="" được="" chỉ="" định.="" các="" vạch="" chia="" độ="" là="" 50="" μm.="" (aj)="" dữ="" liệu="" được="" hiển="" thị="" là="" trung="" bình="" với="" sem="" và="" thống="" kê="" được="" hiển="" thị="" với="" *=""><0.05,><0.01,><0.001,><>

Quy trình thí nghiệm mô hình khối u Syngeneic Tế bào MMC được lấy từ Tiến sĩ Disis (Đại học Washington) và được nuôi cấy trong RPMI 1640 được bổ sung 20 phần trăm FBS, 1 phần trăm penicillin-streptomycin và L-glutamine ở 37 độ và 5 phần trăm CO2 cho đến {{8 }} phần trăm hợp lưu. Tế bào CT26 (ATCC) được chuyển sang protein HER2 của chuột biểu hiện ổn định được phát triển trong RPMI 1640 được bổ sung 10 phần trăm FBS và 600 ug / mL kháng sinh chọn lọc G418 (Thermo) ở 37 độ và 5 phần trăm CO2 cho đến 80-90 phần trăm hợp lưu. Sau khi hợp lưu đủ, các tế bào được thu hoạch bằng cách tách ra bằng Accutase (Stemcell) và rửa bằng PBS. Tế bào thu hoạch được tiếp tục ở 20 x 106 tế bào / mL (MMC)hoặc 5 x 106 tế bào / mL (CT 26- rHER2) trong PBS và giữ ở 4 độ / trên đá cho đến khi sử dụng. 100 μLtế bào lơ lửng được cấy dưới da vào 6-8- FVB / N-TgN (MMTV- Erbb2) NK1Mul / Jmice (mô hình MMC, Phòng thí nghiệm Jackson) hoặc chuột cái BALB / c 6-8- tuần tuổi (mô hình CT26, Phòng thí nghiệm Jackson) . Kích thước khối u được đo và ghi lại hai lầnmột tuần trong suốt thời gian nghiên cứu. Thể tích khối u được ước tính theo công thức sau: (dài x rộng2) / 2. Khi khối u đạt đến kích thước 200-500 mm3 (MMC) hoặc 50-100 mm3 (CT 26- rHER2), thường trong vòng một tuần kể từ khi cấy ghép khối u, các phương pháp điều trị sẽ được bắt đầu. Các con chuột được phân ngẫu nhiên theo kích thước khối u vào các nhóm điều trị trước khi ban đầusự đối đãi. ISAC anti-rHER2 mAb (BioXCell; 7.16.4) hoặc anti-rHER 2- được sử dụng trong phúc mạc (tần suất như được chỉ ra trong chú thích hình) trong suốt thời gian nghiên cứu.Những con chuột có khối u vượt quá 2000 mm3 đã bị chết. Sự suy giảm tế bào T đã được đánh giáở động vật sử dụng kháng thể làm suy giảm tế bào CD4 (BioXCell; GK1.5) hoặc CD8 (BioXCell; YTS 169.4). Sự cạn kiệt được bắt đầu trước khi cấy ghép khối u và tiếp tục với việc sử dụng 200 ug mỗi tuần hai lần cho mỗi kháng thể. Để tái sinh khối u, các dòng tế bào CT26 và 4T1 được cấy ở 5 x 106 tế bào trên mỗi dòng khối u, và những con chuột chưa từng có khối u được thử thách với cả hai dòng tế bào làm đối chứng.

Tài liệu bổ sung Tham khảo phiên bản Web trên PubMed Central để có tài liệu bổ sung Lời cảm ơn: Các tác giả muốn cảm ơn P. Basto, NE Reticker-Flynn, T. Prestwood và B. Mallet vì những thảo luận hữu ích của họ. Chúng tôi cũng cảm ơn Lõi đo tế bào dòng chảy của Trung tâm máu Stanford, cụ thể là L. Tolentino, O. Choi và N.Wu. Chúng tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Tiến sĩ Mary L. (Nora) Disis và Denise Cecil từ Đại học Washington, những người đã cung cấp dòng tế bào khối u MMC.

