Kháng thể kích thích miễn dịch Liên kết kích thích tủy bào mạnh mẽ và khả năng miễn dịch chống khối u lâu bền （Phần 1）

Để tìm hiểu thêm thông tin, xin vui lòng liên hệdavid.wan@wecistanche.com

trừu tượng

Các thụ thể nhận dạng mẫu bẩm sinh, bao gồm cả các thụ thể giống như số điện thoại (TLR), có thể thay đổi vi môi trường khối u và khả năng miễn dịch chống khối u thích ứng chính.Tuy nhiên, chất chủ vận TLR không được dung nạp tốt do độc tính liên quan đến hoạt hóa miễn dịch lan rộng sau khi dùng toàn thân.Để thiết kế một liệu pháp phù hợp cho việc phân phối toàn thân vàcó khả năng tạo ra phản ứng nhắm vào khối u, chúng tôi đã phát triển một lớp mới gồm các liên hợp kháng thể kích thích miễn dịch (ISAC) bao gồm chủ vận TLR7 / 8 được liên hợp với các kháng thể nhắm vào khối u.ISAC chống HER2 được sử dụng một cách hệ thống được dung nạp tốt trong cơ thể sống và kích thích sự hoạt hóa mạnh mẽ của các tế bào tủy nội tạng, dẫn đến xóa bỏ khối u và ghi nhớ miễn dịch sau đó.Hiệu quả in vitro và hiệu quả in vivo yêu cầu hoạt động song song được thúc đẩy bởi chức năng Fc nguyên vẹn và chủ nghĩa TLR để cho phép thực bào và miễn dịch chống khối u qua trung gian tế bào T.Trí nhớ miễn dịch qua trung gian ISAC không giới hạn ở HER2, vì những con chuột được điều trị bằng ISAC được bảo vệ khỏi sự tái sinh với khối u HER 2- âm tính.Những kết quả này cung cấp cơ sở lý luận vững chắc cho sự phát triển lâm sàng của ISAC và cho thấy rằng sức mạnh tổng hợp giữa tín hiệu Fc R và TLR7 / 8 góp phần vào cơ chế miễn dịch chống khối u qua trung gian ISAC.

Bấm vào đây để tìm hiểu thêm về Cistanche

Giới thiệu

Trước cuối thế kỷ 20, bệnh nhân ung thư thường có sẵn ba phương thức điều trị: phẫu thuật cắt bỏ, xạ trị và hóa trị. Sự xuất hiện của liệu pháp miễn dịch ung thư đã bổ sung thêm một phương thức thứ tư mạnh mẽ giúp mở rộng đáng kể danh mục bệnh ung thư bắt đầu với việc phê duyệt rituximab cho bệnh ung thư hạch không Hodgkin và mở rộng đến việc áp dụng rộng rãi các chất ức chế trạm kiểm soát 1,2. Tuy nhiên, bất kỳ liệu pháp nào, bao gồm cả liệu pháp miễn dịch, đều bị hạn chế về mặt thời gian trừ khi nó tạo ra các đáp ứng sinh học và miễn dịch bền vững giúp khắc phục tính không đồng nhất của khối u và gánh nặng đột biến 3-5. Các chất ức chế điểm kiểm tra như kháng thể kháng PD -1 và PD-L1 cải thiện đáng kể kết quả trong một số chỉ định, bao gồm cả ở những bệnh nhân có gánh nặng đột biến khối u cao hoặc sự không ổn định của tế bào vi mô, và một yếu tố quyết định tính nhạy cảm của khối u đối với liệu pháp miễn dịch điểm kiểm tra là mức độ trước -sự xâm nhập tế bào T tồn tại. Bệnh nhân có khối u "lạnh" có thâm nhiễm tế bào T thưa thớt ít đáp ứng với phong tỏa điểm kiểm tra và có tiên lượng kém hơn so với bệnh nhân có khối u "nóng" có tế bào T phản ứng với khối u bị ức chế miễn dịch hiện diện trong vi môi trường khối u (TME) 6,7 . Sinh thiết khối u và hóa mô miễn dịch chỉ ra rằng các tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp (APC) như tế bào đuôi gai (DC) thường nằm trong TME nhiều hơn tế bào T, mặc dù vẫn nhạy cảm với các cơ chế ức chế miễn dịch 8,9. Với sự hiện diện của các tế bào dòng tủy trong TME và vai trò của chúng trong việc thúc đẩy hoạt hóa tế bào T, ngày càng có nhiều nỗ lực phát triển các liệu pháp kích hoạt các APC liên quan đến khối u để tạo ra miễn dịch tế bào T rộng rãi và đáp ứng miễn dịch chống khối u hiệu quả.

Figure 1: ISAC Design and Characterization. (a) Chemical structure of T785 (b) HEK-Blue-TLR7 or TLR8 reporter cells were cultured for 18 hours in the presence of T785, R848, or Poly-ICLC before the assessment of NF-κB- induced SEAP activity. Data shown are from 8 experiments and EC50 values are calculated as mean with SEM. (c) Freshly isolated human myeloid APCs were stimulated with 1 μM of T785 or R848 for 18 hours before the assessment of myeloid activation by flow cytometry. Data are from 1 experiment with 3 donors and are representative of >9 nhà tài trợ. (d) Rituximab được phản ứng với SATA thông qua dư lượng lysine để chuyển các amin tự do thành các nhóm sulfhydryl được bảo vệ trước khi khử oxy hóa với hydroxylamine và phản ứng tiếp theo với T 785- MCC để tạo ra rituximab-ISAC. (e) Phân tích LC-MS của rituximab-ISAC sau xử lý PNGase F. DAR được tính toán dựa trên việc bổ sung khối lượng chất liên kết-chủ vận là 606 g / mol. (f) Rituximab hoặc rituximab-ISAC được đánh dấu huỳnh quang được ủ với CD20 cộng với các tế bào khối u Toledo ở 4 độ trong 2 giờ trước khi phân tích bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy. Dữ liệu từ 1 thí nghiệm với các mẫu ba lần và đại diện cho 2 thí nghiệm.(gh) APC dòng tủy người mới được phân lập được nuôi cấy với rituximab, T785, rituximab và T785 hoặc rituximab-ISAC với sự hiện diện của tế bào khối u Toledo được đánh dấu CFSE CD20 với tỷ lệ 3: 1 cho tỷ lệ tác động đến mục tiêu. Nồng độ rituximab được mô tả trên trục X với nồng độ T785 trong các xét nghiệm này phù hợp với lượng T785

conjugated to the rituximab-ISAC. (g) Hoffman modulation contrast microscopy showed at 40X magnification after (g) 18 hours following stimulation with 80 nM of rituximab-ISAC. Data are representative of >10 donors. (h) Myeloid APCs were analyzed via flow cytometry 18 hours after stimulation. Data shown are from 3 donors and are representative of >10 nhà tài trợ (trung bình và SEM); *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

