Phần 1: Một chất ức chế NF-kB và một người ủng hộ AMPK: Dự đoán mạng và tích hợp đa phương pháp để tạo ra các con đường tín hiệu cho Acteoside chống lại bệnh Alzheimer

Liên hệ: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Ying-Qi Li1†, Yi Chen1†, Si-Qi Jiang1 , Yuan-Yuan Shi2 , Xiao-Li Jiang1 , Shan-Shan Wu1 , Ping Zhou1 , Hui-Ying Wang1 , Ping Li1* và Fei Li1,2*

¹ Tiểu bang Chìa khóa Phòng thí nghiệm của Thiên nhiên Các loại thuốc, Trung Quốc Dược phẩm Trường đại học, Nam Kinh, Trung Quốc, ² Trường đại học của Tiệm thuốc,Đại học Y Tân Cương, Urumqi, Trung Quốc

GIỚI THIỆU

Với sự già hóa và gia tăng dân số nhanh chóng, số trường hợp sa sút trí tuệ trên thế giới có xu hướng gia tăng.Bệnh Alzheimer(AD) là một bệnh thoái hóa thần kinh phổ biến kèm theo suy giảm nhận thức và rối loạn vận động (Perea và cộng sự, 2020), đây là loại sa sút trí tuệ thường gặp nhất. Nó được đặc trưng bởi mất tế bào thần kinh nghiêm trọng, các mảng lão hóa và các đám rối thần kinh (Shiao et al., 2017). Cơ chế bệnh sinh của AD(Bệnh Alzheimer)là đa chiều và liên kết với sự kết hợp thần kinh. Sự hình thành tế bào thần kinh được thúc đẩy bởi sự hoạt hóa của các tế bào thần kinh đệm, có liên quan chặt chẽ đến sự xuất hiện và phát triển của AD(Bệnh Alzheimer)(Hanslik và Ulland, 2020; Linnerbauer và Rothhammer, 2020). Trong quá trình tiến triển và trầm trọng thêm của rối loạn thần kinh, microglia được coi là một yếu tố chính.

Microglia là các tế bào miễn dịch chính trong hệ thần kinh trung ương, có liên quan chặt chẽ với một loạt các quá trình như phát triển não, duy trì môi trường thần kinh, cũng như phản ứng với chấn thương và sửa chữa (Perea và cộng sự, 2020). Hơn nữa, microglia có thể được kích thích thành kiểu hình M1 và làm tăng sự biểu hiện của các cytokine hỗ trợ khi các bệnh liên quan đến neuroin ammation như AD(Bệnh Alzheimer)xảy ra (Tsukahara và cộng sự, 2020). Các nghiên cứu cũng chứng minh rằng sự phân cực thành kiểu hình M1 thường đi kèm với rối loạn chuyển hóa (Li L. và cộng sự, 2020), dẫn đến mất cân bằng chuyển hóa năng lượng và rối loạn chức năng ty thể (Agrawal và Jha, 2020). Những thay đổi bất lợi này có nguồn gốc từ sự thoái hóa thần kinh, thậm chí là AD(Bệnh Alzheimer).

Acteoside(ACT), một glycoside phenylethanoid, chủ yếu có nguồn gốc từCistanche tubulosa. Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy ACT sở hữu nhiều hoạt động dược lý, bao gồm bảo vệ thần kinh (Wei và cộng sự, 2019), chống kích thích (Lai và cộng sự, 2019) và chất chống oxy hóa (Ji và cộng sự, 2019). Đặc biệt, nó đã được chứng minh rằng ACT có thể cải thiện khả năng học tập và suy giảm trí nhớ cũng như điều chỉnh chuyển hóa năng lượng ở chuột gây ra bởi streptozotocin (Chen J. và cộng sự, 2020). Ngoài ra, nó cũng có thể ức chế sự chết của tế bào apoptotic thần kinh và tổn thương ty thể ở chuột bị viêm cơ não tự miễn thực nghiệm (Li W. và cộng sự, 2020). Tuy nhiên, tác động của ACT đối với sự phân cực microglia M1 / ​​M2 và cơ chế của nó hiếm khi được báo cáo. Cho đến nay, các cơ chế như sửa chữa chức năng của ti thể và điều hòa sự trao đổi chất của tế bào vẫn chưa rõ ràng và cần phải nghiên cứu thêm để làm rõ cơ chế chính xác.