Tài trợ: SE Ackerman được hỗ trợ bởi Học bổng Stanford BioX Bowes.

Tài liệu tham khảo: 1. Davis TA và cộng sự. Liệu pháp kháng thể đơn dòng Rituximab chống CD20 trong ung thư hạch không Hodgkin: an toàn và hiệu quả của việc điều trị lại. J Clin Oncol 18, 3135–3143, doi: 10.1200 / JCO.2000.18.17.3135 (2000). [PubMed: 10963642] 2. Grillo-Lopez AJ và cộng sự. Rituximab: kháng thể đơn dòng đầu tiên được chấp thuận để điều trị ung thư hạch. Curr Pharm Biotechnol 1, 1–9 (2000). [PubMed: 11467356] 3. Lizotte PH và cộng sự. Cấu hình đa đối xứng của các bệnh ung thư phổi không phải tế bào nhỏ cho thấy các kiểu miễn dịch riêng biệt. JCI Insight 1, e89014, doi: 10.1172 / jci.insight.89014 (2016). [PubMed: 27699239] 4. Spranger S và cộng sự. Mật độ kháng nguyên sinh miễn dịch không giải thích được sự hiện diện hay vắng mặt của vi môi trường khối u viêm tế bào T trong u ác tính. Proc Natl Acad Sci USA 113, E7759– E7768, doi: 10.1073 / pnas.1609376113 (2016). [PubMed: 27837020] 5. Beatty GL & Gladney WL Cơ chế thoát miễn dịch như một hướng dẫn cho liệu pháp miễn dịch ung thư. Clin Cancer Res 21, 687–692, doi: 10.1158 / 1078-0432. CCR -14-1860 (2015). [PubMed: 25501578] 6. Fridman WH, Pages F, Salutes-Fridman C & Galon J Bối cảnh miễn dịch trong khối u ở người: tác động đến kết quả lâm sàng. Nat Rev Cancer 12, 298–306, doi: 10.1038 / nrc3245 (2012). [PubMed: 22419253]

7. Galon J & Bruni D Phương pháp điều trị các khối u nóng, thay đổi và lạnh miễn dịch bằng liệu pháp miễn dịch kết hợp. Nat Rev Drug Discov 18, 197–218, doi: 10.1038 / s 41573-018-0007- y (2019). [PubMed: 30610226] 8. Gabrilovich DI, Ostrand-Rosenberg S & Bronte V Điều hòa phối hợp các tế bào dòng tủy bởi các khối u. Nat Rev Immunol 12, 253–268, doi: 10.1038 / nri3175 (2012). [PubMed: 22437938] 9. Joyce JA & Fearon DT T loại trừ tế bào, đặc quyền miễn dịch và vi môi trường khối u. Science 348, 74–80, doi: 10.1126 / science.aaa6204 (2015). [PubMed: 25838376] 10.Carmi Y và cộng sự. Akt và SHP -1 là các điểm kiểm tra nội tại DC cho khả năng miễn dịch của khối u. JCI Insight 1, e89020, doi: 10.1172 / jci.insight.89020 (2016). [PubMed: 27812544] 11. Carmi Y và cộng sự. IgG dị sinh kết hợp với các kích thích tế bào đuôi gai tạo ra miễn dịch tế bào T kháng u. Nature 521, 99–104, doi: 10.1038 / nature14424 (2015). [PubMed: 25924063] 12. Allen BM và cộng sự. Rối loạn chức năng hệ thống và tính dẻo của vi môi trường miễn dịch trong các mô hình ung thư. Nat Med 26, 1125–1134, doi: 10.1038 / s 41591-020-0892-6 (2020). [PubMed: 32451499] 13. Sagiv-Barfi I và cộng sự. Loại bỏ bệnh ác tính tự phát bằng liệu pháp miễn dịch tại chỗ. Sci Transl Med 10, doi: 10.1126 / scitranslmed.aan4488 (2018) .14. Spitzer MH và cộng sự. Miễn dịch Hệ thống là Cần thiết cho Liệu pháp Miễn dịch Ung thư Hiệu quả. Ô 168, 487–502 e415, doi: 10.1016 / j.cell.2016.12.022 (2017). [PubMed: 28111070] 15. Milhem Mohammed