-Lipoic Acid làm tăng tổng hợp và lắng đọng Collagen trong thận của chuột không bị tiểu đường và tiểu đường

Nevena Grdović và cộng sự

-Lipoic acid (ALA) được sử dụng rộng rãi như một chất bổ sung dinh dưỡng và tác nhân điều trị trong quản lý bệnh tiểu đường. Các chất chống oxy hóa và hạ đường huyết của ALA được thiết lập tốt được coi là đặc biệt quan trọng trong việc chống lại các biến chứng tiểu đường bao gồmthậnvết thương. Nghiên cứu hiện tại đã đánh giá tiềm năng của ALA đối với các sự kiện brotic chuyên nghiệp trongquả thậnđiều đó có thể làm thay đổi cấu trúc và hoạt động của nó. ALA được dùng trong phúc mạc (10 mg / kg) cho chuột đực Wistar không bị tiểu đường và do streptozotocin gây ra trong 4 và 8 tuần. Các hoạt động của ALA được đánh giá bắt đầu từ những thay đổi về cấu trúc / hình thái thông qua những thay đổi đặc trưng cho các quá trình pro-brotic, đến việc điều chỉnh biểu hiện gen collagen trongquả thận. Ở đây, chúng tôi đã chứng minh rằng ALA cải thiện mức độ glucose và urê toàn thân, giảm sự hình thành củathậnsản phẩm cuối glycation tiên tiến (AGEs), và duy trì tính toàn vẹn của cấu trúc thận ở chuột mắc bệnh tiểu đường. Tuy nhiên, các biến cố gây ra bệnh tiểu đường không được ALA làm giảm bớt vì sự tổng hợp / lắng đọng collagen và biểu hiện của yếu tố tăng trưởng biến đổi - 1 (TGF - 1) và-actin cơ mềm (-SMA) vẫn tăng trong ALA- chuột được điều trị bệnh tiểu đường, đặc biệt là sau 8 tuần kể từ khi bệnh tiểu đường khởi phát. Hơn nữa, 8 tuần điều trị chuột không mắc bệnh tiểu đường với ALA đã dẫn đến sự phát triển của các tính năng pro-brotic được tái tạo trong việc tăng tổng hợp / lắng đọng collagen. Bên cạnh tín hiệu xuôi dòng TGF - 1, cơ chế bổ sung cơ bản điều chỉnh collagen IV ở chuột không mắc bệnh tiểu đường được điều trị bằng ALA liên quan đến việc giảm sự methyl hóa DNA của promoter có thể phát sinh do tăng biểu hiện Tet1. Những phát hiện này nhấn mạnh sự thận trọng trong điều trị khi sử dụng ALA, đặc biệt ở những bệnh nhân bịthậnbệnh nhân tiểu đườngcác biến chứng.

Để biết thêm thông tin: ali.ma@wecistanche.com

Bấm để chiết xuất Cistanche bột cho bệnh thận

1. Giới thiệu

Bệnh tiểu đườngquả thậnbệnh (DKD) hoặc bệnh thận do đái tháo đường là một trong những biến chứng vi mạch với tỷ lệ 20-40 phần trăm ở bệnh nhân đái tháo đường, đi kèm với thay đổi cấu trúc tiến triển và mất chức năng thận [1]. Cơ chế sinh lý bệnh làm cơ sở cho DKD rất phức tạp và bắt đầu với tăng đường huyết mãn tính, từ đó gây ra stress oxy hóa, hình thành các sản phẩm cuối của quá trình glycation nâng cao (AGEs), kích hoạt các đường truyền tín hiệu MAPK / PKC, và sự biểu hiện sau đó của một số chất trung gian tiền viêm và pro brotic [2, 3]. Sự xuyên âm giữa các sự kiện này dẫn đến sự tích tụ của các protein chất nền ngoại bào (ECM) trong trung bì và tubulointerstitium với một dạng mô bệnh học cổ điển làthậnfi brosis. Nó bắt đầu với những thay đổi về cấu trúc như dày lên của màng đáy và giãn nở trung bì, dần dần tiến triển thành xơ cứng cầu thận và chứng tràn dịch kẽ cuối cùng lên đến đỉnh điểmthậnthất bại[4, 5].

Chuyển đổi yếu tố tăng trưởng - 1 (TGF - 1) tín hiệu xuôi dòng là một phần của quá trình chữa lành vết thương, khi được duy trì trong tình trạng tăng đường huyết, tăng đường huyết hoặc stress oxy hóa đặc trưng cho bệnh tiểu đường, sẽ chuyển đổi thành bệnh sinh lý bệnh [6] . TGF - 1 là chất trung gian trung tâm của quá trình sinh bệnh DKD, là chất điều hòa chính của biểu hiện protein ECM ở bệnh nhân tiểu đường, có thể là do tăng đường huyết và môi trường oxy hóa bị rối loạn [7–10]. TGF - 1 gây ra sự tích tụ ECM bằng cách kích thích collagen loại I và IV, tổng hợp actin-cơ-răng (-SMA), laminin, và fi bronectin, cũng như bằng cách ức chế các enzym phân giải ECM [11].

Collagen type IV là thành phần cấu tạo nhiều nhất của màng đáy [12], được biểu hiện ở màng đáy cầu thận và ống thận trong các điều kiện sinh lý [13]. Tuy nhiên, bệnh thận do đái tháo đường đi kèm với biểu hiện không ổn định của collagen loại IV, bao gồm sản xuất quá mức và phân bố không đều qua trung gian và trung bì [14–16]. Trong số sáu dạng đồng dạng của collagen loại IV (1- 6), 1 (IV) và 2 (IV) có mặt phổ biến trong tất cả các màng đáy. Chuỗi collagen 1 (IV) và 2 (IV) được mã hóa bởi các gen Col4a1 và Col4a2 có sự điều hòa phiên mã liên quan đến các tương tác cis-trans được mô tả rõ ràng [17], nhưng các liên kết gần đây nhấn mạnh vai trò quan trọng của các cơ chế biểu sinh, bao gồm cả quá trình methyl hóa DNA, trong sự điều chỉnh biểu hiện của chúng [18–20].