Mục đích của báo cáo này là điều tra hiệu quả điều trị của ACT cũng như cơ chế phân tử cơ bản của ACT trên AD(Bệnh Alzheimer). Trong đây, một phương pháp xác định mục tiêu thuốc có hệ thống trong phương pháp silico được thiết lập dựa trên cơ sở dữ liệu hợp nhất. Chúng tôi nghiên cứu sâu hơn các cơ chế có thể có của ACT ở cấp độ sinh học phân tử bằng cách tích hợp giải trình tự RNA (RNA-seq) với phương pháp chuyển hóa và kỹ thuật sinh học phân tử. Sự kết hợp của chiến lược sàng lọc hệ thống in silico, in vivo và in vitro cung cấp một quy trình mới để khám phá một cách khách quan các hợp chất đa mục tiêu của y học cổ truyền Trung Quốc.

Cistanche tubulosa có thể điều trịBệnh Alzheimer

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Mô hình mạng

Bốn nền tảng trực tuyến đã được kết hợp để dự đoán và khám phá các mục tiêu của ACT, đó là GeneCards1, phương pháp tiếp cận tổng thể tương tự (SEA2), SwissTargetPrediction3 và PharmMapper4. Tất cả các liên kết gen của AD(Bệnh Alzheimer)được thu thập độc lập từ DisGeNET5 và GeneCards. Sau khi phân tích tương tác mục tiêu - đích được thực hiện bởi String database6, mạng được tích hợp thêm bằng phần mềm Cytoscape (Phiên bản 3.8.2). Phân tích làm giàu GO và KEGG được thực hiện trên cơ sở dữ liệu DAVID7 để chú thích và khai thác mạng.

Động vật và Nhóm mô hình

Ngựa vằn kiểu hoang dã fi sh (dòng AB, 4 tháng tuổi) được chọn trong nghiên cứu này (Công ty TNHH Công nghệ sinh học Nam Kinh Qi Wu). Chúng được duy trì theo chu kỳ sáng / tối 14 / {3}} giờ ở 28oC, theo phương pháp trước đó (Li YQ và cộng sự, 2020). Tất cả các thí nghiệm với ngựa vằn đều được thực hiện dưới sự giám sát của Ủy ban Đạo đức Động vật của Đại học Dược Trung Quốc.

Ấu trùng ngựa vằn được chia thành sáu nhóm và được xử lý từ 3 ngày sau khi thụ tinh (dpf) đến 7 dpf: nhóm đối chứng, nhóm mô hình, mô hình cộng với donepezil hydrochloride (DPZ, Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.) nhóm, và mô hình cộng với ACT (độ tinh khiết HPLC 98%, Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd.) nhóm. Nhóm đối chứng được duy trì trong môi trường với 0. 2% DMSO và nhóm mô hình được xử lý với 150 uM AlCl3 (pH 5,8). Mô hình cộng với nhóm DPZ được đồng xử lý với AlCl3 và 8 uM DPZ. Mô hình cộng với các nhóm ACT được đồng xử lý với AlCl3 và nồng độ khác nhau của ACT (200, 100 và 50 u M).

Phân tích hành vi

Các chuyển động của ấu trùng ngựa vằn đã được máy phân tích hành vi ViewPoint (Zebralab, 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) ghi lại ở 28oC. Tóm lại, các tham số hành vi và xử lý kết quả phù hợp với phương pháp chúng tôi đã thiết lập trước đó (Li YQ và cộng sự, 2020). Ở đây, tốc độ trung bình (AS), tốc độ thay đổi (AS), tốc độ phục hồi rối loạn vận động (DRR) và tốc độ phản ứng (RE, phần trăm) được chọn để đánh giá khả năng phục hồi rối loạn vận động ở ngựa vằn.

Xác định hoạt tính Acetylcholinesterase và Choline Acetyltransferase

Sau khi xử lý từ 3 đến 7 dpf, ấu trùng ngựa vằn được thu thập để đo hoạt tính Acetylcholinesterase (AChE) và Choline Acetyltransferase (ChAT). Dựa trên quy trình của nhà sản xuất, hoạt tính được phát hiện bằng bộ dụng cụ xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzym (ELISA) (MLBIO Biotechnology Co., Ltd., Thượng Hải, Trung Quốc).