Hiện đã có tài liệu chứng minh rằng việc phân phối tại chỗ các tác nhân kích thích miễn dịch trong các mô hình tiền lâm sàng có thể tái lập trình các APC thường trú của khối u bị ức chế thành các tế bào hoạt hóa có khả năng xử lý và trình bày các kháng nguyên liên quan đến khối u, bao gồm cả các chất tân sinh, đến các tế bào T sau đó làm trung gian miễn dịch chống khối u 10–13 . Một chiến lược như vậy được tiên phong bởi Carmi và cộng sự đã chứng minh rằng phân phối trong khoang của các kháng thể nhắm mục tiêu khối u dị nguyên bằng chất chủ vận thụ thể giống Toll (TLR) -3 hoặc với TNF và CD40L có chức năng giải cứu các APC liên quan đến khối u dẫn đến tăng cường hấp thu kháng nguyên và tiếp theo là cảm ứng miễn dịch tế bào T chống khối u. Chiến lược kết hợp này, tận dụng chức năng của hiệu ứng kháng thể với chất chủ vận TLR, dẫn đến việc loại bỏ các khối u nguyên phát và các tổn thương di căn và bảo vệ vật chủ khỏi sự tái phát của khối u 11,14. Tương tự, kháng thể kháng OX40 chủ động kết hợp với chất chủ vận TLR9, CpG, các APC và tế bào T được kích hoạt trong khối u, dẫn đến hiệu quả ấn tượng chống lại nhiều loại khối u ở chuột. được nghiên cứu trong nhiều chỉ định với dữ liệu lâm sàng ở bệnh nhân u ác tính cho thấy rằng việc phân phối chất chủ vận TLR9 trong khối u kết hợp với kháng thể kháng PD -1 có thể dẫn đến sự co lại của khối u và đáp ứng của khối u ở các tổn thương không được tiêm thuốc 15. Tương tự, một số các nhóm đang theo đuổi chất chủ vận TLR7 / 8 cho liệu pháp miễn dịch khối u vì mô hình biểu hiện của TLR7 / 8 ở APC của người phản ánh gần hơn với mô hình biểu hiện của TLR7 và TLR9 ở APC 16–18 của chó. Cuối cùng, việc áp dụng các chiến lược phân phối trong khối u, nếu có hiệu quả, sẽ bị hạn chế bởi khả năng tiếp cận khối u vì việc phân phối toàn thân các chất chủ vận miễn dịch nhắm vào APC đã bị hạn chế bởi độc tính, thời gian bán hủy ngắn và phân phối dưới mức tối ưu đến các vị trí đích.Mục tiêu của chúng tôi là thiết kế liên hợp kháng thể kích thích miễn dịch (ISAC) bao gồm kháng thể đơn dòng nhắm mục tiêu khối u được liên hợp với chất chủ vận miễn dịch như một phương pháp điều trị mới để tạo ra miễn dịch bền chống khối u. Việc quản lý hệ thống ISAC đã kích hoạt APC được bản địa hóa trong TME phụ thuộc vào Fcchức năng hiệu ứng và kích hoạt TLR trong khi ngăn chặn các độc tính điển hình liên quan đến việc cung cấp chất chủ vận TLR toàn thân. Hơn nữa, việc sử dụng toàn thân các liên hợp này cho chuột mang khối u cho phép xử lý và trình bày kháng nguyên tới các tế bào T dẫn đến khả năng miễn dịch chống khối u bền vững trong nhiều mô hình có khả năng chống lại kháng thể nhắm mục tiêu khối u không liên hợp.

Kết quả

Thiết kế và đặc tính của ISAC Để cho phép liên hợp chất chủ vận TLR với kháng thể, các công cụ gắn kết phân tử đã được sử dụng để thiết kế chất chủ vận TLR7 / 8 mới (T785) với butyl-amin đóng vai trò là điểm gắn vào kháng thể có thể tiếp cận được với dung môi ( Hình 1A, Hình bổ sung 1A – C). T785 tham gia vào TLR7 của người với EC5 0 0,643 μM và TLR8 của người với EC50 là 1,60 μM trong các dòng tế bào HEK293 cùng biểu hiện một phóng viên phosphatase kiềm tiết ra NF-κB và TLR7 hoặc TLR8 (Hình 1B ). Tính đặc hiệu của T785 đối với TLR7 / 8 đã được xác nhận bởi T785 không có khả năng gây ra hoạt động NF-κB trong các tế bào báo cáo HEK293 thiếu biểu hiện TLR7 / 8 (Hình 2A bổ sung). Để xác nhận hoạt động chủ động trong các tế bào sơ cấp, các bạch cầu đơn nhân và DC mới được phân lập, được gọi là APC dòng tủy (~ 96% bạch cầu đơn nhân, 4% DC; Hình 3A bổ sung), biểu hiện cả TLR7 và TLR8, được kích thích qua đêm với 1 μM T785 hoặc R848, a Chất chủ vận TLR7 / 8 được thiết lập tốt và đặc trưng 19. T785 và R848 kích thích các APC dòng tủy ở mức độ tương tự (Hình 1C) 20,21. Hoạt tính của T785 cũng được xác nhận trong các DC plasmacytoid mới phân lập ở người (pDC), biểu hiện TLR7 nhưng không biểu hiện TLR8 (Hình 2B bổ sung). Để điều tra tác động của ISAC trong nuôi cấy in vitro ở người, ISAC đã được tạo ra với rituximab (Hình 1D), một kháng thể đơn dòng kháng CD20 đã được xác nhận lâm sàng được sử dụng để điều trị các khối u ác tính tế bào B, bằng cách liên hợp với T785 trong một phản ứng nhiều bước với các liên kết chéo dị chức năng tương thích 22. T 785- Hiệu suất liên hợp ISAC được đo bằng LC-MS sau khi khử oxy hóa bằng PNGase F, dẫn đến tỷ lệ thuốc trên kháng thể (DAR) trung bình là 1,71 (Hình 1E). Chúng tôi xác nhận rằng ISAC vẫn giữ liên kết có thể so sánh được với CD20 sau các thí nghiệm đo tế bào dòng chảy với CD 20- biểu hiện dòng tế bào khối u Toledo, một dòng tế bào có đặc điểm tốt bắt nguồn từ một bệnh nhân mắc bệnh u lympho tế bào lớn lan tỏa (Hình 1F) 23. T 785- ISAC liên kết với các thụ thể Fc của người (FCGR3A, FCGR2A, FCGR2B, FCGR1) đã được Biacore đánh giá và có thể so sánh với rituximab (Bảng bổ sung 1) .ISAC kích hoạt các APC dòng tủy của người Tiềm năng kích thích miễn dịch của rituximab T {{77 }} ISAC được đánh giá sau khi nuôi cấy các APC dòng tủy người mới được phân lập với CD20 được đánh dấu CFSE cộng với các tế bào khối u Toledo trong 18 giờ. Các APC dòng tủy được nuôi cấy bằng rituximab T 785- ISAC trải qua những thay đổi hình thái nhanh chóng phù hợp với hình thái của DC, trong khi hình thái DC thì không quan sát thấy trong các môi trường nuôi cấy được ủ với rituximab, T785 hoặc hỗn hợp đẳng cực của rituximab, và T785 (Hình 1G). Các APC được kích thích bằng rituximab T 785- ISAC vẫn tồn tại và có hình thái đuôi gai trong tối đa tám ngày trong khi các APC được kích thích bằng hỗn hợp này hầu như không tồn tại vào ngày thứ tám (Hình 1H). Phân tích đo tế bào dòng chảy nhiều màusau 18 giờ chỉ ra rằng APC được kích thích bằng rituximab T 785- ISAC điều chỉnh giảm CD14 và CD16 và đồng thời CD123 được điều chỉnh, một điểm đánh dấu bề mặt tế bào cho thấyđược điều chỉnh tối đa trên các DC tủy sống đã được kích hoạt 24. Ngược lại, các APC được kích thích bằng rituximab,T785 hoặc hỗn hợp không điều chỉnh sự biểu hiện của các điểm đánh dấu này (Hình 1I, Hình 4A bổ sung, chiến lược gating được mô tả trong Hình 3BC bổ sung).