Theo quan điểm của các cơ chế sinh lý bệnh đằng sau DKD, các chiến lược điều trị là đơn giản và nhắm mục tiêu tăng đường huyết và stress oxy hóa. Khả năng chống oxy hóa và hạ đường huyết của ALA, một trong những chất chống oxy hóa được sử dụng rộng rãi, được tìm thấy để cải thiệnthậnnhững thay đổi bệnh lý liên quan đến bệnh thận do đái tháo đường [21–23]. Tuy nhiên, liên quan đến lão hóa da, tác dụng có lợi của ALA thông qua tăng tổng hợp collagen loại I trong nguyên bào da của con người đã được báo cáo [24]. Xem xét sinh lý bệnh của DKD, một loại ALA tương tự có thể gây bất lợi cho bệnh nhân đái tháo đường vớithậncác biến chứng. Với nền tảng này, nghiên cứu hiện tại được tập trung để đánh giá các đặc điểm của ALA trên các đặc điểm cấu trúc / hình thái thận và các quá trình tiền xơ với sự nhấn mạnh vào biểu hiện gen collagen loại IV ở chuột mắc bệnh tiểu đường và không mắc bệnh tiểu đường.

2. Vật liệu và Phương pháp

2.1 Hiệp định, Xử lý và Thiết lập Thử nghiệm.Tất cả các thí nghiệm đều được thực hiện trên chuột Wistar bạch tạng đực 5- tháng tuổi nặng từ 220 đến 250 g. Tất cả các quy trình động vật được Ủy ban Đạo đức về Sử dụng Động vật Phòng thí nghiệm của Viện Nghiên cứu Sinh học "Siniša Stan-ković," Đại học Belgrade phê duyệt đều tuân thủ Chỉ thị 2010/63 / EU về bảo vệ động vật dùng để thí nghiệm và các mục đích khoa học khác. Các động vật trong nghiên cứu này được hiến tế bằng một phương pháp vật lý gây tử vong bằng máy chém, theo tất cả các khuyến nghị của hướng dẫn về chế độ chết của động vật. Cái chết xảy ra ngay lập tức và động vật thì không. An tử được thực hiện trong phòng phẫu thuật, ngăn cách với phòng ở, từng con một (các con vật còn lại trong thí nghiệm được giữ trong phòng thí nghiệm được ngăn cách với phòng mổ nơi tiến hành an sinh để tránh căng thẳng cho con khác. loài vật). Euthanasia được thực hiện bởi các stuFF được đào tạo bài bản và giàu kinh nghiệm. Các thiết bị được sử dụng để chặt đầu đang hoạt động tốt (các dịch vụ được thực hiện thường xuyên để cung cấp độ sắc bén của các lưỡi dao).

Bệnh tiểu đường được gây ra bởi nhiều lần tiêm streptozoticin (STZ) (MP Biomedicals) liều thấp (4 0 mg / kg) trong nhiều ngày liên tiếp; chuột đối chứng được tiêm riêng phương tiện (0,1 M natri citrat bu er, pH 4,5). Mức đường huyết được đo trong 24 giờ sau lần tiêm STZ cuối cùng bằng máy đo đường huyết Accu-Chek Active, và các con vật được coi là mắc bệnh tiểu đường khi mức đường huyết lúc đói vượt quá 20 mmol / l. Những con chuột được chia ngẫu nhiên thành bốn nhóm thử nghiệm: đối chứng (đối chứng, n=8), đối chứng được điều trị bằng ALA (ALA, n=8), bệnh nhân tiểu đường (STZ, n=10) và nhóm bệnh tiểu đường được điều trị bằng ALA (STZ / ALA, n=10). ALA (hoạt dịch Ivančić i, Belgrade, Serbia) được tiêm trong màng bụng (10 mg / kg) mỗi ngày trong 4 và 8 tuần, bắt đầu từ mũi tiêm STZ cuối cùng. Sau khi hiến tế và lấy máu, một vết rạch ở bụng được thực hiện và cả haithậnđã được gỡ bỏ. Mộtquả thậnđược đông lạnh trong nitơ lỏng, được giữ ở -80 độ và được sử dụng để phân lập protein, DNA và RNA, trong khi phần còn lại được pha trong 10% formalin đệm để kiểm tra mô học.

2.2.Phân tích hóa sinh.Chuột đã nhịn ăn qua đêm trước khi tế lễ. Huyết thanh máu được thu thập sau khi làm đông máu và ly tâm ở 2, 000 g trong 10 phút. Huyết thanh được sử dụng để xác định nồng độ glucose bằng kit thương mại (Gluco-quant Glucose / HK; Boehringer), mức triglycerid huyết thanh bằng phương pháp GPO-PAP sử dụng kit enzym (Phòng thí nghiệm Randox, Vương quốc Anh), mức urê bằng Xét nghiệm Urea Kit (Abcam, Hoa Kỳ), và nồng độ creatinine khi sử dụng Thử nghiệm Creatinine của Cayman theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.3. Phân tích sinh học và nhuộm miễn dịch.Formalin- fi xedquả thậncác mô bị mất nước trong một loạt xylol và rượu giảm dần để đưa vào sau trong các khối para n. Các khối mô được cắt ở 5 μm trên một microtome quay (RM 2125RT; Leica Microsystem). Để quan sát những thay đổi về hình thái thận, các phần mô được nhuộm bằng phương pháp Axit tuần hoàn – Schi ff (PAS). Hơn nữa, các phần bị ố được phân tích bằng ống soi Olympus (BX -51) được trang bị bộ phản ứng vi mô, giai đoạn cơ giới và máy ảnh, được điều khiển bởi gói phần mềm lập thểCAST mới Hệ thống Tích hợp Visiopharm. Diện tích lòng ống thu được ở độ phóng đại vật kính 40x và được biểu thị bằng phần trăm (phần trăm) trên diện tích được khảo sát. Phần ma trận Mesangial được đánh giá là diện tích nhuộm PAS dương tính, được biểu thị bằng phần trăm trên tổng diện tích cầu thận (độ phóng đại vật kính 100x).

Để phát hiện collagen, các phần mô được nhuộm bằng nhuộm Masson trichrome. Sau khi nhuộm, các phần được quan sát dưới kính hiển vi ánh sáng (Kính hiển vi quang học DM RB Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Đức, được trang bị máy ảnh Leica DFC 320 CCD; vật kính phóng đại 40x). Phân tích hình ảnh được thực hiện bằng phần mềm ImageJ (phiên bản 1.52p, Viện Y tế Quốc gia). Hình ảnh được chuyển đổi thành ngăn xếp RGB và áp dụng ngưỡng thủ công để đánh giá tỷ lệ diện tích collagen trên mỗi vùng mô.

