Cơ chế và tác dụng bảo vệ thần kinh của Procyanidins trong ống nghiệm và trong Vivo Phần 2
Mar 21, 2022
Xin vui lòng liên hệoscar.xiao@wecistanche.comđể biết thêm thông tin
3. Thảo luận
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng PC thể hiện các hoạt động chống oxy hóa và loại bỏ gốc mạnh] {1}} Tôi và stress oxy hóa gây ra do sản xuất quá mức ROS và / hoặc suy giảm hệ thống bảo vệ chống oxy hóa đóng một vai trò quan trọng trong các bệnh thoái hóa thần kinh [ -6, 28,29]. Tuy nhiên, tác dụng bảo vệ thần kinh và cơ chế của PC liên quan đến tổn thương oxy hóa vẫn chưa rõ ràng. Do đó, nghiên cứu này đã nghiên cứu về tác dụng và cơ chế của PC trong việc bảo vệ thần kinh.
Vui lòng bấm vào đây để biết thêm
Trong nghiên cứu này, nồng độ thích hợp của PC đã cải thiện mức độ của các enzym chống oxy hóa, bao gồm GSH-Px, CAT và SOD, nhưng làm giảm mức độ ROS và MDA trong các mô hình tổn thương oxy hóa so với các phép đo chỉ sử dụng H, O. Những phát hiện hiện tại này phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho thấy rằng bổ sung ít PC qua chế độ ăn uống có thể cải thiện hoạt động của GSH-Px, CAT và SOD ở heo con cai sữa [30]. Một nghiên cứu khác cũng cho rằng PC làm tăng đáng kể các hoạt động CAT và SOD và giảm hàm lượng MDA, do đó cải thiện chất lượng của tinh trùng dê [31].
Cistanche có thể cải thiện khả năng miễn dịch
Con đường Nrf2 / ARE là một con đường chống oxy hóa đáng kể [32-34]. Thông thường, Nrf2 cư trú trong tế bào chất, nơi nó được liên kết với protein ức chế, Keap135,36]. Khi kích thích H2O2, Nrf2 tách khỏi Keap1, khởi động hệ thống bảo vệ chống oxy hóa nội sinh, và sau đó chuyển vào nhân [34,37,38]. Sau đó, nó tương tác với ARE để kích hoạt một loạt các gen chống oxy hóa và bảo vệ tế bào, bao gồm GCLC, GCLM, NOO1 và HO -139, 40]. Để phản ứng với stress oxy hóa, tương tự như những thay đổi được thấy trong quá trình kích thích H-O2, Nrf2 phân ly khỏi Keap1 trong tế bào và sau đó được chuyển vào nhân, liên kết với trình tự ARE để kích hoạt phiên mã của các gen bảo vệ lạnh [41,42]. Chúng tôi quan sát thấy rằng nồng độ thích hợp của PC đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc bản địa hóa hạt nhân của Nrf2 trong các điều kiện làm giảm H, O 2- trong các tế bào PC12. Hơn nữa, nồng độ thích hợp của PC điều hòa rõ rệt mức độ biểu hiện của NOO1, HO -1, GCLM và GCLC, tất cả đều có thể trực tiếp hoạt động để loại bỏ các gốc tự do và các phân tử oxy hóa [43]. Do đó, những kết quả này cho thấy rằng nồng độ PC thích hợp làm tăng mức độ của con đường Nrf2 / ARE. Tiếp theo, gen Nfr2 im lặng thông qua Nrf2 siRNA được sử dụng để đánh giá thêm vai trò của việc kích hoạt Nrf2 / ARE trong bảo vệ thần kinh qua trung gian PC chống lại tổn thương oxy hóa gây ra bởi H, O 2-. Tế bào được chuyển gen Nrf 2- siRNA cho thấy sự biểu hiện Nrf2 giảm rõ rệt. Đồng thời, chúng tôi nhận thấy rằng loại bỏ Nrf2 đã loại bỏ khả năng bảo vệ qua trung gian của PC chống lại H2O, sự suy giảm khả năng tồn tại của tế bào đã được điều trị và loại bỏ Nrf2 cũng loại bỏ tác dụng chống oxy hóa của PC. Những phát hiện này phù hợp với một nghiên cứu trước đây cho rằng việc cải thiện việc kích hoạt con đường Nrf2 / ARE góp phần vào việc bảo vệ thần kinh [44]. Do đó, các kết quả hiện tại chỉ ra rằng con đường Nrf2 / ARE có thể đại diện cho mục tiêu dược lý của PC để ngăn ngừa thoái hóa thần kinh.