Điều trị và nuôi cấy tế bào

Dòng di động BV -2 đã được mua từ American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, United States). Chúng được nuôi cấy tại DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nam Kinh, Trung Quốc). Môi trường được bổ sung 10% FBS (Gibco, Grand Island, NY, Hoa Kỳ),

100 U / ml penicillin, và 100 mg / ml streptomycin, kèm theo 95% không khí / 5% CO2 ở 37oC. Tế bào BV -2 được ủ với ACT (50, 25 và 12,5 uM) hoặc được kích thích bằng lipopolysaccharide (LPS, 1 ug / ml; Sigma- Aldrich, St Louis, MO, Hoa Kỳ) trong 24 giờ. Các tế bào được quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược (Nikon ECLIPSE Ti2, Nhật Bản).

Thử nghiệm khả năng tồn tại của tế bào

Thử nghiệm Bộ đếm tế bào -8 (CCK -8) (Viện kỹ thuật sinh học JianCheng, Nam Kinh, Trung Quốc) được sử dụng để đánh giá khả năng sống sót của tế bào. Tóm lại, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 450 nm bằng đầu đọc vi tấm (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, United States).

Thử nghiệm sản xuất oxit nitric

Oxit nitric (NO) được xác định bằng cách đo mức nitrit trong bề mặt nuôi cấy BV -2 sử dụng thuốc thử Griess. Brie fl y, môi trường (100 ul) được chuyển sang một đĩa giếng 96- mới, cùng một thể tích thuốc thử Griess được thêm vào mỗi giếng và phản ứng trong 15 phút trong bóng tối. Sự hấp thụ ở bước sóng 540 nm được xác định bằng Microplate Reader.

Trong các mức Cytokine fl ammatory ở trên bề mặt

Nồng độ của TNF-a, IL -1 và IL -10 trong bề mặt tế bào BV -2 được xác định bằng bộ dụng cụ ELISA theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Xác định chuyển hóa tế bào bằng phân tích HPLC-Q-TOF-MS

Tế bào BV -2 đã được gieo vào đĩa sáu giếng riêng biệt (n=6 / nhóm). Sau khi xử lý, môi trường được loại bỏ, và các tế bào được rửa ba lần bằng PBS lạnh. Sau đó, chúng ngay lập tức được tiếp xúc với nitơ lỏng để ngăn chặn sự trao đổi chất của tế bào. Các tế bào được thu hoạch với 80% methanol lạnh. Để tạo điều kiện kết tủa protein, các tế bào được quay xoáy mạnh trong 1 phút và ly tâm ở tốc độ 13, 000 vòng / phút (15 phút, 4oC). Huyền phù tế bào được làm khô dưới dòng nitơ. Phần cặn khô được hoàn nguyên trong 150 ul của 25% acetonitril đã được làm lạnh trước. Để đảm bảo tính ổn định và độ chính xác của phân tích trình tự, mỗi mẫu tế bào có thể tích bằng nhau (10 ul) được kết hợp làm mẫu kiểm tra chất lượng. Trong quá trình phát hiện chất chuyển hóa, những mẫu này được tiêm sau mỗi sáu mẫu để xác định độ ổn định của chúng. Một phân số 1- ul đã được đưa vào cho HPLC-Q-TOF-MS.

Phân tích được thực hiện trên hệ thống Agilent 1290 HPLC

được kết nối với khối phổ kế thời gian bay (Q- TOF) tứ cực Agilent 653 0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, United States). Việc phân tách được thực hiện trên cột ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 min 100 mm, 1,7 um). Pha động bao gồm 0,1% axit fomic-nước (v / v; A) và axetonitril (B).