Phân tích hóa mô miễn dịch được thực hiện như mô tả trong [25] bằng cách sử dụng kháng thể đa dòng chống lại N (?) - (carboxymethyl) lysine (CML) (độ pha loãng 1: 50) (Công nghệ sinh học Santa Cruz, CA, Hoa Kỳ) và kháng thể thứ cấp peroxidase củ cải ngựa (1: 100) (Công nghệ sinh học Santa Cruz). Các phần mô được nhuộm bằng 3,3′-diaminobenzidine (DAB), được nhuộm màu với hematoxylin, và được gắn và quan sát dưới kính hiển vi ánh sáng (Kính hiển vi ảnh Leica DM RB; vật kính phóng đại 40x). Phân tích hình ảnh được thực hiện bằng phần mềm ImageJ (phiên bản 1.52p, Viện Y tế Quốc gia). Hình ảnh được xử lý bằng giải mã màu với tùy chọn vectơ H DAB. Tín hiệu CML được tính toán khi cường độ xám trung bình của quá trình nhuộm DAB được chuẩn hóa theo số lượng hạt nhân (thu được bằng cách sử dụng tùy chọn Phân tích hạt).

2.4. Phân tích khối phía tây.25 ug trong sốquả thậncác chất đồng nhất được phân tách bằng SDS-PAGE, được chuyển lên màng polyvinylidene di fl uoride và được thăm dò bằng kháng thể đa dòng chống lại GAPDH (FL -335) và kháng thể đơn dòng chống lại TGF của chuột - 1 (3C11) và SMA (CGA7) tất cả đều từ Công nghệ sinh học Santa Cruz và tất cả được pha loãng theo tỷ lệ 1: 1, 000. Việc phát hiện được thực hiện bằng hệ thống phát hiện phát quang hóa học nâng cao (Công nghệ sinh học Santa Cruz). Định lượng của các dải phản ứng miễn dịch được thực hiện bằng phần mềm điện di TotalLab (Phoretix) (phiên bản 1.10) và chuẩn hóa thành GAPDH được sử dụng làm kiểm soát tải.

2.5. PCR định lượng theo thời gian thực (RT-qPCR).RNA tổng số được phân lập từthậnbằng cách sử dụng RNeasy Mini Kit (Qiagen). Để tổng hợp cDNA, 1 ug trong tổng số RNA được xử lý bằng DNase I và được phiên mã ngược với Bộ tổng hợp cDNA RevertAid First Strand (Fermentas, Burlington, Canada) bằng cách sử dụng hỗn hợp mồi ngẫu nhiên hexamer và oligo (dT). Các mức mRNA được định lượng bằng cách sử dụng 2x Maxima SYBR Green / - ROX qPCR Master Mix (Fermentas) trên hệ thống PCR thời gian thực QuantStudio 3 (Hệ thống sinh học ứng dụng, Carlsbad, CA, Hoa Kỳ). Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast /) được sử dụng để thiết kế các loại mồi (được liệt kê trong Bảng bổ sung S1) để đánh giá Col4a1, Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b, và Biểu thức gen Tet1. Các chu kỳ nhiệt bao gồm biến tính ban đầu ở 95 độ / 10 phút và 40 chu kỳ của PCR hai bước ở 95 độ / 15 giây và 60 độ / 60 giây. Mức độ biểu hiện mRNA của các gen quan tâm được chuẩn hóa thành mức độ biểu hiện mRNA của Actb dưới dạng gen tham chiếu bằng phương pháp 2- dCT.

2.6.Phân lập DNA di truyền và chuyển đổi DNA theo phương thức Bisul.DNA bộ gen được phân lập bằng cách tiếp cận Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB) [26], theo quy trình tách chiết DNA từ mô động vật có vú (có sẵn trực tuyến tại https://bomb.bio/protocols/). DNA bộ gen phải tuân theo giao thức chuyển đổi BOMB bisul te (có sẵn trực tuyến tại https://bomb.bio/protocols/) [26].

2.7.Đo lường mức độ toàn cầu của quá trình methyl hóa DNA.Mức độ methyl hóa DNA toàn cầu được đo bằng bộ kit 5- mC DNA ELISA (Zymo Research, California, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA bộ gen Puri ed (100 ng) được phân lập từthậntừ tất cả các nhóm thử nghiệm đã được sử dụng, và mỗi mẫu được thử nghiệm lặp lại. Dấu hiệu thống kê được ước tính bằng cách sử dụng ANOVA một chiều có chặn, coi mỗi tấm ELISA là một khối.

2.8.Metylation-Speci fi c PCR (MSP).Các cặp mồi để phân tích MSP, được thiết kế trên vùng khởi động của Col4a1 bao gồm vị trí bắt đầu phiên mã (TSS), được thiết kế bằng MethPrimer (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi) (Bảng bổ sung S2 ). Vị trí của mồi (liên quan đến TSS cho Col4a1, được đánh dấu là cộng 1) được sử dụng để phân tích MSP như sau: M fw (-35, -14), M rev (cộng 44, cộng 64), U fw (-35, -14) và U rev (cộng 45, cộng 69). Vì mỗi mồi bao gồm 2 CpG, tổng cộng 4 CpG đã được kiểm tra trạng thái metyl hóa trên mỗi cặp mồi. Hỗn hợp phản ứng cho MSP chứa Maxima SYBR Green / ROX qPCRqRT-PCR Master Mix (Fermentas), 2 0 ng DNA được chuyển đổi bisul và 0,5 μM mỗi mồi đặc biệt cho DNA metyl hóa (M) và không metyl hóa (U) ở thể tích cuối cùng là 10 μL. MSP được thực hiện trên hệ thống PCR thời gian thực QuantStudio 3 (Hệ thống sinh học ứng dụng). Điều kiện chu kỳ PCR như sau: các bước biến tính ban đầu ở 95 độ / 10 phút và tiếp theo là 40 chu kỳ biến tính ở 95 độ / 15 s, và ủ và kéo dài ở 58 độ / 60 s. Mức độ tương đối của DNA bị metyl hóa được biểu thị bằng cách sử dụng chỉ số metyl hóa de fi ned là 2 (chu trình khử metyl hóa Ct) - (chu trình metyl hóa Ct) [27].

2.9 Phân tích thống kê.Dữ liệu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± SD (độ lệch chuẩn) cho tất cả các tham số được nghiên cứu. Bài kiểm tra t của sinh viên được sử dụng để so sánh trung bình của các biến thường được phân tích giữa hai nhóm. Sự khác biệt thống kê giữa các nhóm được phân tích bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều (ANOVA), tiếp theo là kiểm tra so sánh nhiều Tukey sử dụng Phần mềm GraphPad Prism, phiên bản. 5. 00 (Phần mềm GraphPad, San Diego, CA, Hoa Kỳ).