M., Theresa Medina RG, Kirkwood John M., Buchbinder Elizabeth, Mehmi Inderjit, Niu Jiaxin, Shaheen Montaser, Weight Ryan, Margolin Kim, Luke Jason, Morris Aaron, Mauro David, Krieg Arthur M., Ribas Antoni CT { {77}} Chất chủ vận thụ thể giống thụ thể trong khoang miệng (TLR9), CMP -001, kết hợp với pembrolizumab có thể đảo ngược khả năng chống lại sự ức chế PD -1 trong thử nghiệm pha 1b ở những đối tượng bị u ác tính nâng cao (Hội nghị thường niên AACR 2018, 2018) .16. Rook AH Vẻ đẹp của chất chủ vận TLR đối với CTCL. Máu 119, 321–322, doi: 10.1182 / máu -2011-11-391243 (2012). [PubMed: 22247516] 17. Singh M và cộng sự. Miễn dịch chống ung thư hắc tố bẩm sinh và thích ứng hiệu quả thông qua kích hoạtTLR7 / 8 tại chỗ. J Immunol 193, 4722–4731, doi: 10.4049 / J Immunol.1401160 (2014). [PubMed: 25252955] 18. Zhao BG, Vasilakos JP, Tross D, Smirnov D & Klinman DM Liệu pháp kết hợp nhắm vào các thụ thể số 7, 8 và 9 giúp loại bỏ các khối u lớn đã hình thành. J Miễn dịch Ung thư khác 2, 12, doi: 10.1186 / 2051-1426-2-12 (2014). [PubMed: 24982761] 19. Jurk M và cộng sự. TLR7 hoặc TLR8 của con người trao khả năng đáp ứng độc lập với hợp chất kháng vi-rút R -848. Nat Immunol 3, 499, doi: 10.1038 / ni 0602-499 (2002). [PubMed: 12032557] 20. Chattergoon MA và cộng sự. HIV và HCV kích hoạt hệ thống viêm trong bạch cầu đơn nhân và đại thực bào thông qua các thụ thể giống Toll nội mô mà không cảm ứng interferon loại 1. PLoS Pathog 10, e1004082, doi: 10.1371 / journal.bat.1004082 (2014). [PubMed: 24788318] 21. Eigenbrod T. J Immunol 195, 1092–1099, doi: 10.4049 / J Immunol.1403173 (2015). [PubMed: 26101323] 22. Mattson G và cộng sự. Một cách tiếp cận thực tế để liên kết chéo. Mol Biol Rep 17, 167–183 (1993). [PubMed: 8326953] 23. Gabay C, Ben-Bassat H, Schlesinger M & Laskov R Đột biến xôma và các biến thể nội bào trong các gen Vkappa được sắp xếp lại của các dòng tế bào ung thư hạch B-không-Hodgkin. Eur J Haematol 63, 180–191, doi: 10.1111 / j. 1600-0609. 1999.tb01766.x (1999). [PubMed: 10485273] 24. Alonso MN và cộng sự. Tế bào T (H) 1, T (H) 2 và T (H) 17 hướng dẫn các tế bào đơn nhân biệt hóa thành các tập con tế bào đuôi gai chuyên biệt. Máu 118, 3311–3320, doi: 10.1182 / máu -2011-03-341065 (2011). [PubMed: 21813450] 25. Clarke SR và cộng sự. Đặc điểm của dòng chuyển gen TCR đặc hiệu ovalbumin OT-I: Các yếu tố MHC để chọn lọc tích cực và tiêu cực. Immunol Cell Biol 78, 110–117, doi: 10.1046 / j. 1440-1711. 2000.00889.x (2000). [PubMed: 10762410] 26. Zehn D, Lee SY & Bevan MJ Hoàn thành nhưng phản ứng của tế bào T bị hạn chế đối với kháng nguyên ái lực rất thấp. Nature 458, 211–214, doi: 10.1038 / nature07657 (2009). [PubMed: 19182777] 27. Kondratova M và cộng sự. Một bản đồ mạng lưới tín hiệu đa tỷ lệ về phản ứng miễn dịch bẩm sinh trong ung thư cho thấy các dấu hiệu không đồng nhất của tế bào. Nat Commun 10, 4808, doi: 10.1038 / s 41467-019-12270- x (2019). [PubMed: 31641119]

