Điều tra độc tính của ifosfamide gây ra cơ chế điều hòa ngược dòng thường gặp ở gan và thận

Liên hệ: emily.li@wecistanche.com

Hyoung-Yun Han, et al

Trừu tượng:

Ifosfamide là một chất alkyl hóa, một chất tương tự tổng hợp của cyclophosphamide, được sử dụng để điều trị các bệnh ung thư thể rắn khác nhau. Trong nghiên cứu này, độc tính của ifosfamide đã được đánh giá bằng cách sử dụng một liều đơn và nhiều liều trong phúc mạc ở chuột theo hướng dẫn Thực hành Phòng thí nghiệm Tốt, và một thí nghiệm microarray bổ sung đã được thực hiện để hỗ trợ tìm kiếm chất độc. Một liều ifosfamide duy nhất (50 mg / kg) không gây ra bất kỳ thay đổi bệnh lý nào. Trong khi đó, độc tính nghiêm trọng trên thận được quan sát thấy ở các nhóm dùng liên tục 7 và 28 ngày, với sự gia tăng đáng kể nồng độ nitơ urê trong máu và creatinine. Trong phân tích danh sách độc tố, các gen liên quan đến tổng hợp cholesterol hầu hết bị ảnh hưởng ở gan và các gen liên quan đến suy thận bị ảnh hưởng ởquả thậnsau khi quản lý ifosfamide. Hơn nữa, yếu tố điều chỉnh interferon 7 được chọn làm yếu tố điều chỉnh ngược dòng chính đã thay đổi trong cảGanvàquả thận, và được phát hiện là tương tác với các gen mục tiêu khác, chẳng hạn như peptidase 18 đặc biệt ubiquitin, vùng gốc S-adenosyl methionine chứa 2 và gen 15 được kích thích bởi interferon, đã được xác nhận thêm bằng phân tích RT-PCR thời gian thực. Tóm lại, độc tính đối với cơ quan ifosfamide thiên về thận đã được xác nhận lại và các gen được xác định đã thay đổi giống hệt nhau trong cả haiGanvàquả thận. Cần có các nghiên cứu toàn diện hơn về độc tố học để tiết lộ mối quan hệ chính xác giữa các gen gây ra ifosfamide và độc tính cơ quan.

Từ khóa:ifosfamide; nhiễm độc gan; độc với thận; độc tính trong phúc mạc

Cistanche tốt cho gan và thận

1. Giới thiệu

Ifosfamide là một chất alkyl hóa, một chất tương tự tổng hợp của cyclophosphamide, được sử dụng để điều trị các bệnh ung thư thể rắn khác nhau, bao gồm cả sarcoma và u lympho. Ifosfamide là một loại thuốc chống ung thư không đặc hiệu theo chu kỳ tế bào, can thiệp vào quá trình sao chép DNA và sản xuất RNA [1]. Mặc dù ifosfamide được dung nạp tương đối tốt so với các tác nhân alkyl hóa độc hại khác, nó được biết là có liên quan đến nhiều tác dụng phụ đe dọa tính mạng làm hạn chế việc sử dụng trên lâm sàng [2]. Các tác dụng phụ chính của ifosfamide bao gồm tổn thương thận nặng do các loại độc tố phản ứng từ ifosfamide, bao gồm cấp tínhquả thận vết thương, viêm thận kẽ, viêm bàng quang xuất huyết, và hội chứng Fanconi [3]. Tại các phòng khám, nhiễm độc đa cơ quan nghiêm trọng đã được báo cáo ở những bệnh nhân bị nhiễm độc thận sớm và suy một cơ quan do ifosfamide liều cao lặp đi lặp lại dẫn đến suy cơ quan sau đó [4,5].

Chất chuyển hóa độc hại của ifosfamide, acrolein và chloroacetaldehyde, là yếu tố chịu trách nhiệm chính gây độc cho cơ quan ifosfamide. Các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào các yếu tố ảnh hưởng đến việc chuyển đổi ifosfamide thành các chất chuyển hóa độc hại, đặc biệt là cytochrome P450 (CYP) [6]. CYP3A4 và CYP3A5 tương đối dồi dào trong thận dẫn đến sự thay đổi độc tính của ifosfamide và gây độc cho thận [7]. Acrolein là một aldehyde có hoạt tính cao, có thể kích hoạt lộ trình gen oxy hóa phản ứng nội bào và làm hỏng bào quan của tế bào. Chloroacetaldehyde đã báo cáo việc ức chế sự hoạt hóa phức hợp I trong chuỗi hô hấp của ty thể có thể dẫn đến sự suy giảm glutathione nội bào (GSH) và chết tế bào [8].

Một nghiên cứu về độc tính trên nhiều cơ quan hữu ích hơn trong việc hiểu tác dụng toàn thân của thuốc hơn là nhắm vào các cơ quan cụ thể để nghiên cứu độc tính. Gan và thận là những cơ quan chính tham gia vào quá trình chuyển hóa và bài tiết thuốc, những cơ quan chính này rất dễ bị phản ứng có hại của thuốc; nhiễm độc nội tạng thường theo sau. Hơn nữa, đánh giá độc tính tích hợp có thể đưa ra các kết quả bệnh lý khác nhau có thể giúp hiểu và dự đoán độc tính do thuốc gây ra trong hệ thống.