3. Kết quả

3.1 Ảnh hưởng của ALA đến các chỉ số sinh hóa ở chuột mắc bệnh tiểu đường.Glucose, triglyceride, urê và creatinine được xác định trong huyết thanh của chuột mắc bệnh tiểu đường và không mắc bệnh tiểu đường được điều trị ALA (Hình 1). Tình trạng bệnh tiểu đường được theo dõi 4 tuần và 8 tuần, để bao gồm thời gian cần thiết cho các quá trình bất lợi được biểu hiện. Cả hai nhóm chuột mắc bệnh tiểu đường đều được đặc trưng bởi tăng đường huyết, xu hướng tăng của triglyceride và mức creatinine nhưng không có ý nghĩa thống kê, và do mức urê gần như tăng đáng kể. Ở chuột bị tiểu đường, 4 tuần điều trị ALA dẫn đến giảm mức đường huyết về giá trị kiểm soát, trong khi sau 8 tuần mức đường giảm nhưng vẫn tăng đáng kể so với nhóm chứng. Ở cả hai nhóm bệnh nhân tiểu đường được điều trị bằng ALA, triglyceride và creatinine không thay đổi đáng kể. Điều trị bằng ALA hầu như không làm giảm đáng kể mức urê của chuột bị tiểu đường sau 4 tuần, trong khi sau 8 tuần mức urê huyết thanh của chuột bị tiểu đường giảm so với nhóm chứng tiểu đường nhưng không giảm đáng kể về mặt thống kê. Việc sử dụng ALA để kiểm soát chuột không thực sự phản ánh các thông số sinh hóa đã được kiểm tra.

3.2 Đánh giá hình thái cấu trúc thận và sự hình thành CML sau khi điều trị ALA.Phương pháp nhuộm PAS làm nổi bật các đặc điểm mô bệnh học thận đặc trưng liên quan đến bệnh tiểu đường (Hình 2 (a)). Màng đáy cầu thận dày lên xuất hiện sau 4 tuần kể từ khi khởi phát bệnh tiểu đường trong khi sự giãn nở của chất nền trung bì và các ống có lòng mở rộng được quan sát thấy sau 8 tuần kể từ khi khởi phát bệnh tiểu đường. Phân tích mô học cho thấy rằng diện tích lòng ống, cầu thận và chất nền trung bì hầu như không tăng ở chuột mắc bệnh tiểu đường 8 tuần so với chuột đối chứng được điều trị ALA và đối chứng. Tuy nhiên, sau khi điều trị ALA, độ giãn của ống thận và độ giãn nở của chất nền trung bì hầu như không giảm nhưng vẫn ở trên các giá trị kiểm soát, trong khi diện tích cầu thận được hoàn nguyên hoàn toàn về mức kiểm soát. Ở những con chuột đối chứng được điều trị bằng ALA, phần ma trận trung phương được tăng lên cho thấy rằng việc sử dụng ALA lâu dài có thể tạo ra một số đặc điểm cấu trúc trongthận(Hình 2 (a)).

AGEs là yếu tố gây bệnh góp phần gây tổn thương thận trong bệnh tiểu đường. Để kiểm tra xem ALA có gây ra sự tích tụ các sản phẩm AGE trongthậnở chuột mắc bệnh tiểu đường, hàm lượng CML trong thận được đánh giá bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch ở chuột đối chứng, chuột bị tiểu đường (4 và 8 tuần) và đối chứng được điều trị ALA và chuột bị tiểu đường (4 và 8 tuần) (Hình 2 (b)). Nhuộm CML dương tính ở cả hai nhóm chuột mắc bệnh tiểu đường cho thấy CML tích tụ chủ yếu ở tubulointerstitium và ở mức độ thấp hơn ở cầu thận. Theo định lượng của nội dung CML, những thay đổi này không có ý nghĩa thống kê so với các đối chứng tương ứng (Hình 2 (b)). Sau khi điều trị ALA trên chuột mắc bệnh tiểu đường (4 và 8 tuần), cả hoạt tính miễn dịch CML ở mô cầu thận và cầu thận đều giảm rõ rệt trong khi ở chuột đối chứng được điều trị bằng ALA, tình trạng dương tính với CML vẫn không thể phát hiện được như ở đối chứng.

3.3 Ảnh hưởng của ALA đối với sự lắng đọng collagen và biểu hiện gen Col4a1.Phương pháp nhuộm masson trichrome cho thấy sự lắng đọng collagen ở các vùng mô kẽ và trong cầu thận, đặc biệt là ở màng đáy của cả hai ngăn ở nhóm chuột mắc bệnh tiểu đường (4 và 8 tuần) (Hình 3 (a)). Điều trị ALA (4 và 8 tuần) trên chuột không mắc bệnh tiểu đường cũng có liên quan đến sự gia tăng lắng đọng collagen, đặc trưng bởi các khu vực cầu thận và mô kẽ do ma trận nhuộm collagen chiếm giữ nhưng không có dấu hiệu thống kê. Ở chuột tiểu đường được điều trị ALA (4 và 8 tuần), sự lắng đọng collagen vẫn tồn tại liên tục vì không phát hiện thấy sự giảm đáng kể so với chuột bị tiểu đường. Để xác minh sự gia tăng tổng hợp collagen, mức độ biểu hiện gen Col4a1 được đánh giá bằng RT-PCR (Hình 3 (b)). Sự gia tăng đáng kể biểu hiện gen Col4a1 trong thận của chuột mắc bệnh tiểu đường ở cả hai thời điểm, cũng như ở thận của chuột mắc bệnh tiểu đường và không bị tiểu đường được điều trị ALA từ cả hai nhóm thí nghiệm (4 và 8 tuần) đã được phát hiện, so với các đối chứng tương ứng .

3.4.Sự thay đổi sợi xơ liên quan đến bệnh tiểu đường và điều trị ALA.Phân tích Western blot cho thấy mức protein TGF - 1 không thay đổi đáng kể sau 4 tuần bất kể điều trị (Hình 4 (a)). Tuy nhiên, tỷ lệ cảm ứng protein TGF - 1 không thể có ý nghĩa thống kê được phát hiện sau 8 tuần mắc bệnh tiểu đường, giảm nhẹ khi điều trị ALA nhưng vẫn tăng đáng kể so với đối chứng. Hơn nữa, sự cảm ứng tương tự của TGF - 1 đã được quan sát thấy ở động vật không bị tiểu đường được điều trị bằng ALA (Hình 4 (a)). Để kiểm tra xem liệu cảm ứng TGF - 1 có kèm theo sự xuất hiện của dấu hiệu brotic hay không, sự hiện diện của SMA được phân tích bằng cách sử dụng Western blot (Hình 4 (b)). Trạng thái tiểu đường kích hoạt biểu hiện SMA được phát hiện từ tuần thứ tư sau khi bệnh tiểu đường khởi phát trở đi. Điều trị ALA trên chuột mắc bệnh tiểu đường làm giảm SMA xuống mức kiểm soát sau 4 tuần nhưng không hiệu quả sau 8 tuần. Điều trị ALA không làm giảm SMA ở chuột không mắc bệnh tiểu đường sau 4 tuần, trong khi sau 8 tuần, nó dẫn đến tăng biểu hiện SMA so với đối chứng, nhưng sự gia tăng này không có ý nghĩa thống kê (Hình 4 (b)).