28. Bendall SC và cộng sự. Đo tế bào khối đơn bào về các đáp ứng miễn dịch và thuốc khác nhau trên toàn bộ hệ thống tạo máu của con người. Science 332, 687–696, doi: 10.1126 / science.1198704 (2011). [PubMed: 21551058] 29. Qiu P và cộng sự. Trích xuất hệ thống phân cấp tế bào từ dữ liệu đo tế bào chiều cao với SPADE. Nat Biotechnol 29, 886–891, doi: 10.1038 / nbt.1991 (2011). [PubMed: 21964415] 30.Kawai T & Akira S phát tín hiệu TLR. Cell Death Differ 13, 816–825, doi: 10.1038 / sj.cdd.4401850 (2006). [PubMed: 16410796] 31.Sanchez-Mejorada G & Rosales C Truyền tín hiệu bởi các thụ thể Fc immunoglobulin. J Leukoc Biol 63, 521–533 (1998). [PubMed: 9581795] 32. Krishnaswamy S và cộng sự. Sinh học hệ thống. Phân tích dựa trên mật độ có điều kiện của tín hiệu tế bào T trong dữ liệu đơn bào. Science 346, 1250689, doi: 10.1126 / science.1250689 (2014). [PubMed: 25342659] 33. Kiefer F và cộng sự. Syk protein tyrosine kinase cần thiết cho việc truyền tín hiệu của thụ thể Fcgamma trong đại thực bào và bạch cầu trung tính. Mol Cell Biol 18, 4209–4220 (1998). [PubMed: 9632805] 34. Braselmann S và cộng sự. R406, một chất ức chế tyrosine kinase lá lách có sẵn bằng đường uống ngăn chặn tín hiệu thụ thể Fc và làm giảm viêm qua trung gian phức hợp miễn dịch. J Pharmacol Exp Ther 319, 998– 1008, doi: 10.1124 / jpet.106.109058 (2006). [PubMed: 16946104] 35. Bruhns P và cộng sự. Tính đặc hiệu và ái lực của các thụ thể Fcgamma ở người và các biến thể đa hình của chúng đối với phân lớp IgG của người. Máu 113, 3716–3725, doi: 10.1182 / máu -2008-09-179754 (2009). [PubMed: 19018092] 36. Nimmerjahn F & Ravetch JV Divergent immunoglobulin g hoạt động thông qua liên kết chọn lọc thụ thể Fc. Science 310, 1510–1512, doi: 10.1126 / science.1118948 (2005). [PubMed: 16322460] 37. Jefferis R Phương pháp điều trị bằng kháng thể tái tổ hợp: tác động của quá trình glycosyl hóa lên cơ chế hoạt động. Xu hướng Pharmacol Sci 30, 356–362, doi: 10.1016 / j.tips.2009.04.007 (2009). [PubMed: 19552968] 38. Tanji H, Ohio U, Shibata T, Miyake K & Shimizu T Tổ chức lại cấu trúc của thụ thể giống Toll 8 dimer do các phối tử chủ động gây ra. Science 339, 1426–1429, doi: 10.1126 / science.1229159 (2013). [PubMed: 23520111] 39. Shultz LD và cộng sự. Sự phát triển tế bào bạch huyết và tế bào dòng tủy của con người ở chuột Null IL2R gamma NOD / LtSz cho biết được khắc với các tế bào gốc tạo máu được huy động của con người. J Immunol 174, 6477–6489, doi: 10.4049 / J Immunol.174.10.6477 (2005). [PubMed: 15879151] 40. Xia Z và cộng sự. Đáp ứng miễn dịch bẩm sinh đối với việc cấy tế bào nguyên bào sợi tủy xương của con người vào CB17 SCID / chuột màu be. J Cell Biochem 98, 966–980, doi: 10.1002 / jcb.20730 (2006). [PubMed: 16795075] 41. Tanner M và cộng sự. Đặc điểm của một dòng tế bào mới được thiết lập từ một bệnh nhân bị ung thư vú kháng Herceptin. Mol