Nhiều nghiên cứu đã sử dụng cấu hình biểu hiện gen để dự đoán những tác động tiêu cực tiềm ẩn của hóa chất. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu trước đây đều tập trung vào đánh giá độc tính lên cơ quan đích duy nhất, chỉ với các triệu chứng bệnh lý hạn chế [9]. Hơn nữa, kết hợp với cấu hình gen dựa trên microarray, nó sẽ tạo ra sự hiểu biết toàn diện ở cấp độ hệ thống về độc tính có thể ngăn ngừa độc tính tiềm ẩn liên quan đến thuốc [10]. Về vấn đề này, các phương pháp tiếp cận độc tính đa cơ quan tích hợp với hồ sơ biểu hiện gen đã được sử dụng trong các nghiên cứu mô hình dự báo độc tính để khắc phục dữ liệu độc tính thu được từ đánh giá độc tính đơn cơ quan, vốn không đủ để hiểu cơ chế độc hại của thuốc trong hệ thống [11].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi mô tả độc tính của ifosfamide trongquả thậnvàGansau khi phơi nhiễm cấp tính và lặp lại ở chuột Sprague – Dawley (SD). Các xét nghiệm mô tả biểu hiện gen hỗ trợ được thực hiện để tiết lộ gen đích chung đã bị thay đổi bởi ifosfamide ở cả gan vàquả thận, gợi ý một cái nhìn sâu sắc về độc tính của ifosfamide tích hợp.

2. Kết quả

2.1. Nghiên cứu độc tính một liều

Không có độc tính nào được quan sát thấy trong các nhóm ifosfamide 12,5, 25 và 50 mg / kg — không gây tử vong, các triệu chứng nhiễm độc, thay đổi trọng lượng cơ thể hoặc phát hiện mô bệnh học.

Trong khi đó, trong nghiên cứu huyết học, số lượng tương đối của bạch cầu lưới (RET) và số lượng tuyệt đối của bạch cầu trung tính (NEUA) và tế bào lympho (LYMA) giảm phụ thuộc vào liều lượng.

2.2. Nghiên cứu độc tính liều lặp lại trong một tuần

Tổng trọng lượng cơ thể giảm sau 1 tuần dùng ifosfamide và giá trị trung bình của việc giảm trọng lượng cơ thể ở nhóm 100 mg / kg cao hơn so với nhóm 75 mg / kg (Bảng 1). Trong khi đó, trọng lượng nội tạng tương đối tăng dần ở các nhóm được điều trị bằng ifosfamide (Bảng 2).

Một tuần sử dụng ifosfamide IP liên tiếp đã ức chế chỉ số huyết học, bao gồm RBC, HGB, HCT, MCV và PLT, theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Bảng 3). Hơn nữa, BUN và CREA tăng 1,2 lần trong nhóm đối chứng khi so sánh với nhóm ifosfamide (Bảng 4).Quả thậnvết thươngđã được hỗ trợ thêm bởi một nghiên cứu mô bệnh học.

Không có dấu hiệu mô bệnh học nào được quan sát thấy trong gan của những con chuột ở nhóm ifosfamide 75 và 100 mg / kg (Hình 1A). Trong khi đó,thậntừ nhóm ifosfamide 75 và 100 mg / kg được phát hiện có mức độ thay đổi bệnh lý tối thiểu đến nhẹ, bao gồm thoái hóa / giãn ống thận (1 trung bình trong nhóm 100 mg / kg), hoại tử tế bào đơn bào, tăng sản urothelium và xuất huyết khu trú / tắc nghẽn (Bảng 5). Ngoài ra, sự gia tăng rõ ràng biểu hiện KIM -1 trong khu vực ống thận đã được quan sát thấy trongquả thậncủa nhóm 100 mg / kg (Hình 1B).

2.3. Nghiên cứu độc tính liều lặp lại trong bốn tuần

Tỷ lệ tử vong được quan sát thấy ở nhóm điều trị 50 (5/10) và 70 (10/10) mg / kg sau 21 và 10 ngày dùng thuốc liên tiếp, tương ứng. Hơn nữa, trọng lượng cơ thể giảm với trọng lượng cơ quan tương đối tăng lên,Gan, vàquả thận, trong tất cả các nhóm được điều trị bằng ifosfamide, hỗ trợ độc tính liều lặp lại trong 4- tuần.

Các phân tích huyết học và sinh hóa huyết thanh được thực hiện trên các đối tượng còn sống. Một số thông số máu, bao gồm RET, RBC, MONA, EOSA và LUCA, đã giảm đáng kể sau 4 tuần sử dụng ifosfamide.

So với nhóm đối chứng, các phân tích sinh hóa cho thấy sự khác biệt thống kê sau 4 tuần sử dụng ifosfamide. Ví dụ: mức AST và CK đã tăng lên đáng kể, và tỷ lệ A / G, GLU và GGT đã giảm (p <0. 01)="" ở="" nhóm="" được="" điều="" trị="" 50="" mg="" kg,="" khi="" so="" sánh="" với="" nhóm="" đối="" chứng="" tập="">

2.4. Phân tích biểu hiện gen do ifosfamide gây ra

Các DEG do ifosfamide gây ra được xác định trong gan vàquả thậnkhăn giấy (Bảng 6). Đối với gan, các gen biểu hiện khác biệt bao gồm 2672 gen ở 100 mg / kg BW / ngày, 1283 gen được điều hòa và 1389 gen được điều hòa ở mức thấp. Trong thận, 401 gen được biểu hiện khác biệt ở 100 mg / kg BW / ngày — 149 gen được điều hòa và 252 gen được điều hòa. Ở cả gan và thận, số lượng gen quy định giảm nhiều hơn số lượng gen quy định lên. Điều này có thể gợi ý rằng điều trị bằng ifosfamide dường như ức chế sự biểu hiện của gen.

Kết quả phân tích chức năng sinh học được liệt kê trong Bảng 7. Việc sử dụng ifosfamide trong 1- tuần được phát hiện làm thay đổi các gen liên quan đến sự phát triển cơ quan, chủ yếu là ở gan. bên trongquả thận, người ta xác nhận rằng các gen liên quan đến nội địa hóa tế bào miễn dịch hầu hết đều bị ảnh hưởng.

