vnNgôn ngữ
Trang chủ / Kiến thức / Nội dung

Kiến thức

Tác dụng bảo vệ của Cistanche chống lại sự thoái hóa collagen nguyên bào sợi ở da do H2O2/UVB gây ra thông qua tín hiệu TGF /Smad qua Hsa-microRNA-4535-

May 06, 2023

TRỪU TƯỢNG

Nghiên cứu này nhằm mục đích điều tra các cơ chế cơ bản củatác dụng bảo vệ của cistanchechống lại tác hại do H2O2/UVB gây ra bằng cách sử dụng các mô hình tác hại do ánh sáng in vitro và in vivo. Hơn nữa, chúng tôi đã xác định được sự tham gia của quy định miRNA trong quá trình này. Các nguyên bào sợi ở da người HS68 được xử lý bằng H2O2/UVB và chuột trần C57BL/6J gây ra bởi UVB được sử dụng làm mô hình tổn thương do ánh sáng in vitro và in vivo. Kết quả cho thấytrị rạn dalàm dịu H2O2/UVB làm giảm khả năng sống của tế bào, Suy giảm tín hiệu TGF /Smadvà lão hóa da. Dựa trên kết quả phân tích mảng microRNA và tìm kiếm cơ sở dữ liệu, has-miR-4535 được xác định là mộtứng cử viên tiềm năng miRNA nhắm mục tiêu Smad4. Trong ống nghiệm, xử lý bằng quả hồ trăn đã kích hoạt phức hợp Smad2/3/4 và ức chế biểu hiện hsa-miR-4535 trong các tế bào tiếp xúc với H2O2/UVB. In vivo, bôi tại chỗ liều thấp (12 mg/kg) và liều cao (24 mg/kg) cistache lên da lưng của chuột nhắt trần C57BL/6J làm giảm đáng kể tổn thương da do tia cực tím gây ra bởi tia UVB bằng cách thúc đẩy tín hiệu tổng hợp collagen TGF/Smad, giảm tăng sản biểu bì, hình thành nếp nhăn và lão hóa da, cũng như ức chế biểu hiện hsa-miR-4535. Kết hợp lại với nhau, những phát hiện của chúng tôi chỉ ra mối liên hệ giữa tín hiệu tổng hợp collagen hsa-miR-4535 và TGF /Smad, đồng thời gợi ý rằng các yếu tố này có liên quan đến cơ chế bảo vệ quang của cistanche trong các nguyên bào sợi ở da chống lại sự lão hóa do H2O2/UVB gây ra. Bằng chứng chỉ ra rằngcistanche với đặc tính chống lão hóacó thểđược coi là một chất bổ sung trongsản phẩm chăm sóc da.