Cancer Ther 3, 1585–1592 (2004). [PubMed: 15634652] 42.Luque-Cabal M, Garcia-Teijido P, Fernandez-Perez Y, Sanchez-Lorenzo L & Palacio-Vazquez I Cơ chế đằng sau sự kháng thuốc với Trastuzumab trong HER 2- Ung thư vú Khuếch đại và Các biện pháp để vượt qua Nó. Clin Med Insights Oncol 10, 21–30, doi: 10.4137 / CMO.S34537 (2016). [PubMed: 27042153] 43. Li JY và cộng sự. Biparatopic HER 2- Sự kết hợp thuốc-kháng thể nhắm mục tiêu gây ra sự thoái lui khối u ở các mô hình chính Chịu được hoặc Không đủ điều kiện cho Liệu pháp Nhắm mục tiêu HER 2-. Tế bào ung thư 29, 117– 129, doi: 10.1016 / j.ccell.2015.12.008 (2016). [PubMed: 26766593] 44. Ning S, Pagano JS & Barber GN IRF7: kích hoạt, quy định, sửa đổi và chức năng. Genes Immun 12, 399–414, doi: 10.1038 / gene.2011.21 (2011). [PubMed: 21490621] 45. Cao Q và cộng sự. F4 / 80 của thận cộng với CD11c cộng với thực bào đơn nhân hiển thị các đặc điểm kiểu hình và chức năng của đại thực bào về sức khỏe và bệnh thận do adriamycin. J Am Soc Nephrol 26, 349–363, doi: 10.1681 / ASN.2013121336 (2015). [PubMed: 25012165] 46. Sheng J và cộng sự. Một tập hợp con rời rạc của các tế bào có nguồn gốc monocyte trong số các tế bào đuôi gai loại 2 thông thường điển hình có thể hiện diện chéo một cách hiệu quả. Ô Đại diện 21, 1203–1214, doi: 10.1016 / j.celrep.2017.10.024 (2017). [PubMed: 29091760]

47. Knutson KL, Almand B, Dang Y & Disis ML Các biến thể âm tính với kháng nguyên Neu có thể được tạo ra sau khi điều trị bằng kháng thể đặc hiệu neu ở chuột chuyển gen neu. Ung thư Res 64, 1146–1151 (2004). [PubMed: 14871850] 48. Moynihan KD và cộng sự. Loại bỏ các khối u lớn đã hình thành ở chuột bằng liệu pháp miễn dịch kết hợp tham gia vào các phản ứng miễn dịch bẩm sinh và thích ứng. Nat Med 22, 1402–1410, doi: 10.1038 / nm.4200 (2016). [PubMed: 27775706] 49.Siebenlist U, Franzoso G & Brown K Cấu trúc, quy định và chức năng của NF-kappa B. Annu Rev Cell Biol 10, 405–455, doi: 10.1146 / annurev.cb.10.110194.002201 (1994) . [PubMed: 7888182]

Hình 6: CL 264- chứa ISAC gợi ra sự thanh thải khối u trong môi trường HER2 biểu hiện xenografts và thanh thải khối u qua trung gian tế bào T, bộ nhớ miễn dịch và sự lan rộng của biểu mô trong một mô hình khối u khớp. (a) Cấu trúc hóa học của tá dược T785 và CL264 được sử dụng để tạo ISAC. (b) Những con chuột NSG được cấy dòng tế bào khối u HCC1954 được phân ngẫu nhiên khi thể tích khối u đạt 50 - 75 mm3. Chuột được điều trị một lần bằng cách tiêm vào màng bụng 5 mg / kg trastuzumab, trastuzumab T 785- ISAC hoặc trastuzumab CL 264- ISAC. Các khối u được thu hoạch 20 giờ sau khi dùng thuốc, xử lý thành huyền phù tế bào đơn lẻ, và phân tích bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy để đánh giá sự hoạt hóa của APC dòng tủy thâm nhiễm khối u. (cd) Chuột loại kép NSG hoặc Rag2 / IL2rg được cấy với dòng tế bào khối u của người được chỉ định và được phân ngẫu