Tốc độ fl ow được đặt ở {{0}}. 4 ml / phút với điều kiện rửa giải gradient tối ưu sau: 0 đến 2 phút, 5 phần trăm B; 2 đến 20 phút, 5 đến 95 phần trăm B (chế độ ion dương); 0 đến 2 phút, 5 phần trăm B; 2 đến 20 phút, 5 đến 95 phần trăm B (chế độ ion âm). Các thông số hoạt động của khối phổ kế được thiết lập như sau: nhiệt độ khí, 320oC; khí làm khô, 10 L / phút; máy phun sương, 35 psi; VCap, 4, 000 V; máy phân mảnh, 120 V.

dữ liệu được thực hiện với MetaboAnalyst8. Kết hợp với tài liệu, các chất chuyển hóa khác nhau (VIP> 1, t-test p <0. 05)="" đã="" được="" xác="" định="" trên="" hmdb9.="" cuối="" cùng,="" phân="" tích="" lộ="" trình="" đã="" được="" thực="" hiện="" với="">

Đo lường tiềm năng của màng ty thể

Điện thế màng ty thể (MMP) được phát hiện bằng cách sử dụng đầu dò huỳnh quang JC -1 (Beyotime, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, các tế bào từ các nhóm khác nhau được rửa bằng PBS và ủ với dung dịch nhuộm JC -1 trong 20 phút ở 37oC. Sau khi nhuộm, các tế bào được rửa hai lần bằng cách sử dụng phương pháp nhuộm. Sau đó, tín hiệu huỳnh quang được phát hiện bằng phương pháp đo tế bào (BD Accuri C6).

Đo lường Adenosine 5f-Triphosphate của Ty thể

Nồng độ Adenosine 5 / -triphosphate (ATP) trong ti thể được phát hiện bằng Bộ xét nghiệm ATP (Beyotime, Trung Quốc). Brie y, môi trường nuôi cấy tế bào BV -2 từ các nhóm khác nhau đã bị loại bỏ, và các tế bào được đồng nhất bằng cách ly giải trên băng. Phần nổi phía trên thu được sau khi ly tâm (12, 000 g,

5 phút) được sử dụng để xác định nồng độ ATP. Sự phát quang được phát hiện bởi EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).

Quản lý của(Bệnh Alzheimer)

Đo lường mức độ các loài oxy phản ứng nội bào

Bộ xét nghiệm oxy phản ứng (ROS) (Beyotime, Trung Quốc) được sử dụng để đo mức ROS. Các tế bào từ các nhóm khác nhau được ủ với DCFH-DA (10 uM) trong 20 phút ở 37oC. Sau khi nạp đầu dò, các tế bào được rửa ba lần bằng DMEM. Sau đó, tín hiệu huỳnh quang được phát hiện bằng phương pháp đo tế bào (BD Accuri C6).

Kính hiển vi điện tử

Tế bào BV -2 đã được gieo vào một đĩa sáu giếng. Môi trường đã được loại bỏ và 1 ml 2,5% glutaraldehyde nhanh chóng được thêm vào mỗi giếng. Sau đó, các tế bào được thu thập và xử lý với 2,5% glutaraldehyde mới ở 4oC qua đêm. Sau khi xation, khử nước và nhúng, các tế bào được quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua HT7800 (Hitachi, Tokyo, Nhật Bản).

Phân tích dữ liệu thông tin sinh học và RNA-Seq

RNA tổng số từ tế bào BV {{{{1 0}}}} được chiết xuất bằng thuốc thử Trizol (Vazyme Biotech, Trung Quốc). Tất cả các mẫu phân tích được gửi đến Majorbio (Công ty TNHH Công nghệ sinh học Majorbio Thượng Hải) để làm xét nghiệm trình tự RNA. Dữ liệu được phân tích trên nền tảng trực tuyến của Majorbio Cloud Platform1 0. RSEM11 được sử dụng để định lượng độ phong phú của gen. Về cơ bản, biểu thức rõ ràng Dữ liệu thô được vận hành theo Phần mềm Máy trạm MassHunter phiên bản B. 0 7. 00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, United States). Dữ liệu thô đã được xử lý trước bởi nền tảng XCMS. Phân tích thành phần chính (PCA) và phân tích phân biệt bình phương nhỏ nhất từng phần (PLS-DA) của phân tích chuẩn hóa được thực hiện bằng cách sử dụng DESeq2 / DEGseq / EdgeR với giá trị Q 0,05; DEG với|log2FC|> 1 và giá trị Q 0,05 (DESeq2 hoặc EdgeR) / giá trị Q 0,001 (DEGseq) được coi là các gen biểu hiện rõ rệt. Ngoài ra, phân tích làm giàu chức năng bao gồm GO và KEGG đã được thực hiện để xác định DEG nào được làm giàu đáng kể theo các thuật ngữ và con đường GO ở giá trị p 0,05 được Bonferroni hiệu chỉnh so với nền toàn bộ bảng sao. Dữ liệu trình tự gốc đã được gửi vào cơ sở dữ liệu của Kho lưu trữ đọc trình tự NCBI.