APC của con người được kích thích bằng rituximab T 785- ISAC cũng điều chỉnh phân tử điều hòa CD 86 theo cách phụ thuộc vào liều lượng, với các xu hướng tương tự được quan sát thấy với sự điều chỉnh tăng CD40 và HLA-DR phù hợp với kiểu hình của các APC được kích hoạt (Hình 1I & Bổ sung Hình 4B). Những thay đổi phụ thuộc vào liều lượng trong biểu hiện dấu hiệu bề mặt là nhất quán cho dù được đánh giá là cường độ huỳnh quang trung bình (MFI, Hình 1) hay là phần trăm của tổng số tế bào dương tính với dấu hiệu tương ứng (Hình 5). Phân tích sau đó đối với các chất nổi không có tế bào đã chứng minh rằng các APC do rituximab T 785- ISAC kích thích tiết ra số lượng TNF và IL cao hơn -1 (Hình 2J và Hình 4C bổ sung). Tiềm năng kích thích miễn dịch của T 785- ISAC không bị giới hạn ở rituximab, vì T 785- ISAC được tạo ra với trastuzumab cũng kích thích tăng cường hoạt hóa dòng tủy (Hình 4D bổ sung). Khả năng của các APC được ISAC kích thích để thu hút sự trình bày kháng nguyên và bắt mồi chéo của tế bào T CD8 cộng được đánh giá bằng cách sử dụng hệ thống kháng nguyên mô hình ovalbumin (OVA) 25,26. Splenic CD11c cộng với DC được phân lập từ chuột kiểu hoang dã được nuôi cấy qua đêm với các phức hợp miễn dịch được tạo thành với OVA và kháng thể kháng OVA hoặc ISAC. Các DC nạp OVA được định lượng và ủ với OT-I CD8 cộng với các tế bào T mang đặc tính TCR cho peptide OVA, SIINFEKL, được tạo phức với MHC-I. Trình bày chéo tăng cường qua trung gian ISAC của Anti-OVA, được đo bằng lượng MHC-I, SIINFEKL peptide liên kết và tăng cường mồi chéo được đo bằng CD8 cộng với sự tăng sinh tế bào T (Hình bổ sung 6A & 6B) .ISAC gợi ra TLR khuếch đại và tín hiệu nội bào liên quan đến Fc R trong APC dòng tủy của con người Kích hoạt Fc R và TLR tạo ra một dòng tín hiệu phospho phức tạp, và cường độ và đặc điểm của những phản ứng này khác nhau giữa các tập hợp con tế bào miễn dịch khác nhau 27. Chúng tôi đã nghiên cứu các con đường tín hiệu nội bào xuôi dòng tham gia vào nhiều các loại tế bào trong hệ thống nuôi cấy khối u PBMC được kích thích bằng rituximab T 785- ISAC so với các đối chứng hỗn hợp đẳng cực bằng cách sử dụng phương pháp đo tế bào khối (CyTOF) 28. Phân nhóm bạch cầu (tức là bạch cầu đơn nhân, tế bào CD4 cộng với tế bào T) được xác định thông qua phân nhóm SPADE sử dụng dấu dòng với các tế bào đích bao gồm cả CD20 cộng với tế bào khối u Toledo và tế bào B khỏe mạnh 29. Sự kiện phosphoryl hóa liên quan đến tín hiệu TLR (pIRF7) và Fc R (pERK1 / 2) đã tăng lên 15 phút sau khi kích thích với T 785- ISAC trong bạch cầu đơn nhân và cDC, so với hỗn hợp thành phần riêng lẻ 30,31. Tín hiệu nội bào phần lớn bị hạn chế đối với các tế bào có nguồn gốc tủy (bạch cầu đơn nhân và cDCs) cũng như pDCs,tất cả đều thể hiện Fc Rs và TLR7 và / hoặc TLR8 cần thiết. Trong tế bào đơn nhân và cDCs, sự kích thích do ISAC gây ra cũng dẫn đến sự phosphoryl hóa cao hơn đáng kể của MAPKAPK2, p38, CREB và protein ribosome S6 (RPS6), một yêu cầu để bắt đầu tổng hợp protein hạ nguồn (Hình 2A – C & Hình 7A). CD141 cộng với cDC và CD1c cộng với cDC cho thấy mức độ tương đương của pIRF7 trên cả hai tập hợp con CDC, trong khi mức RPS6 và pERK1 / 2 có xu hướng cao hơn ở CD141 cộng với cDCs, vượt trội trong CD8 cộng với mồi tế bào T và trình bày chéo kháng nguyên, so với CD1c cộng với cDCs (Hình 7B bổ sung).

Động học của kích thích T 785- ISAC phù hợp với động lực phát tín hiệu dự kiến: quá trình phosphoryl hóa ERK1 / 2 đạt đỉnh sau 5 phút, trong khi đối tác hạ nguồn của nó RPS6 không đạt mức phosphoryl hóa cao nhất cho đến thời điểm 15- phút (Bổ sung Hình 7C). Động học này hỗ trợ động lực dự kiến ​​khi tín hiệu lan truyền theo thời gian và gợi ý rằng có một phản ứng tín hiệu được duy trì và khuếch đại đối với kích thích ISAC của APC. Với phản ứng khuếch đại được quan sát sau khi kích thích ISAC kết hợp với các đường dẫn tín hiệu Fc R và TLR, tiếp theo, chúng tôi sử dụng các thuật toán Ước tính thông tin tương hỗ được lấy mẫu lại theo mật độ có điều kiện (DREMI) và các thuật toán Hình ảnh hóa thay đổi tỷ lệ có điều kiện (DREVI) để định lượng độ mạnh của các mối quan hệ theo cặp trong các đường dẫn tín hiệu Fc R và TLR 32. Các thuật toán này tạo ra các đồ thị DREVI để trực quan hóa, trong đó diện tích dưới đường cong (AUC) là chỉ báo về cường độ tín hiệu tổng thể, điểm uốn (IP) là thước đo ngưỡng kích hoạt và Điểm DREMI định lượng sự phụ thuộc theo cặp của hai phosphoprotein được đề cập. Phân tích này xác định điểm DREMI tăng lên cho thấy sự phụ thuộc từng cặp tăng cường giữa các protein liên quan đến các con đường tín hiệu Fc R và TLR sau khi kích thích ISAC T 785- so với các đối chứng hỗn hợp đẳng cực (Hình 2D). Sự phụ thuộc lẫn nhau mạnh mẽ giữa pERK1 / 2 và pIRF7 được quan sát thấy duy nhất sau khi kích thích với T 785- ISAC, nhưng không phải hỗn hợp, như được chỉ ra bởi điểm DREMI tăng, cường độ tín hiệu được khuếch đại và ngưỡng kích hoạt giảm cần thiết cho quá trình phosphoryl hóa IRF7 (Hình 2D ). Phân tích này cũng chỉ ra ngưỡng kích hoạt giảm cần thiết để bắt đầu dịch protein (phosphoryl hóa RPS6) sau khi kích thích ISAC được định lượng bằng điểm DREMI tăng và IP giảm đối với sự kết hợp từng cặp của pERK1 / 2- pRPS6 và pIRF 7- pRPS6 . Hơn nữa, mức độ phosphoryl hóa RPS6 được khuếch đại do kết quả của quá trình phosphoryl hóa ERK1 / 2 hoặc IRF7 được xác định bằng cách tăng AUC từng cặp (Hình 2D). Các kết quả kết hợp này không chỉ xác nhận tín hiệu của ISAC thông qua các con đường Fc R và TLR dự kiến ​​mà hơn nữa, hỗ trợ sức mạnh tổng hợp giữa hai con đường dẫn đến giảm ngưỡng kích hoạt và cường độ tín hiệu được khuếch đại.