Việc điều trị chuột không mắc bệnh tiểu đường bằng ALA dẫn đến những dấu ấn tương tự về các tính năng pro-brotic so với chuột tiểu đường, cho thấy sự cần thiết phải tiết lộ các cơ chế làm cơ sở cho những thay đổi giống như brotic được quan sát thấy ở thận của chuột không bị tiểu đường được điều trị bằng ALA. Để điều tra khả năng các mô đun biểu sinh đại diện cho các cơ chế bổ sung liên quan đến cảnh quan tiền bào tử cung gây ra ALA được quan sát thấy ở chuột không mắc bệnh tiểu đường, trong sự gia tăng đặc biệt của biểu hiện Col4a1, thận từ nhóm kiểm soát và chuột không mắc bệnh tiểu đường được điều trị ALA được tiếp tục phân tích tình trạng methyl hóa DNA .

3.5 Tác động của ALA đối với trạng thái methyl hóa DNA.Mức độ toàn cầu của sự methyl hóa DNA và sự biểu hiện gen của những nhân tố chính liên quan đến sự methyl hóa DNA (Dnmt1, Dnmt3a và Dnmt3b) và demethyl hóa (Tet1) được đánh giá ở thận của những con chuột không bị tiểu đường và những con chuột được điều trị ALA trong 4 và 8 tuần (Hình 5 ). Chỉ có mức mRNA Tet1 là không tăng có ý nghĩa thống kê sau 8 tuần điều trị ALA, trong khi sự biểu hiện của Dnmts và mức độ methyl hóa DNA toàn cầu không cho thấy sự khác biệt đáng kể sau 4 hoặc 8 tuần điều trị ALA so với nhóm chứng.

Thí nghiệm tiếp theo hướng đến việc kiểm tra mức độ methyl hóa DNA cục bộ của gen Col4a1. Dạng chính của collagen IV chứa hai chuỗi 1 (IV) và một chuỗi 2 (IV), được mã hóa bởi các gen Col4a1 và Col4a2, được sắp xếp theo hướng đối đầu tạo thành một đơn vị phiên mã duy nhất và được phiên mã theo các hướng khác nhau so với gen tương hỗ. người xúc tiến [17]. Col4a1 được phiên mã từ vùng liên gen dài 130 bp chứa hai vị trí Sp1, hộp CAAT và CTC [17] (Hình 6 (a)). Tình trạng methyl hóa DNA của promoter Col4a1 / Col4a2 được đánh giá bằng cách sử dụng phân tích MSP và vị trí của mồi được thể hiện trong Hình 6 (a). Cả hai cặp mồi, đặc biệt cho DNA được metyl hóa và cho DNA không được metyl hóa, bao phủ 2 CpG trên mỗi đoạn mồi. Kết quả của MSP cho thấy ALA không xuất hiện trạng thái methyl hóa của promoter Col4a1 / Col4a2 sau khi điều trị kéo dài 4- tuần (Hình 6 (b)). Tuy nhiên, sự giảm chỉ số methyl hóa DNA có ý nghĩa thống kê được quan sát thấy sau 8 tuần điều trị ALA (Hình 6 (b)), cho thấy khả năng ALA điều chỉnh sự biểu hiện Col4a1 trong suốt quá trình thay đổi kiểu methyl hóa DNA của promoter của nó.

4. Thảo luận

Do tỷ lệ dịch bệnh của bệnh tiểu đường, DKD trở thành nguyên nhân thường xuyên nhất của bệnh thận giai đoạn cuối trên toàn thế giới và là yếu tố chỉ định nhiều nhất cho tỷ lệ tử vong sớm ở bệnh nhân tiểu đường [28, 29]. Tỷ lệ DKD ở bệnh nhân đái tháo đường không hề giảm trong những thập kỷ qua mặc dù đã có những biện pháp điều trị tích cực nhằm kiểm soát lượng đường trong máu [28, 30]. Trong số các chiến lược điều trị tiềm năng cho thấy lợi ích chống lại DKD là nhắm mục tiêu stress oxy hóa và trong thuật ngữ đó, ALA có thể cải thiện chức năng thận ở bệnh tiểu đường [29, 31, 32]. Các kết quả thu được trong nghiên cứu hiện tại đã xác định tác dụng hạ đường huyết của ALA nhưng chỉ ra khả năng ALA chống lại nồng độ urê bị rối loạn trong bệnh tiểu đường dài hạn.

Sự gia tăng đường huyết đơn độc hoặc kết hợp với stress oxy hóa là một trong những cơ chế liên quan đến sự hình thành các AGE mà sự tích tụ trong các khoang cầu thận và ống thận tương quan với mức độ tổn thương thận trong hệ thống mô hình thực nghiệm về bệnh thận do đái tháo đường [33, 34] . CML là một trong những AGEs chính in vivo [35] có mức độ gia tăng trong tuần hoàn và các cơ quan bao gồm thận của bệnh nhân đái tháo đường [36], đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của bệnh thận đái tháo đường [37]. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng sự lắng đọng CML chủ yếu tích tụ trong mô ống dẫn trứng và ở mức độ ít hơn trong ngăn cầu thận của thận chuột bị tiểu đường, giảm rõ rệt sau khi điều trị ALA. Theo dữ liệu được công bố, các ống được làm giàu CML có thể là ngăn thận bị tổn thương nghiêm trọng nhất [38–40]. Khác với kết quả của chúng tôi, các tác động hạn chế của ALA đối với hàm lượng CML ở chuột mắc bệnh tiểu đường, được phát hiện bằng phương pháp nhuộm miễn dịch và phân tích hóa học, đã được mô tả [40] và sự mâu thuẫn này có thể phát sinh từ thiết kế thí nghiệm của nghiên cứu.