Trong phân tích con đường chuẩn của DEG, những thay đổi trong quá trình tổng hợp cholesterol và các gen liên quan đến con đường trình bày kháng nguyên được hiển thị rõ ràng trongGanvàquả thậnmô, tương ứng (Hình 2). Hơn nữa, LXE / RXR và báo hiệu phản ứng giai đoạn cấp tính là con đường kinh điển được quy định hàng đầu phổ biến trongGanvàquả thận, tương ứng có liên quan đến cân bằng nội môi lipid và tín hiệu cytokine gây viêm.

Trong phân tích danh sách độc tố gan, các gen liên quan đến tổng hợp cholesterol hầu hết bị ảnh hưởng, tiếp theo là các protein phản ứng giai đoạn cấp tính tích cực và bảng điều khiển suy thận cấp tính (Bảng 8). Hơn nữa, kết quả danh sách thận cho thấy các gen liên quan đến suy thận thường bị ảnh hưởng bởi ifosfamide, bao gồm cả dấu ấn sinh học viêm cầu thận có thể đảo ngược và bảng điều khiển suy thận cấp tính.

Dựa trên cơ sở kiến ​​thức IPA, một bộ điều hòa ngược dòng phổ biến điều chỉnh sự biểu hiện gen ở gan và thận sau khi điều trị bằng ifosfamide (Hình 3). IRF7 là cơ quan điều hòa chính thay đổi ở cả gan và thận và được phát hiện là tương tác với các gen mục tiêu khác như USP18, RSAD2 và ISG15. Hơn nữa, phân tích RT-PCR thời gian thực đã xác nhận sự biểu hiện của IRF7, USP18, RSAD2 và ISG15. Mặc dù mức độ của những thay đổi trong mỗi gen là khác nhau giữa gan và thận, nhưng biểu hiện đã bị ức chế ở cả mô gan và thận sau 1 tuần sử dụng ifosfamide. RSAD2 và USP18 hầu hết đã bị thay đổi gen bằng cách điều trị ifosfamide ở gan và thận, tương ứng.

3. Thảo luận

Trong nghiên cứu này, độc tính toàn diện của ifosfamide ở nhiều cơ quan đã được khám phá với các liều lượng và điều kiện phơi nhiễm khác nhau thông qua con đường IP ở chuột theo tiêu chuẩn GLP. Tại các phòng khám, ifosfamide có thể phát huy tác dụng chống khối u hai phương thức với tác dụng gây độc tế bào và điều hòa miễn dịch kết hợp với liệu pháp miễn dịch được áp dụng [12]. Ifosfamide được biết là chủ yếu được thải trừ qua đường thận và khoảng 80% liều dùng ở dạng không thay đổi, độc tính trên thận là tác dụng phụ thường được biết đến của ifosfamide, và các chất chuyển hóa như chloroacetaldehyde và acrolein chịu trách nhiệm về việc sử dụng nó trên lâm sàng [13, 14].

Trong nghiên cứu này, nghiên cứu độc tính lặp lại 1- tuần là phù hợp để khám phá độc tính đối với các cơ quan có nguồn gốc từ ifosfamide. Một tuần dùng ifosfamide ức chế chỉ số máu phụ thuộc vào liều lượng, điều này có thể phản ánh tình trạng suy tủy điển hình do ifosfamide gây ra. Cùng với độc tính trên thận, một số báo cáo đã chỉ ra rằng suy tủy là một trong những độc tính chính của ifosfamide giới hạn liều lượng, và giảm bạch cầu thường nghiêm trọng hơn giảm tiểu cầu [15,16]. Độc tính trên thận của ifosfamide có thể dẫn đến hội chứng Fanconi, trong đó có sự suy giảm chức năng ống lượn gần dẫn đến tổn thương không thể phục hồi, và chất chuyển hóa độc acrolein gây độc niệu với viêm bàng quang xuất huyết [17]. Điều này phù hợp với kết quả của nghiên cứu hiện tại. Trong nghiên cứu mô bệnh học, thận và gan được kiểm tra để khám phá những thay đổi bệnh lý có nguồn gốc từ ifosfamide. Ở cả hai nhóm dùng ifosfamide 75 và 100 mg / kg, các khu vực lớn của sự thoái hóa và giãn nở ống thận được phát hiện cùng với tăng sản niệu quản ở khu vực bể thận. Hơn nữa, sự biểu hiện của KIM -1, một phân tử gây tổn thương ống thận gần, đã hỗ trợ sự hiện diện của độc tính trên thận liên quan đến ifosfamide. Trong khi đó, chỉ quan sát thấy sự hút chân không quanh chu kỳ tối thiểu trong gan. Hơn nữa, mặc dù giá trị AST và ALT giảm phụ thuộc vào liều lượng, nhưng những thay đổi vẫn nằm trong phạm vi tham chiếu [18]. Các lý do sâu hơn cho việc giảm nồng độ men gan sẽ cần được nghiên cứu thêm. Người ta thường chấp nhận rằng ifosfamide là một tác nhân alkyl hóa không thường xuyên liên quan đến độc tính trên gan, và chỉ một số trường hợp được báo cáo là gây tổn thương gan, đặc biệt là khi kết hợp với các thuốc hóa trị liệu khác như doxorubicin [19].