Hình 3: Các ISAC yêu cầu chức năng hiệu ứng Fc và chất chủ vận TLR để làm trung gian hoạt hóa dòng tủy. của rituximab-ISAC có hoặc không có 1 μM R406, (b) rituximab-ISAC trên isotype kháng thể được chỉ định, (c) rituximab-ISAC hoặc rituximab-ISAC đã được khử oxy hóa (ISAC-deglycosylated). (ac) Tế bào được phân tích bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy và dữ liệu được báo cáo dưới dạng cường độ huỳnh quang trung bình. (d) Tế bào báo cáo HEK-Blue-TLR7 hoặc TLR8 được nuôi cấy trong 18 giờ với sự hiện diện của T785 hoặc TLRnull trước khi đánh giá hoạt động SEAP do NF-κB gây ra. Dữ liệu được hiển thị làtừ 1 thí nghiệm và đại diện của ít nhất 3 thí nghiệm. (e) APC dòng tủy người mới phân lập được nuôi cấy trong 18 giờ với sự hiện diện của CD20 cộng với tế bào khối u Toledo và rituximab-ISAC được chỉ định và được phân tích bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung vịcường độ huỳnh quang). (ae) Dữ liệu được hiển thị đại diện cho 1-4 thử nghiệm bổ sung và Lớn hơn hoặc bằng 3 nhà tài trợ cho mỗi thử nghiệm (trung bình và SEM). Ý nghĩa thống kê được định nghĩa là * P<0.05,><0.01,><0.001,><>

ISAC yêu cầu chức năng hiệu ứng Fc để làm trung gian kích hoạt các APC dòng tủy Đóng góp của hoạt động Fc vào chức năng ISAC đã được nghiên cứu sau khi cắt bỏ tín hiệu Fc R hạ nguồn với R406, một chất ức chế kinase phân tử nhỏ của Syk ngăn cản quá trình truyền tín hiệu xuống phía dưới của Fc Rs kích hoạt 33,34 . Việc bổ sung R406 đã loại bỏ sự hoạt hóa dòng tủy qua trung gian T 785- ISAC được chứng minh bằng sự thiếu điều hòa của phân tử kích thích vũ trụ CD 86 nhưng không làm thay đổi phản ứng của tế bào đối với sự kích hoạt TLR7 / 8 bởi T785 (Hình 3A & Bổ sung Hình 8). Sự ức chế syk với R406 cũng bị bãi bỏ tín hiệu đã được quan sát thấy trong các tế bào đơn nhân sau khi kích thích T 785- ISAC, vớigiảm đáng kể mức MAPKAPK được phosphoryl hóa -2, ERK1 / 2 và IRF7 đo được (Hình 7D bổ sung).Với những dữ liệu này, ISAC của rituximab T 785- đã được xây dựng với các DAR có thể so sánh được trên mỗi trong số bốn isotype xuất hiện tự nhiên để xác định mức độ hoạt động của T 785- ISAC thay đổi theo các ái lực liên kết Fc R đã biết 35,36. Các ISAC của rituximab được aglycosyl hóa và fucosyl hóa cũng được nghiên cứu, vì quá trình glycosyl hóa loại bỏ liên kết Fc R trong khi fucosyl hóa làm tăng ái lực liên kết với FCGR3A 37. Khả năng kích thích miễn dịch của rituximab T 785- ISAC tương quan với ái lực Fc R của isotype kháng thể (Hình 3B). Ngược lại, IgG1 được fucosyl hóa (IgG 1- AF), IgG1 kiểu dại và IgG3 T 785- ISAC gây ra sự hoạt hóa dòng tủy, với ISAC IgG 1- AF T 785- gây ra mức cao nhất mức điều chỉnh CD 86 (Hình 3B). Deglycosyl hóa rituximab T 785- ISAC kiểu dại bằng PNGase F, làm giảm ái lực liên kết Fc-Fc R dẫn đến giảm hoạt động kích thích miễn dịch ISAC trong ống nghiệm, hỗ trợ tầm quan trọng của vùng Fc hoạt động chức năng (Hình 3C).

ISAC yêu cầu chủ nghĩa TLR để làm trung gian hoạt hóa dòng tủy các túi TLR7 và TLR 8 38 (TLRnull, Hình 3D). Hợp chất TLRnull được liên hợp với rituximab (TLRnull ISAC) và được đánh giá về khả năng hoạt hóa dòng tủy khi có CD20 cộng với các tế bào khối u trong ống nghiệm. TLRnull ISAC không tạo ra sự điều hòa của phân tử kích thích vũ trụ CD 86 hoặc điều chỉnh sự biểu hiện của CD14 hoặc CD123, cho thấy rằng chủ nghĩa TLR cần thiết cho kiểu hình hoạt hóa được quan sát với T 785- ISAC (Hình 3E). Hơn nữa, TLRnull ISAC không tạo ra quá trình phosphoryl hóa IRF -7 trong bạch cầu đơn nhân, phù hợp với việc nó không có khả năng tương tác với TLR7 / 8 (Hình 7E bổ sung). Hoạt động của tế bào B, T hoặc NK trong các mô hình khối u xenograft ở người Khả năng của ISAC để gây ra sự phá hủy qua trung gian dòng tủy và bạch cầu trung tính của các khối u rắn khi không có hoạt động của tế bào B, T và NK được đánh giá bằng cách sử dụng các mô hình xenograft ở người 39,40. Trastuzumab, một kháng thể nhắm mục tiêu HER 2- đã được xác thực lâm sàng, đã được chọn cho cuộc điều tra để xác định xem liệu ISAC trastuzumab T 785- có thể vượt qua khả năng kháng trastuzumab của khối u trong mô hình HER2 cộng với khối u rắn hay không (Hình 4 và Hình 9 bổ sung ) 41,42. Đầu tiên, việc sử dụng toàn thân trastuzumab T 785- ISAC được so sánh với việc cung cấp hỗn hợp trastuzumab và T785 trong khối u. ISAC trastuzumab T 785- kích thích sự thoái lui và thanh thải khối u trong khi phân phối một hỗn hợp các thành phần đều mang lại lợi ích điều trị tối thiểu so với chỉ dùng trastuzumab (Hình 4A). Các nghiên cứu tiếp theo so sánh ISAC nhắm mục tiêu khối u với các đối chứng isotype thích hợp của chúng đã xác nhận rằng hoạt động chống khối u yêu cầu nhắm mục tiêu khối u (Hình 4B và Hình 10 bổ sung). Quan trọng là, việc sử dụng toàn thân trastuzumab T 785- ISAC và kiểm soát isotype của nó được dung nạp tốt, với tác động tối thiểu đến trọng lượng cơ thể (Hình 11 bổ sung).Để xác định xem cơ chế hoạt động góp phần vào hiệu quả ISAC in vivo có giống với cơ chế được mô tả trong ống nghiệm hay không, Fc-không đủ năng lực (trastuzumab N297A-ISAC) và trastuzumab TLRnull-ISAC đã được thử nghiệm trong cùng một mô hình xenograft khối u vú trongsong song với kiểu đại diện trastuzumab T 785- ISAC.Trong khi ISAC trastuzumab T 785- dẫn đến sự thoái lui và thanh thải khối u, thì cả ISAC không đủ năng lực và TLRnull của Fc đều không thể kích thích hoạt động chống khối u (Hình 4C).Các dữ liệu này kết hợp với nhau chỉ ra yêu cầu nhắm mục tiêu khối u và cả sự tham gia của Fc R và TLR đối với hoạt động chống khối u của ISAC.