Phân tích mô học cấu trúc thận bằng phương pháp nhuộm PAS nhuộm các tác nhân ALA bảo vệ có tác dụng trong bệnh tiểu đường. Tác dụng chống oxy hóa có ích của ALA chống lại tổn thương oxy hóa do bệnh tiểu đường gây ra ở thận đã được thiết lập tốt [22, 31, 32]. Điều trị bằng ALA đã được phát hiện để ngăn ngừa tình trạng suy thận và làm giảm bớt những thay đổi bệnh lý về cấu trúc thận bao gồm sự giãn nở chất nền trung bì cầu thận và xơ vữa cầu thận nhờ khả năng chống oxy hóa và giảm đường huyết kết hợp của nó [21, 22]. Xem xét rằng lượng glucose cao, stress oxy hóa và sự hình thành AGEs được thừa nhận là những yếu tố quan trọng gây ra sự thay đổi pro-brotic trong thận [41], chất chống oxy hóa và hạ đường huyết được thiết lập tốt, và khả năng của ALA để giảm hàm lượng CML ủng hộ mạnh mẽ tiềm năng của ALA để giảm bớt quá trình brotic ở thận của người bệnh tiểu đường. Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi cho thấy rằng trong các phần mô thận bị nhuộm màu Masson, mức độ lắng đọng collagen hầu như không thay đổi sau khi điều trị ALA trên chuột mắc bệnh tiểu đường. Hơn nữa, điều trị ALA cho thấy xu hướng tăng tổng hợp collagen / - hàm lượng ở chuột không bị tiểu đường. Theo kết luận của chúng tôi, các tác động bất lợi của ALA đối với thận kiểm soát / khỏe mạnh đã được báo cáo [42]. Nghiên cứu cơ chế tái bảo vệ của ALA trong bệnh thận do đái tháo đường, các tác giả đã bất ngờ phát hiện ra rằng điều trị bằng ALA có liên quan đến sự phát triển của chứng xơ cứng cầu thận, chứng giãn ống thận, và suy giảm chức năng thận ở thận không đái tháo đường. Các nghiên cứu độc lập cho thấy liều lượng ALA cao hơn gây ra tổn thương protein oxy hóa ở chuột già [43] và thậm chí suy giảm chức năng thận ở bệnh tiểu đường [40]. Cùng với điều này, tác dụng prooxidant của ALA đã được chứng minh không chỉ trong các nghiên cứu trên động vật mà còn ở những bệnh nhân suy thận giai đoạn cuối dễ dàng nhận được sắt qua đường tĩnh mạch [44].

Trong bối cảnh các tác động ALA được quan sát thấy trên sự lắng đọng collagen, kết quả của chúng tôi cũng cho thấy rằng ALA không làm giảm mức độ của hai dấu ấn brotic, TGF - 1 và -SMA, ở chuột mắc bệnh tiểu đường sau 8 tuần và thậm chí còn gây ra TGF Biểu hiện - 1 ở chuột không mắc bệnh tiểu đường sau 8 tuần điều trị. Cùng với đó, sự biểu hiện gen của collagen loại IV có thể cao hơn đáng kể ở bệnh nhân tiểu đường cũng như ở chuột tiểu đường và không bị tiểu đường được điều trị ALA so với đối chứng. Trước đây, người ta đã chỉ ra rằng stress oxy hóa tạo ra TGF - 1 và các gen mục tiêu hạ nguồn của nó như collagen loại I, III và IV, cũng như fi bronectin [9, 45] và các chất chống oxy hóa ức chế TGF {{ 10}} biểu thức [46]. Trái ngược với ý tưởng chung về vai trò bảo vệ và chống xơ hóa của chất chống oxy hóa, kết quả của chúng tôi cho thấy ALA có thể có nhiều tác động lên các yếu tố liên quan đến quá trình tạo thận ở thận của bệnh nhân tiểu đường. Có vẻ như đặc hiệu ALA thực sự gây ra biểu hiện của một số gen liên quan đến xơ hóa như TGFB1 và ​​đặc biệt là Col4a1 mà biểu hiện tăng lên đã được phát hiện sau 4 tuần điều trị ALA ở thận đái tháo đường và không đái tháo đường. Sự biểu hiện tăng cường và sự lắng đọng của collagen loại I đã được quan sát thấy sau khi điều trị ALA ở da người [24]. Nghiên cứu tiết lộ rằng việc điều chỉnh collagen loại I là kết quả của tín hiệu xuôi dòng của thụ thể TGF- I, do đó cho thấy tác dụng dược lý mới của ALA liên quan đến quá trình lão hóa da. Xem xét các kết quả được trình bày ở đây, việc điều chỉnh collagens có thể là phản ứng chung của tế bào đối với ALA chứ không phải là đặc tính cơ chế cụ thể đối với nguyên bào sợi ở da.

Sự tổng hợp collagen loại IV được điều chỉnh dựa trên các mức độ phiên mã, phiên mã và sau phiên mã đã được thiết lập tốt, nhưng ngày càng có nhiều dữ liệu về vai trò của quá trình methyl hóa DNA trong biểu hiện Col4a1. Một nghiên cứu được thực hiện cách đây 40 năm cho thấy việc điều trị tế bào u quái F9 bằng chất khử methyl DNA 5- Azacytidine làm tăng biểu hiện Col4a1, cho thấy lần đầu tiên quá trình methyl hóa DNA có thể đóng vai trò quan trọng trong sự biểu hiện của nó [47]. Các nghiên cứu về methylome ở người và transcriptome cho thấy mối tương quan của quá trình methyl hóa promoter Col4a1 với sự biểu hiện của nó trong các tế bào gan và khỏe mạnh được kích hoạt để tạo ra các protein ECM [20, 48]. Điều tương tự cũng được tìm thấy ở các tế bào trung bì nơi sau khi điều trị bằng 5- Azacytidine, mức mRNA Col4a1 tăng lên đáng kể [49]. Hơn nữa, ở những bệnh nhân bị bệnh thận mãn tính, mức độ methyl hóa DNA của các gen Col4a1 và Col4a2 được tìm thấy là thấp hơn đáng kể so với các gen phụ khỏe mạnh và tương quan với sự gia tăng biểu hiện của mRNA và protein [50]. Kết quả của chúng tôi đã chứng minh bằng chứng mạnh mẽ về sự điều hòa biểu hiện Col4a1 thông qua quá trình methyl hóa DNA vì chúng tôi nhận thấy rằng sự biểu hiện Col4a1 tương quan với tình trạng methyl hóa của promoter của nó trong thận. Cần lưu ý rằng những thay đổi quan sát được trong trạng thái methyl hóa của promoter Col4a1 có lẽ hầu hết cũng là biểu hiện của Col4a2, vì hai gen được điều hòa thông qua vùng promoter hai chiều lẫn nhau. Mồi MSP được sử dụng trong các thí nghiệm của chúng tôi được thiết kế để chồng lên nhau một phần với hai vị trí liên kết Sp1 và sự giảm sự methyl hóa DNA mà chúng tôi quan sát thấy sau khi xử lý ALA có thể tái tạo sự liên kết được cải thiện của Sp1 và điều hòa biểu hiện Col4a1.