Gần đây, tiến bộ đáng chú ý về dữ liệu biểu hiện gen trong độc chất học với các công nghệ thông lượng cao đã dẫn đến việc tạo ra các bộ dữ liệu đủ lớn trong các nghiên cứu về độc tính, và nhiều nỗ lực đã được thực hiện để áp dụng hồ sơ gen vào dự đoán độc tính hóa học [10,20]. Trong nghiên cứu này, phân tích microarray được thực hiện để phân tích phản ứng của một bộ phận phiên mã được gây ra bởi việc sử dụng ifosfamide và các DEG có thay đổi lần lượt Lớn hơn hoặc bằng 1,5 được chọn làm gen mục tiêu và chức năng sinh học, con đường chuẩn và phân tích danh sách Tox đã được sử dụng để hiểu chức năng của các gen do ifosfamide tạo ra. Một phân tích bổ sung bộ điều chỉnh ngược dòng được thực hiện để đánh giá khả năng nhiễm độc đa cơ quan ở gan và thận.

Trong nghiên cứu này, các DEG đã thay đổi 1. 5- lần được chọn, và các gen điều hòa có ưu thế hơn một chút so với các gen điều hòa ở cả gan (52 phần trăm) và thận (62 phần trăm). Kết quả phân tích chức năng sinh học chỉ ra rằng ifosfamide thay đổi các gen, với các chức năng sinh học liên quan đến sự phát triển mô thường được quan sát thấy ở cả gan và thận.

Một nghiên cứu trước đây của Snouber et al. [21] Điều trị ifosfamide được báo cáo được phát hiện là điều chỉnh giảm các con đường phản ứng oxy hóa do stress qua trung gian Nrf -2 trong môi trường nuôi cấy vi chất lỏng [21]. Phù hợp với các nghiên cứu trước đây, con đường phản ứng stress oxy hóa qua trung gian NRF 2- đã được điều chỉnh đáng kể bởi các mạng hàng đầu, được xác nhận bởi cả con đường chuẩn hiện tại và phân tích danh sách độc tố. Các con đường phản ứng oxy hóa do stress qua trung gian Nrf -2 bị thay đổi hiện tại có thể liên quan chặt chẽ đến chất chuyển hóa độc hại ifosfamide. Nhiều chất chuyển hóa độc hại của ifosfamide có thể phản ứng với GSH, một chất chống oxy hóa mạnh, để tạo thành các liên hợp tại các vị trí khác nhau dọc theo con đường, và sự giảm mức GSH dẫn đến tăng độc tính, điều này cho thấy hàm ý của stress oxy hóa trong việc gây độc cho cơ quan ifosfamide [8,22 ]. Về vấn đề này, mesna và N-acetylcysteine ​​đã được sử dụng để giảm bớt độc tính đối với các cơ quan của ifosfamide. Mesna phục vụ như một chất khử độc khu vực bằng cách liên kết với chất chuyển hóa độc hại ifosfamide, chủ yếu chống lại acrolein, thông qua việc bổ sung Michael để tạo thành một chất ít độc hại hơn [23]. Ngoài ra, N-acetylcysteine ​​được báo cáo là có hoạt tính chống oxy hóa và cải thiện sự suy giảm GSH trong điều kiện stress oxy hóa [24]. Các nghiên cứu sâu hơn là cần thiết để làm sáng tỏ mối quan hệ chính xác giữa thuốc giải độc ifosfamide và con đường được điều chỉnh trong các điều kiện gây độc cho thận. Chúng ta có thể suy đoán rằng độc tính của ifosfamide được cải thiện bởi mesna hoặc N-acetylcysteine ​​có thể được theo sau bởi các con đường phản ứng oxy hóa căng thẳng qua trung gian Nrf -2- được cải thiện.

Trong nghiên cứu này, các tín hiệu liên quan đến viêm nhiễm thường được điều chỉnh ở cả gan và thận, có thể được nhận biết bằng tín hiệu giai đoạn cấp tính trong phân tích đường chuẩn. Kết quả này chỉ ra hàm ý của phản ứng viêm trong sinh lý bệnh của độc tính nội tạng ifosfamide ở cả hai mô, được hỗ trợ thêm bởi phân tích bộ điều chỉnh ngược dòng. Trong phân tích bộ điều hòa ngược dòng, các gen liên quan đến tín hiệu IRF7 và interferon (IFN), bao gồm USP18, RSAD2 và ISG15, được chọn làm cơ quan điều hòa ngược dòng phổ biến trong gan và thận. IRF7 là một yếu tố đặc hiệu lymphoid, được biểu hiện thành phần trong tế bào chất của tế bào miễn dịch, và cũng có thể được gây ra bởi interferon loại I, nhiễm vi rút và các kích thích bên ngoài trong các tế bào khác nhau [25]. Một nghiên cứu trước đây đã báo cáo các đặc tính gây tranh cãi hoặc kháng ung thư của IRF7 trong các tế bào khối u đa dạng, và những thay đổi trong biểu hiện IRF7 có liên quan đến tổn thương DNA [26–28].

Ngoài vai trò điều tiết quan trọng của nó đối với IFN loại I đối với các chức năng kháng vi rút, IRF7 được báo cáo là ngăn chặn các phản ứng viêm nhiễm thông qua con đường tín hiệu TLR4 [29]. Hơn nữa, Stout-Delgado et al. [30] báo cáo rằng sự gia tăng oxy hóa do lão hóa làm suy giảm hoạt động của IRF7, trong khi việc giảm căng thẳng bằng các chất chống oxy hóa đã cải thiện hoạt động của IRF7. Trong nghiên cứu này, việc sử dụng ifosfamide ngăn chặn sự biểu hiện của các chất điều hòa ngược dòng, và các mô hình biểu hiện giống nhau ở cả gan và thận. Những thay đổi hiện tại trong biểu hiện IRF7 có thể liên quan đến phản ứng viêm và thuộc tính tác nhân alkyl hóa gây độc tế bào của ifosfamide, điều này có thể gợi ý IRF7 như một mục tiêu đầy hứa hẹn đối với độc tính đối với cơ quan ifosfamide.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tìm thấy một gen bị ức chế giống nhau ở cả gan và thận sau khi sử dụng ifosfamide, nhưng việc giải thích ý nghĩa độc tính của nó chỉ tập trung vào thận, điều này làm hạn chế sự phát hiện hiện tại. Hơn nữa, các nghiên cứu xác nhận thêm liên quan đến tác dụng của thuốc giải độc ifosfamide có bán trên thị trường đối với gen hiện đã bị thay đổi có thể hỗ trợ các kết quả hiện tại.