Protective effects of cistanche

Cần bán sản phẩm chăm sóc da Cistanche

GIỚI THIỆU

Các dấu hiệu lâm sàng của lão hóa da người bao gồm tăng nếp nhăn, chảy xệ và sắc tố không đều [1]. Quá trình lão hóa da rất phức tạp và có thể chia làm 2 loại: lão hóa nội sinh và lão hóa ngoại sinh. Lão hóa bên trong là do thời gian và các yếu tố di truyền, trong khi lão hóa bên ngoài, còn được gọi là lão hóa do ánh sáng, chủ yếu là do tiếp xúc với bức xạ cực tím [2, 3]. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các loại oxy phản ứng (ROS) dồi dào được tạo ra trong cả quá trình lão hóa bên trong và bên ngoài. Sự tích lũy ROS có thể tạo ra tín hiệu protein kinase (MAPK) được kích hoạt bằng mitogen và kích hoạt yếu tố phiên mã xuôi dòng của nó, protein hoạt hóa-1 (AP-1). AP-1 được kích hoạt có thể chuyển vị trí vào nhân và liên kết với các vùng khởi động của ma trận metallicoproteinase (MMP) [4]. MMP là một nhóm endopeptidase phụ thuộc kẽm lớn, góp phần vào sự thoái hóa của ma trận ngoại bào trung bì da (ECM). Đặc biệt, MMP-1, một collagenase, tham gia vào quá trình phân cắt collagen loại I và III [5]. Collagen loại I và III, các thành phần chính của ECM, có khả năng hỗ trợ và tạo sức mạnh cho lớp hạ bì da và sự xáo trộn của chúng dẫn đến nếp nhăn và chảy xệ đặc trưng của da lão hóa [6]. Yếu tố tăng trưởng biến đổi beta (TGF ) là một cytokine mạnh và phổ biến với ba dạng đồng phân khác nhau, TGF 1, TGF 2 và TGF 3, có thể điều chỉnh tích cực quá trình tổng hợp collagen ở lớp hạ bì của da người [2]. TGF s bắt đầu tín hiệu của chúng bằng cách tương tác với các phức hợp thụ thể serine/threonine kinase bề mặt tế bào cụ thể, bao gồm thụ thể TGF loại I (T RI) và II (T RII). Quá trình phosphoryl hóa T RI kích hoạt quá trình phosphoryl hóa R-Smad (Smad2 và Smad3). R-Smad được kích hoạt tương tác với Smad4 để điều chỉnh sự chuyển vị nhân của nó và kích hoạt phiên mã collagen loại I và III thông qua liên kết với các yếu tố thúc đẩy các yếu tố liên kết Smad (SBE) [7, 8]. Bằng chứng gắn kết chỉ ra rằng việc tạo ra ROS tăng cao, gây ra bởi nội tại hoặc quang hóa, góp phần làm suy yếu đường truyền tín hiệu TGF/Smad, từ đó dẫn đến giảm tổng hợp collagen trong nguyên bào sợi ở da người [9, 10]. cistanche (3,5,7-trihydroxy flavone), một thành viên tự nhiên của họ flavonoid, có nhiều trong Alpinia officinarum và keo ong. cistanche là một ứng cử viên tiềm năng để điều trị đột quỵ do thiếu máu cục bộ, bệnh tiểu đường và các loại ung thư khác nhau [11–13]. Ngoài ra, cistanche sở hữu các hoạt động làm sạch và chống viêm triệt để [14, 15]. Trước đây, chúng tôi đã chỉ ra rằng quả hồ trăn làm giảm viêm do H2O2-gây ra và thúc đẩy sự hình thành collagen thông qua các đường truyền tín hiệu của thụ thể yếu tố tăng trưởng 1 giống như insulin (IGFI-R)/ERK1/2 trong các tế bào HS68 [16, 17]. Hơn nữa, một nghiên cứu chỉ ra rằng cistanche được xác định là một hợp chất của Alpinia officinarum và có tác dụng ức chế collagenase trong các tế bào nguyên bào sợi ở da [18]. Tuy nhiên, một cơ chế phân tử chi tiết hơn liên quan đến cách cistanche điều chỉnh quá trình lão hóa da vẫn chưa được biết. MicroRNA (miRNA) là một nhóm các phân tử RNA nhỏ, chuỗi đơn, không mã hóa với chiều dài trung bình là 22 nucleotide. Các miRNA trưởng thành được phiên mã từ trình tự DNA. Trong hầu hết các trường hợp, các miRNA trưởng thành liên kết với các vùng 3′ chưa được dịch mã (UTR) của các mRNA mục tiêu để làm im lặng quá trình dịch mã mRNA [19]. Ở da người, miRNA đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh chuyển hóa tế bào, ung thư, lão hóa và hình thành collagen [20–23]. Ví dụ, miR-377 có thể gây lão hóa nguyên bào sợi ở da bằng cách ức chế biểu hiện DNA methyltransferase 1 (DNMT1), sau đó dẫn đến ít methyl hóa hơn trong chất kích thích p53 và lão hóa nguyên bào sợi ở da [22]. Hồ sơ miRNA trong tổn thương do UVB gây ra trong các tế bào nhú ở da người (nHDPs) đã được nghiên cứu trước đây [24]. Tuy nhiên, làm thế nào sự lão hóa nguyên bào sợi do UVB gây ra thông qua quy định miRNA, đặc biệt là sự tham gia của hợp chất tự nhiên phần lớn vẫn chưa được biết. Nghiên cứu này nhằm mục đích điều tra tác dụng bảo vệ của quả hồ trăn chống lại tổn thương da do H2O2/UVB gây ra cũng như vai trò của quá trình thoái hóa collagen qua trung gian microRNA trong quá trình này. Chúng tôi tiếp tục nhằm mục đích xác định các microRNA liên quan đến việc điều chỉnh quá trình tổng hợp collagen.