4. Vật liệu và phương pháp 4.1. Hóa chất và Thuốc thử
H2O2 được mua từ HUSHI (HUSHI, Thượng Hải, Trung Quốc). CCK -8, NAC đã được mua từ Beyotime (Beyotime, Thượng Hải, Trung Quốc). PC, 2 ', 7 / -dichlorofluorescein diacetate, MDA, GSH-Px, bộ dụng cụ chẩn đoán SOD và bộ dụng cụ chẩn đoán CAT đã được mua từ Solarbio (Solarbio, Bắc Kinh, Trung Quốc) .RNAi Plus, Bộ thuốc thử PrimeScript RT với gDNA Eraser và SYBR Premix Ex Tag II được mua từ Takara (Takara, Shiga, Nhật Bản). Nrf 2- siRNA, control-siRNA và lipofectamine 2000 được lấy từ GenePharma (GenePharma, Thượng Hải, Trung Quốc). Các kháng thể chính sau đây và các kháng thể thứ cấp tương ứng được lấy từ Proteintech (Proteintech, Vũ Hán, Trung Quốc): Nrf2, HO -1, GCLC, GCLM, NAD (P) H: NQO1, lamin B và GAPDH.
4.2. Nuôi cấy tế bào
Tế bào PC12 được lấy từ Bộ sưu tập quốc gia về nuôi cấy tế bào xác thực. Các tế bào được duy trì trong môi trường DMEM được bổ sung 10% huyết thanh bò thai và penicillin-streptomycin （100 U / mL; 100 ug / mL） trong tủ ấm được làm ẩm ở 37 độ với 5% CO2.
4.3. Thử nghiệm khả năng tồn tại của tế bào
Tế bào PC12 được gieo vào 96- đĩa giếng với mật độ 1 × 104 tế bào / giếng. Các tế bào được tiếp xúc với các nồng độ khác nhau của PC hoặc NAC （20 μM） trong 24 giờ, sau đó chúng được ủ với 200 μM H2O2, trong 24 giờ. Tiếp theo, dung dịch 10 μLof CCK -8 được thêm vào mỗi giếng và ủ trong 1 giờ, sau đó độ hấp thụ được đo ở bước sóng 450 nm.
4.4. Bảo dưỡng cá
Sự chấp thuận về mặt đạo đức đối với việc sử dụng động vật đã được cấp bởi Ủy ban Bảo tồn và Sử dụng Động vật của Trung tâm Động vật Thực nghiệm tại Đại học Chiết Giang (ZJU20200125). Cá ngựa vằn trưởng thành (Danio rerio, dòng AB) được lấy từ trung tâm động vật thí nghiệm của Đại học Chiết Giang và duy trì ở 28 ± 1C trong chu kỳ sáng / tối 14 / 10- giờ [21J. Cá được cho ăn Artemia nauplii hai lần mỗi ngày. Để tạo ra phôi, cá ngựa vằn trưởng thành được đặt qua đêm trong bể sinh sản với tỷ lệ 1: 1, đực: cái. Sinh sản được kích hoạt trong vòng 2 giờ sau khi đèn được bật vào sáng hôm sau. Phôi được nuôi trong nước phôi ở 28 độ [45].
4.5. Các phép đo ROS
Để đo sản xuất ROS in vivo, ấu trùng cá ngựa vằn (chủng AB), 3 ngày sau khi thụ tinh （pdf） được tiếp xúc với NAC （30 μM） hoặc các nồng độ PC khác nhau khi không có hoặc có mặt 300 μM H, O, trong 4 ngày. Sau đó, ở 7 pdf, các nhóm xử lý khác nhau được chuyển vào một 24- đĩa giếng (10 ấu trùng cá ngựa vằn mỗi nhóm) được xử lý với 20 uM của dung dịch diacetate 2 ', 7'-dichlorofluorescein, và được ủ trong 60 phút trong vùng tối ở 28,5 độ C [46]. Tiếp theo, ấu trùng được rửa ba lần với môi trường phôi để loại bỏ 2'7'-dichlorofluorescein diacetate dư thừa. Các ấu trùng nhuộm màu sau đó được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi đồng tiêu quét laser của Olympus. Cường độ huỳnh quang của từng ấu trùng được định lượng thông qua phần mềm Image].