Kết luận, một nghiên cứu về độc tính lặp lại (1 tuần) của việc sử dụng ifosfamide được phát hiện có khuynh hướng độc tính trên thận hơn là độc tính với gan. Ngoài ra, các kết quả hiện tại cung cấp bằng chứng về cơ chế gây độc gan và độc thận do ifosfamide liên quan đến việc ức chế IRF -7. Cần có các nghiên cứu sâu hơn về sinh học độc tố về các cơ quan liên quan đến miễn dịch để làm sáng tỏ cơ chế gây độc toàn thân của ifosfamide và hỗ trợ mối quan hệ giữa độc tính gen và cơ quan.

4. Vật liệu và Phương pháp

4.1. Nghiên cứu động vật

Chuột Sprague – Dawley (SD) đực tám tuần tuổi không nhiễm mầm bệnh (n=140) được lấy từ Orient Bio Inc. (Seongnam, Hàn Quốc). Các con vật đã được kiểm tra và làm quen với điều kiện môi trường phòng thí nghiệm trong một tuần trước khi thí nghiệm. Tất cả các động vật được nuôi trong lồng nhựa trong điều kiện phòng thí nghiệm được kiểm soát (nhiệt độ, 23 ± 3 ◦C; độ ẩm, 55 ± 10 phần trăm; và chu kỳ sáng / tối 12 / 12- giờ) với chow phòng thí nghiệm và nước bón lót. Nghiên cứu trên động vật đã được Ủy ban Tổ chức Chăm sóc và Sử dụng Động vật thuộc Viện Độc chất Hàn Quốc (Daejeon, Hàn Quốc) phê duyệt và tất cả các quy trình đều được thực hiện tuân thủ Hướng dẫn Kiểm tra Đánh giá An toàn Thuốc của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hàn Quốc. Nghiên cứu trên động vật được chia thành ba phần: nghiên cứu liều duy nhất (cấp tính) và liều lặp lại (1 tuần và 4 tuần) nghiên cứu độc tính khi dùng liên tiếp. Bốn mươi con chuột được phân ngẫu nhiên vào bốn nhóm (đối chứng, t1, t2 và t3) bằng cách sử dụng hệ thống Path / Tox (phiên bản 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, Hoa Kỳ) trong mỗi nghiên cứu độc tính.

4.2. Thử nghiệm độc tính

Nghiên cứu độc tính được chia thành ba phần: nghiên cứu độc tính liều duy nhất (cấp tính) và hai liều lặp lại (liều liên tiếp trong 1 tuần hoặc 4 tuần). Đối với mỗi nghiên cứu độc tính, chuột được phân ngẫu nhiên vào các nhóm thích hợp (đối chứng, liều 1, liều 2 và liều 3 cho các nghiên cứu độc tính duy nhất và 4- tuần; đối chứng, liều 1 và liều 2 cho 1- nghiên cứu độc tính trong tuần) bằng cách sử dụng hệ thống Path / Tox (phiên bản 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA). Trong nghiên cứu độc tính, ifosfamide được sử dụng qua đường trong phúc mạc (IP), và nhóm đối chứng được uống nước cất (DW). Liều ifosfamide được sử dụng trong nghiên cứu độc tính như sau: nghiên cứu độc tính cấp tính (12,5, 25 và 50 mg / kg), 1- nghiên cứu độc tính trong tuần (75 và 100 mg / kg BW / ngày) và {{19 }} nghiên cứu độc tính trong tuần (25, 50 và 70 mg / kg BW / ngày). Các triệu chứng lâm sàng chung, trọng lượng cơ thể và tỷ lệ tử vong của động vật được ghi lại hàng ngày trong khi sử dụng, và tất cả các động vật đều bị hy sinh 24 giờ sau lần dùng ifosfamide cuối cùng. Mẫu máu được thu thập và đưa vào ống vi ly tâm và ống EDTA-K2 để phân tích sinh hóa huyết thanh và huyết học, tương ứng. Các mô gan và thận được cố định trong formaldehyde và được phân tích mô bệnh học. Hóa mô miễn dịch bổ sung, phân tích microarray và RT-PCR thời gian thực được thực hiện trên các mô gan và thận từ nghiên cứu độc tính bán cấp (100 mg / kg BW / ngày).

4.3. Phân tích huyết học và sinh hóa huyết thanh

Các xét nghiệm huyết học tiêu chuẩn được thực hiện bằng hệ thống huyết học ADVIA 120 (Bayer, Fernwald, Đức). Các chỉ số sau được sử dụng: số lượng bạch cầu (WBC), số lượng hồng cầu (RBC), hematocrit (HCT), nồng độ hemoglobin, thể tích tiểu thể trung bình (MCV), hemoglobin trung bình (MCH), số lượng tiểu cầu (PLT), lymphocyte (LYM), monocyte (MON), neutrophil (NEU), basophil (BAS), eosinophil (EOS), và các tế bào lớn không nhuộm màu (LUC), và số lượng hồng cầu lưới (RET).

Xét nghiệm hóa sinh được thực hiện bằng máy phân tích tự động (TBA 120FRNEO; Toshiba Corp., Tokyo, Japan) với huyết thanh được ly tâm. Các chỉ số sinh hóa chính là alanin aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), phosphatase kiềm (ALP), nitơ nước tiểu trong máu (BUN), creatinin (CREA), glucose (GLU), cholesterol toàn phần (TCHO), tỷ lệ albumin / globulin (A / G), triglyceride (TG), bilirubin toàn phần (TB), gamma-glutamyl transferase (GGT), phospholipid (PL), canxi, clorua, natri vô cơ, phốt pho và kali.