Sự đóng góp khác biệt của bạch cầu trung tính so với các tế bào dòng tủy khác trong tác dụng trung gian chống khối u được đánh giá bằng sự suy giảm đặc hiệu của tế bào.Bạch cầu trung tính đã cạn kiệt khi sử dụng kháng thể Ly6G, đồng thời suy giảm cả bạch cầu trung tính và APC chưa trưởng thành (bạch cầu đơn nhân)đạt được với kháng thể kháng Gr1.Các tế bào thực bào bị cạn kiệt khi sử dụng liposome nạp clodronate.Chúng tôi nhận thấy rằng các tế bào thực bào, có lẽ là đại thực bào, đã đóng góp đáng kể vào việc điều hòa hoạt động chống khối u sau khi điều trị ISAC (Hình 4D).Tuy nhiên, sự suy giảm bạch cầu trung tính với thuốc kháng Ly6G không ảnh hưởng đến hiệu quả của ISAC.Sự suy giảm Gr1 không ảnh hưởng ngay đến hiệu quả qua trung gian ISAC nhưng làm giảm thời gian kiểm soát khối u (Hình 4D).Để thăm dò khả năng của T 785- ISAC trong việc kiểm soát sự phát triển của khối u trong các mô hình cóBiểu hiện HER2, tiếp theo chúng tôi lập mô hình hiệu quả trong mô hình khối u biểu hiện trên môi trường kháng trastuzumab, HER 2-, JIMT -1.Dòng tế bào ung thư JIMT -1 được ước tính có khoảng 6,5 x105 bản sao của HER2 bề mặt và thể hiện mức độ giảm củaHER2 so với dòng tế bào khối u HCC1954 bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy 43.Trong khikhảo sátChúng tôi đưa ra giả thuyết rằng pertuzumab, liên kết với một epitope HER2 khác với vị trí liên kết của trastuzumab, sẽ làm tăng phân nhóm Fc và sau đó nâng cao ADCP và hiệu quả của ISAC trong mô hình JIMT -1.Sự kết hợp của trastuzumab T 785- ISAC với pertuzumab dẫn đến hiệu quả được nâng cao đáng kể và sự hồi quy khối u đáng kể (Hình 4F).Nếu không có sự kích thích miễn dịch của trastuzumab T 785- ISAC, việc kết hợp pertuzumab với trastuzumab không mang lại lợi ích gì.

Tiếp theo, chúng tôi điều tra các sự kiện phân tử và tế bào được kích hoạt bởi trastuzumab T 785- ISAC mà cuối cùng dẫn đến hiệu quả chống khối u.Các thay đổi biểu hiện gen sớm trong các khối uđược đo bằng bảng hồ sơ miễn dịch ung thư di căn chuột NanoString, cho thấy sự điều chỉnh đáng kể của 13,7 phần trăm gen trong vòng 24 giờ điều trị, bao gồm các gen liên quan đến tín hiệu và kích hoạt TLR7 (IRF -7, gen liên kết NF-kB)so với 0-0. 1 phần trăm sau khi xử lý ISAC bằng trastuzumab hoặc isotype T 785- (Hình 4G) 44.Phân tích các con đường biểu hiện gen được đánh giá bởi nSolver Advanced Analysis Pathway Score cho thấy sự điều chỉnh đáng kể các dấu hiệu gen quan trọng liên quan đến hệ miễn dịch (Chức năng đại thực bào, Chức năng DC, Xử lý và trình bày kháng nguyên) vốn làphù hợp với các phát hiện in vitro và in vivo rằng tương tác Fc-Fc R là rất quan trọng đối với hoạt động qua trung gian ISAC (Hình 4H và Hình 12 bổ sung).Điểm số chữ ký gen liên quan đến chemokine và cytokine tăng cao sau khi điều trị bằng trastuzumab T 785- ISAC, phù hợp với định lượng protein được thực hiện đo sự tiết cytokine và chemokine trong khối u 24 giờ sau khi dùng thuốc (Hình 4Hvà Hình 13).Những phát hiện này, cùng với dữ liệu về hiệu quả in vitro và in vivo, cho thấy một phản ứng mạnh mẽ qua trung gian TLR và Fc R được tạo ra bởi ISAC.

Đo dòng tế bào và IHC được sử dụng để đánh giá xem liệu sự gia tăng hoạt hóa qua trung gian T 785- ISAC và biểu hiện chemokine cuối cùng có dẫn đến việc tuyển dụng các tế bào hiệu ứng miễn dịch hay không.Thâm nhiễm miễn dịch dòng tủy được xác định bằng phương pháp đo lưu lượng tế bào 24 giờ và 7 ngày sau khi dùng một liều duy nhất trastuzumab T 785- ISAC hoặc trastuzumab và so sánh với nhóm chứng không được điều trị.Phân tích các khối u 24 giờ sau khi điều trị cho thấysự xâm nhập của CD11b cộng với Ly6C cộng với bạch cầu đơn nhân và CD11b cộng với Ly6G cộng với bạch cầu hạt trong các khối u được điều trị bằng trastuzumab hoặc trastuzumab T 785- ISAC so với đối chứng không được điều trị (Hình 4I).Bảy ngày sau điều trị, CD11b cộng với CD11c cộng với F4 / 80 cộng với APC dòng tủy dương tính đã tăng lên đáng kể ở nhóm được điều trị bằng trastuzumab T 785- ISAC so vớitrastuzumab hoặc đối chứng chưa được xử lý (Hình 4I) 45,46.Sự gia tăng APC dòng tủy này có thể làđược cho là do sự gia tăng đáng kể trong việc sản xuất các chemokine liên quan đến dòng tủy sau khi điều trị bằng trastuzumab T 785- ISAC.Mặc dù không có sự gia tăng đáng kể về tần số của APC dòng tủy tại thời điểm 24- giờ, các tế bào của kiểu hình này đã được kích hoạt sau khi điều trị bằng trastuzumab T 785- ISAC, được đo bằng cách điều chỉnh CD40 trên bề mặt tế bào , so với cùng một quần thể từ trastuzumab hoặc đối chứng không được điều trị (Hình 4I).Phát hiện này, cùng với dữ liệu NanoString, chứng minh thêm khả năng của trastuzumab T 785- ISAC trong việc tham gia và kích hoạt các tế bào dòng tủy trong vi môi trường khối u.Với tính tích cực CD11b của APC dòng tủy được quan sát một tuần sau khi điều trị, sự xâm nhập sớm của bạch cầu đơn nhân có thể là tiền thân của quần thể APC dòng tủy trưởng thành trong các khối u được điều trị bằng ISAC nhưng không phải trong các khối u được điều trị bằng trastuzumab.Tuy nhiên, vẫn còn phải xác định xem các sự kiện lân cận do viêm được đo trong 24 giờ sau khi kích thích ISAC bằng NanoString và MSD cuối cùng ảnh hưởng như thế nào đến các sự kiện xa như sự trưởng thành của tế bào tủy trong môi trường vi mô khối u đang biến đổi tại thời điểm 6- ngày sau đó , và cuối cùng, ảnh hưởng đến sự thoái lui và thanh thải của khối u.
Cuối cùng, IHC được thực hiện để đánh giá sự hiện diện và vị trí của các quần thể tế bào miễn dịch quan trọng trong khối u sau khi điều trị bằng trastuzumab T 785- ISAC so với các đối chứng của nó.Phù hợp với phương pháp đo tế bào dòng chảy ngày 7, F4 / 80 biểu hiện các tế bào trongkhối u và vùng phúc mạc tăng lên vào ngày thứ 9 sau một lần điều trị duy nhất với trastuzumab T 785- ISAC (Hình 4J).Hơn nữa, điều trị ISAC mục tiêu dẫn đến sự gia tăng đáng kể các tế bào CD11c cộng với vùng phúc mạc mà không thấy sau khi điều trị bằng kháng thể rHER2 hoặc điều trị bằng isotype hoặc isotype-ISAC (Hình 4J).Sự gia tăng trong các tế bào CD11c cộng với cả phép đo dòng chảy và IHC cũng được chứng minh trong dữ liệu NanoString, trong đó sự biểu hiện mRNA của ITGAX đã tăng lên đáng kể vào ngày thứ 6 và ngày 9 sau khi sử dụng trastuzumab T 785- ISAC (Hình bổ sung 14).