Định lượng phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực

RNA tổng số của tế bào BV -2 được thu hoạch bằng cách sử dụng Thuốc thử phân lập RNA-easyTM (Vazyme Biotech, Trung Quốc) và phản ứng phiên mã ngược được thực hiện với FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, Trung Quốc). Các phản ứng được thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất. cDNA đã được thử nghiệm định lượng phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực (qRT-PCR) với mồi đặc biệt và TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Trung Quốc). Các mồi được liệt kê trong Bảng bổ sung 1 và -actin được sử dụng làm kiểm soát nội bộ. Phương pháp 2- AA CT đã được sử dụng để phân tích định lượng.

Phân tích Western Blot

Tế bào BV -2 được ly giải bởi công ty ly giải RIPA (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nam Kinh, Trung Quốc) có chứa 1 phần trăm Protease In inhibitor Cocktail (Thermo Fisher) để thu được tổng số protein. Các protein được tách 10% SDS-PAGE và được chuyển sang màng NC. Sau khi ngăn bằng sữa tách béo 5% / BSA, các màng được ủ với AMPKa (Proteintech), p-AMPKa (A ffi nity Biosciences), PGC -1 a (Proteintech), NF-kB (Proteintech), p-NF- kháng thể kB (ABclonal), hoặc GAPDH (ABclonal) trong TBST 5% ở 4oC qua đêm. Các màng được ủ với kháng thể liên hợp peroxidase từ cải ngựa thứ cấp (ABclonal) ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Chất nền thấm nước phương Tây ECL tín hiệu cao (Tanon, Trung Quốc), hệ thống hình ảnh Gel (Tanon, Trung Quốc) và phần mềm ImageJ được sử dụng để hình dung và định lượng.

Docking phân tử

Phân tích kết nối phân tử được thực hiện bằng phần mềm Autodock (Phiên bản 4.2). Sự khác biệt giữa ACT và protein đã được quan sát bằng phần mềm AutodockTools. Các cấu trúc protein ba chiều (3D) của AMPKa (PDB ID: 5g5j) và NF-kB (PDB ID: 4q3j) được truy xuất từ ​​Ngân hàng dữ liệu protein12.

Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu được biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn trung bình và được phân tích bởi Phần mềm GraphPad Prism (Phiên bản 8. 0. 1). Sự khác biệt giữa các nhóm được phân tích bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA), sau đó là kiểm tra so sánh nhiều lần của Tukey. p <0. 05="" được="" coi="" là="" không="" có="" ý="" nghĩa="" thống="">

Cistanche bổ sung cho bệnh Alzheimer

KẾT QUẢ

Dự đoán lộ trình và mạng tương tác mục tiêu ACT-AD

Thông qua việc hợp nhất nhiều cơ sở dữ liệu, 253 mục tiêu của ACT đã được thu thập, trong khi tổng số 1.697 mục tiêu liên quan đến AD đã được thu thập. Sau khi lập bản đồ mạng mục tiêu, tổng cộng 70 mục tiêu đã được đưa vào mạng tương tác mục tiêu ACT-AD (Hình 1A). Phân tích làm giàu KEGG ngụ ý rằng ACT có thể có phổ rộng và nhiều mục tiêu (Hình 1B). Nó cũng gợi ý rằng ACT có nhiều con đường, điểm mục tiêu và các yếu tố trong AD(Bệnh Alzheimer)sự đối đãi. Phân loại các con đường này để có được sự giải thích chính xác về các cơ chế. ACT chủ yếu có thể tương quan với sự dẫn truyền tín hiệu, hệ thống nội tiết, hệ thống miễn dịch và sự phát triển và chết của tế bào để đóng một vai trò đối đầu chống lại AD(Bệnh Alzheimer)(Hình 1C). Điều đáng chú ý là phần lớn các con đường này có liên quan đến phản ứng ammation. Người ta suy đoán rằng hành động chống bắt buộc của ACT có thể là một phần không thể tách rời trong vai trò đối đầu của nó chống lại AD(Bệnh Alzheimer).