4.4. Kiểm tra mô bệnh học và hóa mô miễn dịch

Các mô nhúng parafin được cắt thành từng đoạn có độ dày 5- µm, được nhuộm bằng hematoxylin và eosin (H&E), và được kiểm tra bằng kính hiển vi.

Các mô thận đã được xử lý hóa mô miễn dịch. Các phần đã khử muối và rửa sạch được ủ trước với 10% huyết thanh dê để ngăn chặn sự nhuộm màu không đặc hiệu. Các phiến kính sau đó được ủ qua đêm với kháng thể kháng KIM1 chính (1: 750; Santa Cruz, CA, USA). Sau khi loại bỏ các kháng thể chính, các phần được xử lý bằng Bộ HRP VECTASTAIN Elite ABC (Phòng thí nghiệm Vector, Peterborough, Vương quốc Anh) và biểu hiện KIM1 được kiểm tra dưới kính hiển vi ánh sáng.

4.5. Phân tích Microarray và Phân tích Tương tác Protein-Protein (PPI)

Gan và thận của nhóm 1- tuần (100 mg / kg) đã được đồng nhất hóa và RNA tổng số được chiết xuất bằng bộ kit RNase mini (Qiagen). Quá trình tổng hợp cDNA được thực hiện bằng cách sử dụng Bộ tổng hợp cDNA (Affymetrix, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) và trải qua các phân tích microarray và PPI.

Phân tích microarray được thực hiện bằng Affymetrix GeneChip Rat {{0}}. 0 với GeneChip Scanner 3 0 0 0 (Affymetrix Santa Clara, CA, USA) và kết quả được xử lý bằng phần mềm phân tích GeneSpring GX v13.0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Các gen biểu hiện khác biệt (DEG), đã thay đổi hơn 1. 5- lần sau khi quản lý ifosfamide, được chọn bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) với bài kiểm tra sau hoc môn Tukey. Các chức năng sinh học và con đường chính tắc của các DEG đã chọn được phân tích bằng cách sử dụng phần mềm Phân tích Lộ trình Thị lực (IPA, phiên bản 9.0; Hệ thống Thị lực, Thành phố Redwood, CA, Hoa Kỳ), và một phân tích bộ điều chỉnh ngược dòng được thực hiện để xác định các bộ điều chỉnh ngược dòng có thể chịu trách nhiệm về các DEG bắt nguồn từ độc tính của ifosfamide. Phân tích mạng tương tác protein-protein bổ sung (PPI) của DEG được thực hiện bằng phần mềm STRING (phiên bản 10) và sự tương tác được xác nhận khi điểm tin cậy trung bình trên 0,4. Tương tác protein là xác suất gần đúng mà một liên kết được dự đoán tồn tại giữa hai protein trong con đường gen và gen của Bách khoa toàn thư Kyoto.

4.6. Nghiên cứu RT-PCR thời gian thực định lượng

Sự biểu hiện của các gen điều hòa chung trong nghiên cứu microarray đã được xác nhận bằng cách sử dụng RT-PCR thời gian thực định lượng. Các đoạn mồi đặc hiệu cho gen được lấy từ Bioneer (Daejeon, Hàn Quốc). Trình tự mồi như sau: yếu tố điều chỉnh interferon 7 (IRF7): thuận, 5- TGCTTGTCTAGCACCAATAG -3 và ngược lại, 5- CACAAGGTCCACTAGAGATG -3; ubiquitin cụ thể peptidase 18 (USP18): chuyển tiếp, 5- CTGTAGTTTGTCTCCCAACA -3 và đảo ngược 5- GAACTGATTACCTCCCACTG -3; miền gốc S-adenosyl methionine chứa 2 (RSAD2): thuận, 5- ACCAATCATCAGAGGTTGAC -3 và ngược lại, 5- CTGCATGATTGTTCTTGGAC -3; gen 15 do interferon kích thích (ISG15): thuận, 5- AAGTCTCCCAAGACCAATTC -3 và ngược, 5- CTACATTGGCTCTGGATAGG -30.

RNA tổng số được phiên mã ngược thành cDNA bằng cách sử dụng SuperScript II (Invitrogen, Carls bad, CA, USA) và cặp mồi oligo-dT, theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mức độ biểu hiện mRNA của các gen liên quan đến quy định ngược dòng được phân tích bằng Hệ thống PCR thời gian thực của StepOnePlus (Hệ thống sinh học ứng dụng, Carlsbad, CA, Hoa Kỳ) với hỗn hợp tổng thể AnSYBR Xanh (Hệ thống sinh học ứng dụng), theo quy trình của nhà sản xuất. Đoạn mồi RNA ribosome 18S được sử dụng làm kiểm soát nội bộ, và kết quả được biểu thị bằng sự thay đổi nếp gấp so với nhóm đối chứng bình thường.