Để đo sản xuất ROS In vitro, tế bào PC12 được cấy vào 6- đĩa giếng với mật độ 2 × 10 * tế bào / giếng. Các tế bào được tiếp xúc với các nồng độ khác nhau của PC hoặc NAC (20 uM) trong 24 giờ và sau đó được ủ với 200 uM HO trong 24 giờ. Các tế bào được ủ với 10 μM dung dịch diacetate 2 ', 7'-dichlorofluorescein trong bóng tối trong 30 phút; sau đó, dung dịch thuốc nhuộm được loại bỏ, và các tế bào được rửa ba lần trong nước muối có đệm phosphat. Sau đó, các tế bào được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi tiêu điểm quét laser của Olympus. Cường độ huỳnh quang của các tế bào được định lượng thông qua phần mềm Image].
4.6.Đánh giá MDA, GSH-Px, SOD và CAT
Ấu trùng cá ngựa vằn （chủng AB） at3 pdf được tiếp xúc với NAC （30 μM） hoặc các nồng độ PC khác nhau khi không có hoặc có mặt 300 uM H2O, trong 4 ngày. Những con cá ngựa vằn 7 dpf được gây mê bằng tetracaine và đồng nhất sau khi cho chết trên băng. MDA, GSH-Px, CAT và SOD được phân tích đồng thời, theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mỗi thí nghiệm chứa 20 ấu trùng và mỗi chỉ số đo được được lặp lại ba lần.
Tế bào PC12 được cấy vào 6- đĩa giếng với mật độ 2 × 10 * tế bào / giếng. Các tế bào được tiếp xúc với các nồng độ khác nhau của PC hoặc NAC (20 uM) trong 24 giờ và sau đó được ủ với 200 uM H2O, trong 24 giờ. Tiếp theo, tế bào PC12 được thu thập và ủ với đệm ly giải. Các hoạt động MDA, GSH-Px, SOD và CAT được đo bằng cách sử dụng các bộ xét nghiệm tương ứng, theo quy trình của từng nhà sản xuất. Mỗi chỉ số đo được lặp lại trong ba lần.
4.7 Tách chiết RNA tổng số, phiên mã ngược và phản ứng chuỗi polymerase định lượng trong thời gian thực
Ấu trùng cá ngựa vằn （chủng AB） at3 dpf đã tiếp xúc với NAC （30 μM） hoặc các nồng độ PC khác nhau khi không có hoặc có mặt 300 uM H, O, trong 4 ngày. Sau khi xử lý, RNA được chiết xuất bằng RNAiso, theo hướng dẫn của nhà sản xuất. RNA đã được phiên mã ngược bằng cách sử dụng PrimeScript RT Kit với công cụ tẩy gDNA, theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Takara, Shiga, Nhật Bản). PCR thời gian thực định lượng được thực hiện với Hệ thống PCR thời gian thực Vi -7 sử dụng SYBR Premix Ex TaqII -actin được sử dụng làm gen tham chiếu và biểu hiện gen tương đối được tính bằng cách sử dụng 2- AACt phương pháp. Trình tự mồi được sử dụng được liệt kê trong Bảng 1.