ACT Giảm rối loạn vận động và Cải thiện Chức năng Hệ Cholinergic ở AD(Bệnh Alzheimer)Ấu trùng Zebra fi sh

Để xác minh mô hình mạng, AlCl 3- đã tạo ra AD(Bệnh Alzheimer)mô hình ở ấu trùng ngựa vằn đã được sử dụng để chứng minh tính hiệu quả của ACT. Sự di chuyển của ấu trùng ngựa vằn trong chu kỳ sáng / tối đã được quan sát, và các đường bơi của chúng đã được ghi lại (Hình 1D). Kết quả cho thấy ACT làm tăng AS và AS của ngựa vằn một cách sinh động, và tác dụng hiệp đồng tăng khi tăng liều (Hình 1E). DRR và RE đã khám phá ra sự so sánh trực quan hơn giữa ACT và DPZ (Hình 1F). Theo đó, ACT làm giảm bớt chứng rối loạn vận động, thể hiện các hành vi tương tự như DPZ.

Người ta thường đồng ý rằng hệ thống cholinergic đóng một vai trò quan trọng trong quá trình học tập và ghi nhớ. Do đó, các hoạt động của AChE và ChAT được sử dụng để tiết lộ tính chất của ACT. Sự tiếp xúc với AlCl3 ở ngựa vằn đã làm thay đổi hệ cholinergic của não (Hình 1G). Điều đáng chú ý là không thể điều trị ACT ngăn chặn hoạt động của AChE. Ngoài ra, hoạt động của ChAT giảm sau khi điều trị ACT. Do đó, ACT đã cho thấy một tác động sâu sắc trong AlCl 3- AD gây ra(Bệnh Alzheimer)ấu trùng ngựa vằn.

Phân cực M1 bị ức chế ACT và phân cực M2 được thúc đẩy trong tế bào BV -2 do LPS gây ra

Để tiếp tục kết nối mạng, hoạt động chống lại sự biến đổi của ACT đã được nghiên cứu trong ống nghiệm bằng cách sử dụng tế bào vi mô BV -2. Sau khi điều trị LPS trong 24 giờ, khả năng tồn tại của các tế bào BV -2 giảm đáng kể. May mắn thay, ACT đã làm tăng khả năng tồn tại tế bào của các tế bào BV -2 do LPS gây ra (Hình 2A). Ngoài ra, hình thái của tế bào BV -2 đã được quan sát. Sau 24 giờ kích thích LPS, nó cho thấy rằng các tế bào BV -2 trải qua trạng thái phân cực M1. Các thay đổi hình thái đã được ngăn chặn bằng cách đồng điều trị với ACT (Hình 2B).

Hơn nữa, kết quả chỉ ra rằng, không giống như các tế bào BV -2 được kích thích bởi LPS, các tế bào BV {1}} được đồng xử lý với ACT hầu như không bị ức chế TNF-a, IL -1 và NO (Hình 2C) biểu thức trong phần nổi của tế bào. Đây là các cytokine hỗ trợ cổ điển như là chất chỉ thị cho sự phân cực của microglia M1. Tương tự như kết quả của ELISA, kết quả của qPCR đã phát hiện ra rằng TNF-a, nitric oxide synthase (iNOS),

Biểu hiện mRNA IL -1 và CD {1}} hầu như không bị ức chế bởi điều trị ACT so với nhóm LPS (Hình 2D).

Hơn nữa, chúng tôi đo mức độ phân cực microglia M2 bằng ELISA (Hình 2C) và qPCR (Hình 2E), và kết quả chỉ ra rằng ACT không thể tăng đáng kể mức độ biểu hiện dấu hiệu liên quan đến microglia M2 (IL -10, CD206, TGF-, và Arg -1). Tóm lại, những kết quả này cho thấy ACT ức chế sự phân cực của microglia M1 và thúc đẩy kiểu hình M2.