4.7. Phân tích thống kê

Dữ liệu được phân tích thống kê bằng nhiều phương pháp so sánh. Khi kiểm định củaBartlett cho thấy không có sai lệch đáng kể nào so với tính đồng nhất của phương sai, phân tích phương sai (ANOVA) được sử dụng để xác định xem có bất kỳ phương tiện nào trong nhóm khác nhau ở mức ý nghĩa p <{{0}}. 05.="" ngoài="" ra,="" thử="" nghiệm="" của="" dunnett="" được="" sử="" dụng="" để="" xác="" định="" sự="" khác="" biệt="" về="" dữ="" liệu="" giữa="" nhóm="" đối="" chứng="" và="" nhóm="" điều="" trị="" khi="" dữ="" liệu="" được="" tìm="" thấy="" là="" quan="" trọng="" từ="" thử="" nghiệm="" anova.="" hơn="" nữa,="" khi="" quan="" sát="" thấy="" độ="" lệch="" đáng="" kể="" so="" với="" tính="" đồng="" nhất="" phương="" sai="" từ="" thử="" nghiệm="" bartlett,="" một="" thử="" nghiệm="" so="" sánh="" không="" tham="" số,="" thử="" nghiệm="" kruskal="" –="" wallis="" (h),="" được="" tiến="" hành="" để="" xác="" định="" xem="" có="" bất="" kỳ="" phương="" tiện="" nào="" của="" nhóm="" khác="" nhau="" ở="" p=""><0,05 hay="" không.="" khi="" quan="" sát="" thấy="" sự="" khác="" biệt="" đáng="" kể="" trong="" thử="" nghiệm="" kruskal-wallis="" (h),="" kiểm="" tra="" xếp="" hạng="" của="" dunn="" được="" tiến="" hành="" để="" định="" lượng="" các="" cặp="" dữ="" liệu="" nhóm="" cụ="" thể="" khác="" nhau="" đáng="" kể="" so="" với="" giá="" trị="" trung="" bình.="" thử="" nghiệm="" chính="" xác="" của="" fisher="" được="" thực="" hiện="" để="" so="" sánh="" các="" cặp="" dữ="" liệu="" (bao="" gồm="" tỷ="" lệ="" hiện="" mắc="" và="" tỷ="" lệ="" phần="" trăm).="" mức="" xác="" suất="" được="" đặt="" thành="" 1="" hoặc="" 5="" phần="" trăm.="" các="" phân="" tích="" thống="" kê="" được="" thực="" hiện="" bằng="" cách="" so="" sánh="" dữ="" liệu="" từ="" các="" nhóm="" điều="" trị="" khác="" nhau="" với="" dữ="" liệu="" của="" nhóm="" đối="" chứng="" sử="" dụng="" path="" tox="" (phiên="" bản="" 4.2.2,="" xybion="" medical="" systems="" corporation,="" lawrenceville,="" nj,="">

Tuyên bố về tính sẵn có của dữ liệu:

Dữ liệu có trong bài báo hoặc Tài liệu bổ sung.

Xung đột lợi ích:

Nhiều tác giả tuyên bố rằng họ không có hứng thú với việc cạnh tranh.