Hình 5: T 785- ISAC tạo ra các hiệu ứng chống khối u mạnh mẽ trong mô hình khối u tổng hợp MMC. (ah) Chuột FVB / N-TgN (MMTV-Erbb2) được cấy dòng tế bào khối u MMC. (a) Những con chuột cái được chọn ngẫu nhiên khi thể tích khối u đạt khoảng 500 mm3. Sau đó, chuột được điều trị bằng cách tiêm trong phúc mạc với 5 mg / kg mỗi ngày x 2 kháng thể chống chuột HER2, kháng chuột HER2 T 785- ISAC, hoặc isotype T 785- ISAC (TA99) (n =4-7 chuột trên mỗi cánh tay). (b, c) Chuột đực được chọn ngẫu nhiên khi thể tích khối u đạt khoảng 500 mm3 và được điều trị trước bắt đầu từ một ngày trước ngày điều trị ban đầu với liposome kiểm soát hoặc nạp clodronate để giảm lượng thực bào (6 chu kỳ, đến ngày 15) hoặc chống -CD8 depleting antibody (rIgG2b control) for CD8 T cell depletion (8 cycles, through Day 21). Animals were treated with 5 mg/kg rHER2 T785-ISAC q5d x 2 (n=6 mice per group) intraperitoneally. For phagocyte depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC treatment with clodronate or control liposomes, while for CD8 T cell depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC with T785-ISAC + CD8 Depletion or T785-ISAC + rat isotype IgG2b. (d) Anti-rHER2 T785-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >60 ngày sau lần điều trị cuối cùng của họ đã được thử thách với dòng tế bào khối u MMC. Những con chuột chưa từng có khối u được dùng làm đối chứng cấy ghép (n =5 con chuột mỗi nhóm). (ad) Dữ liệu đại diện cho ít nhất 2 thử nghiệm. Những con chuột bị tử vong một cách nhân đạo sau khi có khối uđạt đến 2, 000 mm3. Dữ liệu được hiển thị cho những nhóm mà không có khối u nào tiếp cận2, 000 mm3. (ei) Các nhóm chuột được chọn ngẫu nhiên khi thể tích khối u của khối u MMC đạt khoảng 5 0 0 mm3 và được điều trị bằng ISAC 5 mg / kg hoặc các kháng thể đối chứng được định lượng ở ngày 0 và ngày 5. Các khối u được xử lý để đo cytokine bằng MSD , phân tích đo tế bào dòng chảy, định lượng mRNA chuỗi Nano hoặc được cố định bằng formalin và nhúng parafin chohóa mô miễn dịch tại các thời điểm được hiển thị. (e) Biểu đồ núi lửa mô tả sự thay đổi biểu hiện gen theo lần log2 ở các khối u được điều trị so với đối chứng isotype được đo bằng NanoString vào 24 giờ (n =5 con chuột mỗi nhóm). Các thay đổi có giá trị p được điều chỉnh là <0. 05="" được="" hiển="" thị="" bằng="" màu="" đỏ.="" (f)="" điểm="" số="" chữ="" ký="" gen="" được="" định="" lượng="" bằng="" điểm="" lộ="" trình="" phân="" tích="" nâng="" cao="" nsolver="" cho="" các="" khối="" u="" được="" phân="" tích="" 24="" giờ="" sau="" khi="" điều="" trị="" (n="5" con="" chuột="" mỗi="" nhóm).="" (g,="" h)="" phân="" tích="" lưu="" lượng="" tế="" bào="" của="" thành="" phần="" tế="" bào="" khối="" u="" và="" trạng="" thái="" kích="" hoạt="" 24="" giờ="" và="" 6="" ngày="" sau="" khi="" bắt="" đầu="" điều="" trị="" (n="4" con="" chuột="" mỗi="" nhóm).="" dữ="" liệu="" đại="" diện="" cho="" ít="" nhất="" 2="" thí="" nghiệm.="">Hình ảnh đại diện cũng như định lượng F4 / 80, CD11c và CD8 IHC của khối u được thu hoạch 6 ngày sau mỗi lần điều trị được chỉ định. Các vạch chia độ là 50 μm. (ai) Dữ liệu được báo cáo là trung bình và SEM; *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

T 785- ISAC nhắm mục tiêu khối u gợi ra sự hồi quy của khối u trong mô hình khối u MMC tổng hợp
Để đánh giá khả năng của ISAC trong việc trung gian hiệu quả chống khối u khi có sự hiện diện của các tế bào B, T và NK, chúng tôi đã sử dụng một dòng tế bào biểu hiện ung thư biểu mô tuyến vú (MMC) của chuột đồng tử HER2 (rHER2) có nguồn gốc từ một tuyến vú tự phát. ung thư biểu mô ở chuột rHER 2- biểu hiện FVB.Để giảm thiểu khả năng sinh miễn dịch giữa các loài liên quan đến biểu hiện rHER2 trong MMC, những con chuột chuyển gen biểu hiện nội sinh Her2 chuột dưới sự kiểm soátcủa promoter MMTV được sử dụng làm vật chủ (Hình bổ sung 15) 47. Tận dụng sự hiện diện của hệ thống miễn dịch hoàn toàn nguyên vẹn, chúng tôi nhằm đánh giá khả năng của ISAC trong việc chống lại các khối u có gánh nặng khối u lớn 500 mm3, vì các khối u lớn hơn nói chung khó điều trị hơn trong các mô hình tiền lâm sàng 48. Việc sử dụng toàn thân tất cả các phương pháp điều trị, bao gồm ISAC rHER2 T 785-, được dung nạp tốt, với tác động tối thiểu đến trọng lượng cơ thể (Hình 16A bổ sung). Tuy nhiên, chỉ có rHER2 T 785- ISAC mới có thể chữa khỏi những con chuột mang khối u lớn đã hình thành (Hình 5A). Như đã thấy trong mô hình xenograft, các nghiên cứu về sự suy giảm tế bào cho thấy rằng hoạt động chống khối u đáng kể đã bị mất khi các tế bào thực bào bị cạn kiệt với các liposome nạp clodronate (Hình 5B). Mặc dù ISAC dự kiến ​​sẽ không tác động trực tiếp lên tế bào T, nhưng những con chuột được điều trị trước bằng kháng thể làm cạn kiệt CD 8- sẽ mất khả năng loại bỏ khối u sau hai lần sử dụng rHER2 T 785- ISAC (Hình 5C). Điều này cho thấy ISAC nhắm mục tiêu khối u có thể hoạt động gián tiếp thông qua các tế bào T, sau khi trình bày các kháng nguyên liên quan đến khối u. Phù hợp với sự hiện diện của trí nhớ miễn dịch, chuộtđã chữa khỏi khối u MMC sau điều trị ISAC rHER2 T 785- được bảo vệ chống lại sự tái phát của khối u (Hình 5D).