4.8. Chuyển nạp siRNA Nrf2
Nrf 2- siRNA đã được sử dụng để đánh bại Nrf2. Tế bào PC12 được gieo vào 6- đĩa nuôi cấy tốt và sau đó được truyền Nrf 2- siRNA (80 nM) hoặc kiểm soát-siRNA bằng cách sử dụng Lipofectamine 2000, theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
4.9.Chuẩn bị protein nguyên tế bào, tế bào chất và hạt nhân
Để chiết xuất protein toàn tế bào, các tế bào được thu thập và ủ với đệm ly giải RIPA có chứa 1% PMSF và 1% cocktail chất ức chế protease trong 30 phút trên đá. Dịch ly tâm tế bào được ly tâm, và phần nổi phía trên được thu thập và lưu trữ. Để chuẩn bị phân đoạn dưới tế bào, các mẫu tế bào được xử lý bằng cách sử dụng bộ tách chiết protein tế bào chất và hạt nhân. Hàm lượng protein được kiểm tra bằng cách sử dụng xét nghiệm BCA. 4.10.Western Blotting
Các mẫu protein bị tách ra được phân giải bởi SDS-PAGE và chuyển sang màng polyvinylidene-difluoride. Sau đó, các đốm màu được ủ với các kháng thể chính sau: Nrf2, Keapl, HO -1, NQO1, GCLC, GCLM, Lamin B, hoặc GAPDH. Màng sau đó được rửa bằng TBST trong 5 phút; điều này được lặp lại 5 lần. Sau đó, các đốm màu được ủ trong các kháng thể thứ cấp liên hợp với peroxidase. Cuối cùng, các dải protein đã được hình dung bằng cách sử dụng thuốc thử phát hiện thấm ECL cộng với Western.
4.11 Thử nghiệm hành vi địa điểm
Ấu trùng cá ngựa vằn （chủng AB） ở 3 pdf được tiếp xúc với NAC （30 μM） hoặc các nồng độ PC khác nhau khi không có hoặc có mặt 300 μM HO, trong 4 ngày. Sau đó, ở 7 pdf, những ấu trùng đã qua xử lý này được mạ vào 24- đĩa giếng (một con cá cho mỗi giếng và 12 con cho mỗi nhóm). Chúng tôi sử dụng Any-maze 4.73 để đo hành vi vận động của ấu trùng cá ngựa vằn, và tính tổng quãng đường di chuyển trong 10 phút [47].
4.12. Phân tích thống kê
Dữ liệu được hiển thị dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) của ít nhất ba thí nghiệm độc lập. Phân tích một chiều phương sai (ANOVA) và kiểm tra nhiều phạm vi của Duncan được sử dụng để xác định ý nghĩa thống kê và sự khác biệt được coi là có ý nghĩa khi p<0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" via="" spss,="" version="">
5. Kết Luận
Kết luận, những phát hiện hiện tại chỉ ra rằng PC phát huy tác dụng bảo vệ thần kinh thông qua việc kích hoạt con đường Nrf2 / ARE và các enzym giải độc và enzym chống oxy hóa hạ nguồn của nó. Tổng hợp lại, PC có thể có tác dụng bảo vệ đối với các rối loạn thoái hóa thần kinh.
Sự đóng góp của tác giả:Khái niệm hóa, JCandJZ. (Jiajin Zhu); phương pháp luận, JC; phần mềm, YC; xác nhận, YZ., JZ (Jiawen Zhao) và HY; phân tích chính thức, JC; điều tra, YC; tài nguyên, JZ (iajin Zhu); quản lý dữ liệu, JC; viết — chuẩn bị bản thảo ban đầu, JC; viết — đánh giá và chỉnh sửa, JZ. (iajin Zhu); hình dung, JC; giám sát, ĐL; quản lý dự án, JZ (Jiajin Zhu); mua lại tài trợ, JZ (Jiajin Zhu). Tất cả các tác giả đã đọc và đồng ý với phiên bản xuất bản của bản thảo.
Kinh phí:Nghiên cứu này không nhận được tài trợ từ bên ngoài.
Tuyên bố của Hội đồng Rà soát Thể chế:Nghiên cứu được thực hiện theo hướng dẫn của Tuyên bố Helsinki, và được sự chấp thuận của Ủy ban Đạo đức của Ủy ban Bảo tồn và Sử dụng Động vật thuộc Trung tâm Động vật Thực nghiệm tại Đại học Chiết Giang (ZJU20200125). Tuyên bố đồng ý được thông báo: Không áp dụng.
Tuyên bố về tính sẵn có của dữ liệu:Dữ liệu được chứa trong bài báo. Xung đột lợi ích: Các tác giả tuyên bố không có xung đột lợi ích.
Tính sẵn có của mẫu: Các mẫu của các hợp chất không có sẵn từ các tác giả.
Bài viết này được trích từ Molecules 2021, 26, 2963. https://doi.org/10.3390/molecules26102963 https://www.mdpi.com/journal/molecules