Những phát hiện của chúng tôi cho thấy sự biểu hiện Col4a1 và tình trạng methyl hóa của nó có xu hướng hoạt động ALA ở động vật không mắc bệnh tiểu đường sau 8 tuần điều trị ALA cũng cho thấy tiềm năng của ALA cũng hoạt động như một chất điều hòa biểu sinh. Theo kết quả của chúng tôi, ALA đã giải phóng enzym Tet1 sau 8 tuần điều trị, theo hướng tăng biểu hiện của nó, điều này cho thấy khả năng quá trình khử methyl đặc biệt của gen có thể xảy ra mà không thể phát hiện được khi methyl hóa DNA toàn bộ gen. Mặc dù có mối tương quan giữa sự gia tăng biểu hiện của Col4a1 và sự giảm sự methyl hóa chất khởi động của nó sau 8 tuần điều trị ALA, nhưng vẫn cần phải xem xét rõ ràng rằng sự khử methyl DNA là mối liên hệ nhân quả duy nhất giữa việc điều trị ALA và sự gia tăng biểu hiện gen collagen đã cho rằng ở tuần thứ 4, sự biểu hiện tăng lên của Col4a1 không liên quan đến sự thay đổi trạng thái methyl hóa của nó. Khả năng của ALA để điều chỉnh một số gen nhất định về mặt biểu sinh đã được đề xuất cho các gen IL -1 và IL {-6 có mức mRNA và protein bị điều chỉnh thấp có liên quan đến quá trình siêu methyl hóa các vùng khởi động của chúng [51, 52]. Mặc dù hypermethylation đã được đề xuất như một trong những cơ chế hoạt động của ALA, các con đường chi tiết của quy định biểu sinh do ALA điều khiển vẫn chưa được làm sáng tỏ và cũng đang chờ được xác định cho các gen khác. Do đó, mối liên hệ giữa tăng tổng hợp / lắng đọng collagen có thể dẫn đến kiểu hình bệnh lý và sự khử methyl DNA qua trung gian Tet của promoter Col4a1 do điều trị ALA gây ra đòi hỏi phải chứng minh thêm và nên cung cấp nền tảng cho các nghiên cứu trong tương lai.

5. Kết Luận

Vai trò bảo vệ của ALA chống lại sự hoạt động sai chức năng liên quan đến bệnh tiểu đường của các cơ quan khác nhau bao gồm cả thận chủ yếu là do hoạt động chống oxy hóa và hạ đường huyết của nó. Tuy nhiên, kết quả được trình bày trong nghiên cứu này cho thấy rằng việc bảo vệ thận trong bệnh tiểu đường bằng ALA có thể bị hạn chế do sự gia tăng tổng hợp / lắng đọng collagen trong thận. Bằng cách phân tích các tác động của ALA đối với các quá trình pro-brotic ở thận chuột mắc bệnh tiểu đường, chúng tôi nhận thấy rằng ALA không làm giảm tổng hợp collagen hoặc các dấu hiệu pro-brotic. Hơn nữa, điều trị bằng ALA góp phần gây ra các biến cố pro-brotic và tổng hợp collagen ngay cả ở thận chuột không mắc bệnh tiểu đường có liên quan một phần đến những thay đổi trong tình trạng methyl hóa DNA của gen Col4a1. Do đó, ở những bệnh nhân bị suy thận, cần thận trọng khi sử dụng ALA để tránh làm trầm trọng thêm biến chứng thận hiện có. Hơn nữa, cần thận trọng khi ALA được sử dụng để tăng cường khả năng chống oxy hóa ở một người khỏe mạnh hoặc trong việc kiểm soát các biến chứng tiểu đường khác vì có lợi cho một biến chứng này có thể gây bất lợi cho biến chứng kia.

1 Phòng Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu Sinh học "Siniša Stanković," Viện Quốc gia Cộng hòa Serbia, Đại học Belgrade, Bulevar Despota Stefana 142, 11060 Belgrade, Serbia

2 Phòng Tế bào học, Viện Nghiên cứu Sinh học "Siniša Stanković," Viện Quốc gia Cộng hòa Serbia,

Đại học Belgrade, Bulevar Despota Stefana 142, 11060 Belgrade, Serbia

Thư từ cần được gửi tới Aleksandra Uskoković; auskokovic@ibiss.bg.ac.rs

Nhận ngày 4 tháng 11 năm 2020; Sửa đổi ngày 19 tháng 2 năm 2021; Được chấp nhận ngày 27 tháng 2 năm 2021; Xuất bản ngày 12 tháng 3 năm 2021

Biên tập viên học thuật: Alin Ciobica

Bản quyền © 2021 Nevena Grdović et al. Đây là một bài báo truy cập mở được phân phối theo Giấy phép Ghi công Creative Commons, cho phép sử dụng, phân phối và sao chép không hạn chế trong bất kỳ phương tiện nào miễn là tác phẩm gốc được trích dẫn chính xác.

Tính sẵn có của dữ liệu

Tất cả dữ liệu có liên quan được sử dụng để hỗ trợ kết luận của nghiên cứu này được bao gồm trong bài báo.

Xung đột lợi ích

Các tác giả tuyên bố rằng không có mối quan tâm nào liên quan đến việc xuất bản bài báo này.

Tác giả đóng góp

Khái niệm và thiết kế các thí nghiệm: MM, NG, AU; Xử lý và điều trị động vật: MĐ, JAJ, AU, SD; Đã thực hiện phân tích mô học, nhuộm miễn dịch, định lượng kết quả: JAJ, MĐ, ST. Đã thực hiện phân tích Western blot: AU, SD, NG; Thực hiện các thí nghiệm RTqPCR: JR, MĐ; Thực hiện các thí nghiệm metyl hoá ADN: JR, AT, MV; Phân tích thống kê: NG; Diễn giải dữ liệu và chuẩn bị các thiết bị: NG, MM; Đã viết bài báo: NG, AU; Bản sửa đổi quan trọng của bản thảo: MV, SD. Tất cả các tác giả đã chấp thuận phiên bản cuối cùng để xuất bản.

Sự nhìn nhận

Công việc này được hỗ trợ bởi Bộ Giáo dục, Khoa học và Phát triển Công nghệ của Cộng hòa Serbia (Số tài trợ 451-03-9 / 2021-14 / 200007).

Nguyên liệu bổ sung

Bảng bổ sung S1: Trình tự các đoạn mồi được sử dụng để phân tích PCR định lượng theo thời gian thực của Col4a1 (chuỗi collagen loại IV alpha 1), Dnmt1 (DNA methyltransferase 1), Dnmt3a (DNA methyltransferase 3 alpha), Dnmt3b (DNA methyltransferase 3 beta), Tet1 (Tet methylcytosine dioxygenase 1) và biểu hiện gen Actb (Actin, beta). Bảng bổ sung S2: Trình tự các đoạn mồi để phân tích MSP về sự methyl hóa DNA của vùng promoter của gen Col4a1. Hình bổ sung S1: Hình ảnh đại diện của phương pháp hấp thu miễn dịch. Mức độ protein của TGF - 1 (A) và SMA (B), hai loại protein liên quan đến chứng bệnh tiểu đường, trong thận của chuột được điều trị hoặc không điều trị, kiểm soát và mắc bệnh tiểu đường ALA, 4 và 8 tuần sau khi khởi phát bệnh tiểu đường, được xác định bởi phương Tây phân tích blot. (Nguyên liệu bổ sung)

Người giới thiệu

[1] RC Atkins, "Dịch tễ học của bệnh thận mãn tính," Kidney International. Bổ sung, tập. 67, trang S14 – S18, 2005.