Để thăm dò thêm cơ chế hiệu quả ISAC cơ bản trong mô hình tổng hợp, tiếp theo, chúng tôi nghiên cứu những thay đổi tế bào, phiên mã và cytokine trong vi môi trường khối u sau khi dùng ISAC. Hai nhóm chuột mang khối u MMC lớn được điều trị bằng rHER2 T 785- ISAC hoặc đối chứng. Các khối u từ nhóm thuần tập đầu tiên được thu hoạch 24 giờ sau khi dùng thuốc (Ngày 1) khi tất cả các khối u có kích thước tương tự nhau (Hình 16B bổ sung). Nhóm thuần tập khác được tiêm liều thứ hai 5 ngày sau liều thứ nhất, sau đó được thu hoạch 24 giờ sau (Ngày 6), tại thời điểm đó các khối u trong tất cả các nhóm điều trị phát triển một cách có thể đo lường được ngoại trừ những khối u được điều trị bằng T 785- ISAC (Hình bổ sung 16B ). Các khối u được phân tích bằng IHC, biểu hiện mRNA và sự bài tiết cytokine trong dịch ly giải protein. Hỗ trợ thêm cho các quan sát của chúng tôi trong các mô hình xenograft rằng việc nhắm mục tiêu khối u là cần thiết cho hoạt động của ISAC, phân tích mRNA của các khối u 24 giờ sau khi điều trị bằng rHER2 T 785- ISAC cho thấy sự điều chỉnh mạnh mẽ của 34,1 phần trăm gen trong hệ miễn dịch ung thư di căn chuột NanoString bảng điều khiển cấu hình so với các khối u được xử lý bằng isotype. Riêng kháng thể kháng rHER2 chỉ có tác động nhẹ đến sự biểu hiện gen (3,5% số gen được phân tích) trong khi ISAC isotype T 785- không được nhắm mục tiêu không ảnh hưởng đến sự biểu hiện gen (Hình 5E). Như đã thấy trong mô hình xenograft HCC1954, các gen liên quan đến tín hiệu và hoạt hóa qua trung gian TLR 7- được điều chỉnh đáng kể bởi ISAC rHER2 T 785- nhắm mục tiêu khối u, cho biết phản ứng mạnh mẽ qua trung gian TLR (Hình 5E). Phân tích lộ trình biểu hiện gen một lần nữa cho thấy sự điều chỉnh đáng kể các dấu hiệu gen quan trọng liên quan đến miễn dịch, bao gồm các dấu hiệu để phân tích lộ trình biểu hiện gen, cho thấy sự điều chỉnh đáng kể các dấu hiệu gen chính liên quan đến miễn dịch sau khi điều trị ISAC rHER2 T 785-, bao gồm cả những dấu hiệu liên quan đến chemokine và các cytokine (Hình 5F). Định lượng protein được thực hiện trên các khối u giống như được phân tích bởi NanoString và phù hợp với các phát hiện về dấu hiệu gen, mức độ tăng đáng kể của cytokine và chemokine gây viêm được đo trong 24 giờ sau khi điều trị bằng rHER2 T 785- ISAC (Hình bổ sung 17 ). Điểm số chữ ký gen cũng được nâng cao đáng kể đối với Xử lý và trình bày kháng nguyên, Chức năng tế bào đuôi gai và Chức năng đại thực bào, hỗ trợ thêm cho phản ứng qua trung gian anFc-Fc R và theo hướng thực bào trong 24 giờ sau rHER2 T 785- ISACđiều trị (Hình 5F và Hình 18 Bổ sung). Ngoài điểm số chữ ký gen được nâng cao đáng kể liên quan đến phản ứng mạnh mẽ qua trung gian TLR và Fc R, điểm số chữ ký gen cho Chức năng tế bào T cũng tăng đáng kể trong vòng 24 giờ sau khi điều trị ISAC rHER2 T 785-, hỗ trợ thêm cho nhận thấy rằng tế bào T cần thiết để đạt được hiệu quả qua trung gian ISAC (Hình 5F và Hình 18 Bổ sung).