ACT được điều chỉnh phân cực M1 / ​​M2 thông qua sự ức chế của con đường NF-kB

Phân tích phiên mã được thực hiện bởi RNA-seq để khám phá cơ chế hoạt động của ACT trong tế bào BV -2 ở mức độ tổng thể. PCA đã minh họa rằng các nhóm đối chứng, LPS và ACT có thể được phân biệt rõ ràng (Hình 3A). Nó cho thấy 899 di truyền biểu hiện rõ ràng (DEG) giữa nhóm đối chứng và nhóm LPS, và 49 DEG giữa nhóm LPS và ACT

nhóm (Hình 3B). Nhất quán, phân tích làm giàu GO (Hình 3C) và KEGG (Hình 3D) đã phát hiện ra rằng phần lớn của ACT có liên quan đến con đường NF-kB. Bộ gen liên quan đến con đường NF-kB đã được xác định thêm, và cân bằng nội môi của chúng chắc chắn là do LPS tạo ra. Đúng như dự đoán, ACT không thể thực hiện được các biểu thức của chúng (Hình 3E).

Con đường NF-kB là một con đường cổ điển để điều chỉnh sự tiến triển của quá trình hình thành, cuối cùng dẫn đến việc giải phóng các yếu tố hỗ trợ. Để có được sự hỗ trợ về mặt cơ học, protein quan trọng của con đường NF-kB đã được đánh giá bởi Western blot. Kích thích LPS dẫn đến kích hoạt NF-kB, liên quan đến việc thúc đẩy phân cực M1. Phù hợp với phân tích RNA-seq, ACT ức chế sự phosphoryl hóa NF-kB do LPS kích thích (Hình 3F). Do đó, ACT có thể làm giảm sự phân cực M1 do LPS gây ra thông qua con đường NF-kB trong tế bào BV -2.

ACT Suy giảm sinh tổng hợp Arginine cũng như sinh tổng hợp Pantothenate và CoA

Dự đoán mạng lưới ACT cho thấy nó có liên quan đến chuyển hóa arginine (Arg) và proline (Hình 1B). RNA- seq đã chứng minh rằng các con đường do ACT tạo ra cũng bao gồm sinh tổng hợp Arg cũng như sinh tổng hợp pantothenate và CoA (Hình 3D). Có ý kiến ​​cho rằng rối loạn chuyển hóa của tế bào BV -2 do kích thích LPS gây ra có liên quan đến sự phân cực M1 (Orihuela và cộng sự, 2016). Vì vậy,

bộ chuyển hóa tế bào không mục tiêu bằng HPLC-Q-TOF-MS đã được sử dụng để xác định tác động của ACT đối với sự trao đổi chất của tế bào. PCA và PLS-DA (Hình 3G) đã minh họa rằng các nhóm chứng, LPS và ACT có thể được phân biệt rõ ràng dựa trên các chất chuyển hóa nội bào. Mức độ của các chất chuyển hóa khác nhau trong tế bào BV -2 do LPS gây ra đã thay đổi sau khi điều trị ACT (Hình 3H). So với nhóm chứng, có 11 chất chuyển hóa thay đổi đáng kể trong nhóm LPS (Bảng bổ sung 2), trong khi 14 chất chuyển hóa bị thay đổi rõ rệt sau khi điều trị ACT (Bảng bổ sung 3), liên quan đến 11 con đường chuyển hóa (Hình 3I). Hoạt động của ACT chủ yếu bao gồm điều hòa chuyển hóa axit amin, chuyển hóa nucleotit, chuyển hóa năng lượng và chuyển hóa các đồng yếu tố và vitamin. Điều thú vị là các con đường trao đổi chất thu được bởi cơ thể chuyển hóa phù hợp với dự đoán mạng lưới và RNA-seq, bao gồm sinh tổng hợp Arg cũng như sinh tổng hợp pantothenate và CoA. Những điều trên cho thấy ACT có thể điều chỉnh sinh tổng hợp Arg cũng như sinh tổng hợp pantothenate và CoA trong các tế bào BV - 2 được LPS kích thích.

Chiết xuất Cistanche chốngBệnh Alzheimer

Xin vui lòng nhấp vào đây để Phần 2