Người giới thiệu

1. Palmerini, E.; Setola, E.; Grignani, G.; D'Ambrosio, L .; Comandone, A.; Righi, A.; Longhi, A.; Cesari, M.; Paioli, A.; Hakim, R .; et al. Ifosfamide liều cao ở bệnh nhân u xương cấp độ cao tái phát và không thể cắt bỏ: Một đợt hồi cứu. Ô 2020, 9, 2389. [CrossRef]
2. Klastersky, J. Tác dụng phụ của ifosfamide. Ung thư học 2003, 65, 7–10. [CrossRef]
3. Sprangers, B.; Lapman, S. Nỗi đau ngày càng tăng của ifosfamide. Clin. Thận J. 2020, 13, 500–503. [CrossRef]
4. Elias, AD; Ayash, LJ; Máy xúc bánh lốp, C.; Schwartz, G .; Tepler, tôi; McCauley, M. .; Mazanet, R .; Schnipper, L.; Frei, E., thứ 3; Antman, KH ifosfamide / carboplatin / etoposide liều cao hỗ trợ tế bào gốc tạo máu tự thân: An toàn và hướng đi trong tương lai. Semin. Oncol. 1994, 21, 83–85. [PubMed]
5. Mollenkopf, A.; Du Bois, A.; Meerpohl, HG Diễn tiến tuần tự và xử trí tiền cứu độc tính đa cơ quan do ifosfamide gây ra. Geburtshilfe Frauenheilkd. Năm 1996, 56, 525–528. [CrossRef]
6. Aleksa, K.; Matsell, D.; Krausz, K .; Gelboin, H.; Ito, S.; Koren, G. Cytochrome P 450 3 A và 2B6 ở thận đang phát triển: Những ảnh hưởng đến độc tính trên thận của ifosfamide. Nhi khoa. Nephrol. 2005, 20, 872–885. [CrossRef] [PubMed]
7. Lowenberg, D.; Gai, CF; Desta, Z .; Flockhart, DA; Altman, RB; Tóm tắt Klein, TE PharmGKB: Các con đường, dược động học và dược lực học của ifosfamide. Mạng lưới dược phẩm. Genom. 2014, 24, 133. [CrossRef] [PubMed]
8. MacAllister, SL; Martin-Brisac, N.; Lau, V .; Yang, K.; O'Brien, PJ Acrolein và chloroacetaldehyde: Kiểm tra độc tính của tế bào và các dấu ấn sinh học không tế bào. Chèm. Biol. Tương tác. 2013, 202, 259–266. [CrossRef]
9. Kim, J.; Shin, M.Một mô hình tích hợp về dự đoán độc tính do thuốc gây ra trên đa cơ quan sử dụng dữ liệu biểu hiện gen. BMC Bioinform. 2014, 15, S2. [CrossRef]
10. Alexander-Dann, B.; Pruteanu, LL; Oerton, E.; Sharma, N.; Berindan-Neagoe, tôi; Módos, D.; Bender, A. Sự phát triển trong độc tố học: Hiểu và dự đoán độc tính do hợp chất gây ra từ dữ liệu biểu hiện gen. Mol Omics 2018, 14, 218–236. [CrossRef]
11. An, YR; Kim, JY; Kim, YS Xây dựng mô hình dự đoán để đánh giá nhiễm độc đa cơ quan. Mol Toxicol tế bào. 2016, 12, 1–6. [CrossRef]
12. Binotto, G.; Trentin, L.; Semenzato, G. Ifosfamide và cyclophosphamide: Tác dụng trên giám sát miễn dịch. Ung thư học 2003, 65, 17–20. [CrossRef]
13. Schwerdt, G.; Gordjani, N. .; Benesic, A.; Freudinger, R .; Wollny, B.; Kirchhoff, A. .; Gekle, M. Chloroacetaldehyde- và acroleini dẫn đến cái chết của các tế bào ống lượn gần của con người. Nhi khoa. Nephrol. 2006, 21, 60–67. [CrossRef]
14. Ensergueix, G.; Pallet, N.; Joly, D.; Levi, C.; Chauvet, S.; Trivin, C.; Augusto, JF; Boudet, R.; Aboudagga, H.; Touchard, G .; et al. Ifosfamide gây độc cho thận ở bệnh nhân người lớn. Clin. Thận J. 2020, 13, 660–665. [CrossRef]
15. Dechant, KL; Brogden, RN; Pilkington, T.; Faulds, D. Ifosfamide / mesna. Một đánh giá về hoạt động chống ung thư, đặc tính dược động học và hiệu quả điều trị của nó trong bệnh ung thư. Thuốc 1991, 42, 428–467. [CrossRef]
16. Pronk, LC; Schrijvers, D.; Schellens, JHM; De Bruijn, EA; Trồng trọt, A.; Locci-Tonelli, D.; Groult, V .; Verweij, J .; Van Oosterom, AT Giai đoạn I nghiên cứu về docetaxel và ifosfamide ở những bệnh nhân có khối u đặc tiến triển. Br. J. Ung thư. 1998, 77, 153–158. [CrossRef] [PubMed]
17. Skinner, R. Nhiễm độc thận mãn tính ifosfamide ở trẻ em. Med. Oncol nhi. 2003, 41, 190–197. [CrossRef]
18. Sharp, P.; Vilano, JS The Laboratory Rat; CRC Press: Boca Raton, FL, USA, 2012.
19. Cheung, MC; Jones, RL; Judson, I. Độc tính gan cấp tính với ifosfamide trong điều trị sarcoma: Một báo cáo trường hợp. J. Med. Đại diện trường hợp 2011, 5, 180. [CrossRef]
20. Cui, Y.; Paules, RS Sử dụng bảng điểm để hiểu cơ chế gây độc do thuốc. Dược điển học 2010, 11, 573–585. [CrossRef]
21. Snouber, LC; Jacques, S.; Monge, M.; Legallais, C.; Leclerc, E. Phân tích phiên mã về ảnh hưởng của ifosfamide trên các tế bào MDCK được nuôi cấy trong các tế bào sinh học vi chất lỏng. Genomics 2012, 100, 27–34. [CrossRef] [PubMed]
22. Dirven, HA; Megens, L.; Oudshoorn, MJ; Dingemanse, MA; van Ommen, B.; Van Bladeren, PJ Sự liên hợp Glutathione của thuốc kìm tế bào ifosfamide và vai trò của glutathione S-transferase ở người. Chèm. Res. Toxicol. 1995, 8, 979–986. [CrossRef]
23. Jeelani, R .; Jahanbakhsh, S.; Kohan-Ghadr, Nhân sự; Thakur, M.; Khan, S .; Aldhaheri, SR; Yang, Z .; Andreana, P.; Morris, R .; Abu-Soud, HM Mesna (2- mercaptoethane sodium sulfonate) có chức năng như một chất điều hòa myeloperoxidase. Radic miễn phí. Biol. Med. 2017, 110, 54–62. [CrossRef]

24. Alnahdi, A.; John, A. .; Raza, H. N-acetyl cysteine ​​làm giảm căng thẳng oxy hóa và sự mất cân bằng oxy hóa khử phụ thuộc glutathione do điều trị glucose cao / axit palmitic cao trong tế bào Rin -5 F của tuyến tụy. PLoS ONE 2019, 14, e0226696. [CrossRef]

25. Zhang, L. .; Pagano, JS IRF -7, một yếu tố điều chỉnh interferon mới có liên quan đến thời gian chờ của vi rút Epstein – Barr. Mol Biol tế bào. 1997, 17, 5748–5757. [CrossRef]
26. Pagano, JS Virus và u lympho. N. Engl. J. Med. 2002, 347, 78–79. [CrossRef]
27. Romieu-Mourez, R .; Solis, M.; Nardin, A. .; Goubau, D.; Baron-Bodo, V.; Lin, R.; Massie, B.; Salcedo, M.; Hiscott, J. Các vai trò riêng biệt đối với yếu tố điều tiết IFN (IRF) -3 và IRF -7 trong việc kích hoạt các đặc tính chống khối u của đại thực bào ở người. Ung thư Res. 2006, 66, 10576–10585. [CrossRef]
28. Ning, S.; Pagano, JS; Barber, GN IRF7: Kích hoạt, điều chỉnh, sửa đổi và chức năng. Genes Immun. 2011, 12, 399–414. [CrossRef]
29. Chen, PG; Quan, YJ; Zha, GM; Jiao, XQ; Zhu, HS; Zhang, CY; Wang, YY; Li, HP Swine IRF3 / IRF7 làm giảm các phản ứng viêm thông qua con đường tín hiệu TLR4. Oncotarget 2017, 8, 61958. [CrossRef]
30. Stout-Delgado, HW; Yang, X.; Walker, CHÚNG TÔI; Tesar, BM; Goldstein, DR Lão hóa làm suy giảm khả năng điều hòa yếu tố điều hòa IFN 7 trong tế bào đuôi gai plasmacytoid trong quá trình kích hoạt TLR9. J. Immunol. Res. 2008, 181, 6747–6756. [CrossRef]