[2] AB Oyenihi, A. O. Ayeleso, E. Mukwevho, và B. Masala, "Các chiến lược chống oxy hóa trong quản lý bệnh thần kinh do tiểu đường," BioMed Research International, vol. 2015, Bài báo ID 515042, 15 trang, 2015.

[3] M. Lv, Z. Chen, GY Hu, và QB Li, "Các chiến lược điều trị bệnh thận do đái tháo đường: tiến bộ gần đây và viễn cảnh tương lai," Drug Discovery Today, vol. 20, không. 3, trang 332–346, 2015.

[4] A. Karihaloo, "Liệu pháp chống chứng suy nhược và bệnh thận do tiểu đường," Báo cáo Bệnh tiểu đường Hiện tại, tập. 12, không. 4, trang 414–422, 2012.

[5] S. Yamagishi và T. Matsui, "Sản phẩm cuối cùng của quá trình glycation nâng cao, stress oxy hóa và bệnh thận do tiểu đường," Thuốc oxy hóa và tuổi thọ tế bào, tập. 3, không. 2, trang 414–108, 2010.

[6] F. Genovese, AA Manresa, DJ Leeming, MA Karsdal và P. Boor, "Chất nền ngoại bào trong thận: nguồn cung cấp các dấu ấn sinh học không xâm lấn mới của bệnh lý thận ?," Fibrogenesis & Tissue Repair, vol. 7, không. 1, tr. 4 năm 2014.

[7] S. Chen, SW Hong, MC Iglesias-dela Cruz, M. Isono, A. Casaretto, và FN Ziyadeh, "Vai trò quan trọng của hệ thống yếu tố tăng trưởng biến đổi-beta trong cơ chế bệnh sinh của bệnh thận do đái tháo đường," Suy thận, tập. 23, trang 471–481, 2001.

[8] BB Ho ff man, K. Sharma, Y. Zhu, và FN Ziyadeh, "Kích hoạt phiên mã của yếu tố tăng trưởng biến đổi - 1 trong nuôi cấy tế bào trung bì bằng nồng độ glucose cao," Kidney International, vol. 54, không. 4, trang 1107–1116, 1998.

[9] M. Gonzalez-Ramos, S. de Frutos, M. Griera, và các cộng sự, "Kinase liên kết với Integrin làm trung gian điều hòa tăng trưởng - 1 yếu tố tăng trưởng biến đổi phụ thuộc hydro," Free Radical Biology & Medicine, vol. 61, trang 416–427, 2013.

[10] K. Sharma và TA McGowan, "TGF- trong bệnh thận do đái tháo đường: vai trò của các con đường truyền tín hiệu mới," Cytokine & Growth Factor Reviews, vol. 11, không. 1-2, trang 115–123, 2000.

[11] FJ Lopez-Hernandez và J.M Lopez-Novoa, "Vai trò của TGF- trong bệnh thận mãn tính: sự kết hợp của các hoạt động của ống, cầu thận và mạch máu," Nghiên cứu Tế bào và Mô, tập. 347, không. 1, trang 141–154, 2012.

[12] PD Yurchenco và JJ O'Rear, "Tập hợp lớp cơ bản", Ý kiến ​​hiện tại trong sinh học tế bào, tập. 6, không. 5, trang 674–681, 1994.

[13] A. Nerlich và E. Schleicher, "Định vị hóa mô miễn dịch của các thành phần chất nền ngoại bào trong tổn thương cầu thận do đái tháo đường ở người," Tạp chí Bệnh học Hoa Kỳ, vol. 139, không. 4, trang 889–899, 1991.

[14] RM Mason và NA Wahab, "Chuyển hóa chất nền ngoại bào trong bệnh thận do đái tháo đường," Tạp chí của Hiệp hội Thận học Hoa Kỳ, vol. 14, không. 5, trang 1358–1373, 2003.

[15] RE Gilbert, A. Cox, LL Wu và cộng sự, "Biểu hiện của sự biến đổi yếu tố tăng trưởng-beta 1 và collagen loại IV trong tubulointerstitium thận trong bệnh tiểu đường thực nghiệm - ví dụ như ức chế men chuyển," Diabetes, vol. 47, không. 3, trang 414–422, 1998.

[16] MS Razzaque, T. Koji, Y. Horita, và cộng sự, "Tổng hợp collagen loại III và collagen loại IV bởi tế bào biểu mô ống trong bệnh thận do tiểu đường," Bệnh lý, Nghiên cứu và Thực hành, vol. 191, không. 11, trang 1099–1104, 1995.

[17] JP Grande, DC Melder, DL Kluge, và ED Wieben, "Cấu trúc của chất thúc đẩy collagen IV của chuột," Biochimica et Bio- Physica Acta, vol. 1309, không. 1-2, trang 85–88, 1996.

[18] E. Verdura, D. Hervé, F. Bergametti, và cộng sự, "Sự phá vỡ vị trí liên kết miR -29 dẫn đến sự tăng điều hòa COL4A1 gây ra bệnh vi mô chi phối tự thể của pontine với bệnh não do bạch cầu," Biên niên sử về Thần kinh học, tập. 80, không. 5, trang 741–753, 2016.

[19] M. Gri ffi ths, M. Van Sinderen, K. Rainczuk và E. Dimitriadis, "miR -29 c biểu hiện quá mức và sự điều hòa giảm COL4A1 ở nội mạc tử cung người vô sinh làm giảm khả năng kết dính của tế bào biểu mô nội mạc tử cung _ trong ống nghiệm _ ngụ ý về vai trò trong khả năng tiếp nhận, "Báo cáo Scienti fi c, tập. 9, không. 1, tr. 8644, năm 2019.

[20] A. El Taghdouini, AL Sørensen, AH Reiner, và cộng sự, "Phân tích toàn bộ hệ gen về sự methyl hóa DNA và các mô hình biểu hiện gen trong các tế bào gan người chưa được nuôi cấy tinh khiết và các tế bào hình sao gan đã hoạt hóa," Oncotarget, vol. 6, không. 29, trang 26729– 26745, 2015.