nhiên khi thể tích khối u đạt 50 - 75 mm3 (HCC1954) hoặc 75 - 150 mm3 (JIMT -1). Chuột được điều trị bằng cách tiêm trong phúc mạc với 5 mg / kg rituximab, trastuzumab, trastuzumab T 785- ISAC, trastuzumab CL 264- ISAC hoặc isotype tương ứng-ISAC, cứ 5 ngày một lần trong tổng số 6 lần điều trị. (e) biểu hiện rHER2 được đo trên CT 26- tế bào khối u rHER2 trong nuôi cấy trước khi cấy (biểu đồ dòng bên trái) và trong các khối u chín ngày sau khi cấy ghép (biểu đồ dòng bên phải) bằng phương pháp đo tế bào với kháng thể kháng rHER2 liên hợp huỳnh quang (đỏ) hoặc điều khiển isotype (xanh lam). (f) Chuột Balb / c được cấy dòng tế bào khối u CT 26- rHER2 và được chọn ngẫu nhiên khi thể tích khối u đạt 50mm3. Chuột sau đó được điều trị bằng cách tiêm trong phúc mạc với 10 mg / kg thuốc chống chuộtHER2 hoặc thuốc chống chuột HER2 CL 264- ISAC cứ 5 ngày một lần trong tổng số 6 lần điều trị. Dữ liệu được hiển thị từ 1 thí nghiệm với 8 con chuột trên mỗi cánh tay và là đại diện cho 3 thí nghiệm.

(g) Anti-rat HER2 CL264-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >21 ngày sau lần điều trị cuối cùng của họ được thử thách với các dòng tế bào CT26 của cha mẹ (sườn trái) và 4T1 (sườn phải), có hoặc không có sự suy giảm tế bào T CD4 và CD8 (n =3 mỗi dòng). Những con chuột chưa biết về khối u (n=6) đã thử thách với dòng tế bào CT26 và 4T1 của bố mẹ được đưa vào làm đối chứng. (ai) Dữ liệu được hiển thị từ các thử nghiệm riêng lẻ với 3-6 con chuột trên mỗi nhánh và là đại diện cho 1-4 thử nghiệm với tối thiểu 3 con chuột trên mỗi nhánh trong mỗi thử nghiệm. Dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình với SEM và thống kê được hiển thị bằng * P<><0.01,><0.001, and=""><>

50. Vogelpoel LT và cộng sự. Trao đổi chéo FcgammaRIIa với TLRs, IL -1 R và IFNgammaR điều chỉnh chọn lọc sản xuất cytokine trong tế bào tủy sống của người. Sinh học miễn dịch 220, 193–199, doi: 10.1016 / j.imbio.2014.07.016 (2015). [PubMed: 25108563] 51. Daley JM, Thomas AA, Connolly MD, Reichner JS & Albina JE Sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu Ly6G để làm cạn kiệt bạch cầu trung tính ở chuột. J Leukoc Biol 83, 64–70, doi: 10.1189 / jlb.0407247 (2008). [PubMed: 17884993] 52. Broz ML và cộng sự. Bóc tách khoang chứa tủy của khối u cho thấy các tế bào trình diện kháng nguyên kích hoạt hiếm gặp, rất quan trọng đối với miễn dịch tế bào T. Tế bào ung thư 26, 938, doi: 10.1016 / j.ccell.2014.11.010 (2014) .53. Spranger S, Dai D, Horton B & Gajewski TF Tế bào đuôi gai Batf3 trú ngụ cần thiết cho việc buôn bán tế bào Effector T và liệu pháp tế bào T được áp dụng. Tế bào ung thư 31, 711–723 e714, doi: 10.1016 / j.ccell.2017.04.003 (2017). [PubMed: 28486109] 54. Zunder ER và cộng sự. Mã vạch tế bào thẻ khối dựa trên palađi với sơ đồ lọc kép và thuật toán giải mã tế bào đơn. Nat Protoc 10, 316–333, doi: 10.1038 / nprot.2015.020 (2015). [PubMed: 25612231]