Để mô tả đặc điểm của các tế bào miễn dịch có thể góp phần vào sự gia tăng sớm sản xuất cytokine và chemokine tiền viêm, các khối u được phân tích bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy 24 giờ sau liều rHER2 T 785- ISAC đầu tiên hoặc các đối chứng và 6 ngày sau khi bắt đầu điều trị, 24 giờ sau liều thứ hai. Phân tích các khối u vào Ngày 1 cho thấy sự thâm nhập của CD11b cộng với Ly6C cộng với bạch cầu đơn nhân trong các khối u được điều trị bằng rHER2 T 785- ISAC và CD11b cộng với Ly6G cộng với bạch cầu hạt trong các khối u được điều trị bằng rHER2 mAb hoặc rHER2 T 785- ISAC , nhưng không phải là ISAC isotype hoặc các đối chứng kháng thể isotype (Hình 5G). Mức độ bạch cầu đơn nhân thậm chí còn tăng hơn nữa trong các khối u được điều trị bằng rHER2 T 785- ISAC sau 6 ngày. Tương tự như những gì chúng tôi quan sát được trong mô hình xenograft HCC1954, các APC dòng tủy (CD11b cộng với CD11c cộng với F4 / 80 cộng) đã tăng lên đáng kể vào ngày thứ 6 sau khi điều trị ISAC rHER2 T 785- so với đối chứng (Hình 5G và Hình bổ sung 19 ). Hơn nữa, các APC dòng tủy được phát hiện được kích hoạt đặc biệt trong nhóm được điều trị bằng ISAC rHER2 T 785- tại cả hai thời điểm, được đo bằng cách điều chỉnh tăng CD40 trên bề mặt tế bào (Hình 5H). Điều quan trọng là không đo được sự gia tăng APC của dòng tuỷ trong khối u sau sự suy giảm tế bào thực bào bằng cách sử dụng các liposome nạp clodronate (Hình 20). Cuối cùng, IHC được thực hiện để đánh giá sự hiện diện và vị trí của các quần thể tế bào miễn dịch quan trọng trong mô hình MMC sau khi điều trị bằng rHER2 T 785- ISAC. Như đã thấy trong mô hình xenograft HCC1954, điều trị bằng rHER2 T 785- ISAC dẫn đến sự gia tăng đáng kể các tế bào CD11c cộng và F4 / 80 cộng trong vùng phúc mạc mà không thấy sau khi điều trị bằng kháng thể rHER2 hoặc điều trị bằng isotype hoặc isotype T 785- ISAC (Hình 5I). Phù hợp với sự biểu hiện sớm của chemokine tế bào T và điểm số chữ ký gen tăng lên cho Chức năng Tế bào T, sự xâm nhập đáng kể của các tế bào CD8 cộng với IHC đã được nhìn thấy trong các khối u của những con chuột được điều trị bằng ISAC rHER2 T 785- vào ngày thứ 6, ngược lại Nhuộm CD8 ở chuột được điều trị bằng kháng thể kháng rHER2 hoặc đối chứng isotype vẫn ở mức thấp (Hình 5I). Tăng CD8 cộng với nhuộm IHC, cùng với sự biểu hiện gen khuếch đại của các gen liên quan đến chức năng tế bào T và khả năng thanh thải khối u phụ thuộc CD 8-, hỗ trợ tiềm năng của T 785- ISAC để biến khối u lạnh thành cục nóng.CL { {58}} ISAC gợi ý sự hồi quy của khối u trong HER 2- phương tiện biểu hiện mô hình khối u xenograftĐể chứng minh rằng ISAC là một nền tảng mạnh mẽ trên nhiều tải trọng kích thích miễn dịch, chúng tôi đã phát triển ISAC bằng cách sử dụng chất chủ vận TLR7 nổi tiếng, CL264 với DAR có thể so sánh với trastuzumab T 785- ISAC (Hình 6A và Hình bổ sung 21). Khả năng của các ISAC trastuzumab được tạo ra với CL264 hoặc T785 để làm trung gian kích hoạt dòng tủy trong khối u được đánh giá trong mô hình xenograft HCC1954 24 giờ sau một lần sử dụng trastuzumab, trastuzumab CL 264- ISAC hoặc trastuzumab T 785- ISAC . Tăng cường hoạt hóa dòng tủy đã được quan sát với trastuzumab CL 264- ISAC bằng chứng là tăng biểu hiện CD40 trên CD11b thâm nhiễm khối u cộng với CD11c cộng với F4 / 80 cộng với APC dòng tủy so với trastuzumab hoặc trastuzumab T 785- ISAC (Hình 6B ).Để xác định xem liệu khả năng kích hoạt dòng tủy nâng cao của CL 264- ISAC có được chuyển thành hoạt động chống khối u lớn hơn in vivo hay không, trastuzumab CL 264- ISAC đã được so sánh vớiT 785- ISAC trong mô hình khối u HER2High HCC1954 và HER2Med JIMT -1. Trong khi cả haitrastuzumab ISACs hồi quy khối u hoàn toàn qua trung gian trong mô hình HCC1954 HER2High, CL 264- ISAC đã chứng minh hoạt động chống khối u tăng lên trong mô hình JIMT -1 HER2Med cho thấy rằng hiệu lực của ISAC và khả năng nhắm mục tiêu các khối u có mật độ kháng nguyên thấp hơn có thể được liên kết (Hình 6C – D).

Cả hai ISAC đều được dung nạp tốt, nhưng chúng tôi quan sát thấy sự sụt giảm trọng lượng cơ thể thoáng qua 5-10 phần trăm ở những động vật được điều trị bằng trastuzumab CL 264- ISAC hoặc rituximab CL 264- ISAC, với trọng lượng cơ thể phục hồi trở lại hoặc cao hơn mức cơ bản của liều thứ ba (Hình 16A bổ sung). Sự bài tiết cytokine toàn thân được đo sau khi điều trị bằng T 785- ISAC hoặc CL 264- ISAC. Nồng độ TNF thấp được đo trong huyết thanh của động vật bốn giờ sau khi sử dụng T 785- ISAC, trong khi cả ISAC mục tiêu và isotype CL 264- đều gợi ra mức tiết TNF cao hơn một cách hệ thống (Hình 11 bổ sung) . Không chắc rằng những ảnh hưởng này giữa ISAC của T785 và CL264 là do tác động trực tiếp của ISAC lên sự phát triển của tế bào khối u, vì ISAC không ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư trong ống nghiệm (Hình 9 bổ sung).

CL 264- ISAC gợi ra khả năng thanh thải khối u và trí nhớ miễn dịch trong các mô hình khối u khớp xương Mang lại hiệu lực và hiệu quả tăng lên được quan sát thấy với CL 264- ISAC trong các mô hình xenograft khối u ở người với mật độ kháng nguyên HER2 khác nhau, tiếp theo chúng tôi xác định đặc điểm hoạt động của CL 264- ISAC trong các mô hình khối u khớp. Tương tự như ISAC T 785- trong mô hình MMC, CL 264- ISAC dẫn đến sự thoái lui và thanh thải khối u theo cách phụ thuộc vào tế bào T, dẫn đến trí nhớ miễn dịch bền vững (Hình 22A bổ sung). Để đánh giá hiệu quả của ISAC trong mô hình khối u khớp với biểu hiện kháng nguyên giảm, chúng tôi đã phát triển dòng tế bào CT26 biểu hiện ổn định HER2 của chuột (CT 26- rHER2). Điều quan trọng là, khoảng 8,5% tế bào CT26 không biểu hiện rHER2 sau khi được cấy ghép khối u (Hình 6E). Những con chuột Wildtype Balb / c được điều trị bằng ISAC rHER2 CL 264- đã thể hiện khả năng miễn dịch chống khối u đáng kể ở 75 phần trăm (6 trong số 8) con chuột đã loại bỏ khối u của chúng và không có khối u trong suốt thời gian thử nghiệm, trong khi không có con chuột nào được điều trị bằng kháng thể kháng rHER2 bị thoái triển hoàn toàn (Hình 6F). Giảm cân thoáng qua khoảng 10 phần trăm trọng lượng cơ thể sau khi điều trị rHER2 CL 264- ISAC đã được quan sát, với trọng lượng cơ thể phục hồi sau tám ngày sau khi bắt đầu nghiên cứu (Hình 22B bổ sung). Chúng tôi đã đánh giá xem liệu trí nhớ miễn dịch qua trung gian rHER2 CL 264- ISAC chống lại một khối u thiếu biểu hiện của kháng nguyên đích, rHER2, bằng cách thử thách những con chuột trước đó đã chữa khỏi khối u CT 26- rHER2 với dòng tế bào CT26 của cha mẹ thiếu rHER2 biểu hiện. Những con chuột trước đây đã chữa khỏi khối u CT 26- rHER2 bằng rHER2 ISAC đã được bảo vệ hoàn toàn khỏi thử thách với dòng tế bào CT26 của cha mẹ (Hình 6I). Sự cạn kiệt của các tế bào T CD4 và CD8 trước khi khối u tái sinh cho thấy rằng các tế bào T cần được bảo vệ. Cuối cùng, chúng tôi đã kiểm tra xem liệu trí nhớ miễn dịch được phát triển ở những con chuột được chữa khỏi trước đó bằng ISAC có đặc hiệu với các kháng nguyên liên quan đến khối u của khối u chính được điều trị hay không. Trong quá trình tái tạo khối u CT26 của bố mẹ, những con chuột được thử thách đồng thời với một khối u khác, 4T1, được cấy vào vùng sườn bên. Dữ liệu cho thấy sự phát triển của trí nhớ miễn dịch làđặc hiệu với các kháng nguyên liên quan đến khối u CT26 khác với rHER2, vì sự phát triển khối u của khối u 4T1 không bị ảnh hưởng (Hình 6G).