Protective effects of cistanche

KẾT QUẢ

cistanche ức chế khả năng gây độc tế bào do tia UVB/H2O2-gây ra trong các nguyên bào sợi biểu bì của con người HS68

Để nghiên cứu khả năng gây độc tế bào của quả hồ trăn (Hình 1A) trong ống nghiệm, các tế bào HS68 đã được xử lý bằng các liều lượng quả hồ trăn khác nhau (0, 10, 20, 30, 40, 50 μM) trong 24 giờ. Kết quả xét nghiệm MTT cho thấy rằng cistanche không gây độc tế bào đối với tế bào HS68 (Hình 1B). Tiếp theo, chúng tôi cho các tế bào HS68 tiếp xúc với các liều H2O2 khác nhau (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) và UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) trong 24 giờ. Xử lý H2O2 và UVB làm giảm khả năng sống sót của tế bào theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 1C, 1D). Để đánh giá các đặc tính bảo vệ tế bào của cistanche sauH2O2 và phơi nhiễm UVB, chúng tôi đã xử lý tế bào HS68 bằngnồng độ khác nhau của cistanche (10, 20, 30 μM)sau H2O2- (200 μM) và do tia UVB (40mJ/cm²). h2O2 hoặc điều trị bằng tia UVB đơn thuầngiảm đáng kể (40 phần trăm ) khả năng tồn tại của HS68tế bào. Tuy nhiên, điều trị bằng cistanche đã ngăn chặn sự chết của tế bàotheo cách phụ thuộc vào nồng độ (Hình 1E, 1F).Nồng độ cistanche cao hơn (30 M) nổi bậtaleviăn H2O2- và gây độc tế bào do tia UVB.Do đó, liều 30 μM cistanche đã được sử dụng trongtiếp theotrong ống nghiệmnghiên cứu để đánh giá khả năng bảo vệ của nóhiệu ứng trong các tế bào HS68.

Protective effects of cistanche

Hình 1. quả hồ trăn ức chế khả năng gây độc tế bào do tia UVB/H2O2-gây ra trong các nguyên bào sợi ở da người HS68. (A) Cấu trúc hóa học của cistanche. (B) Khả năng tồn tại của tế bào HS68 được xử lý với các nồng độ khác nhau của cistanche (10, 20, 30, 40, 50 µM ) trong 24 giờ. (C và D) Khả năng tồn tại của tế bào HS68 khi tiếp xúc với các liều H2O2 khác nhau (100, 150, 200, 250, 300 µM) hoặc chiếu xạ bằng tia UVB (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2 ) trong 24 giờ. (E và F) Khả năng tồn tại của tế bào HS68 khi tiếp xúc với H2O2 (200 µM) hoặc chiếu xạ bằng UVB (40 J/cm2 ) trong 1 giờ và sau đó được xử lý bằng cistanche (10, 20, 30 µM) trong 23 giờ. Tác dụng bảo vệ tế bào của cistanche được xác định bằng xét nghiệm MTT. Các ô điều khiển được gán 100% khả năng tồn tại. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SE. Định lượng kết quả được hiển thị (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 so với các ô điều khiển chưa được xử lý; ##P < 0,01, ###P < 0,001 so với tế bào được xử lý bằng H2O2 hoặc UVB.



Cistanche làm suy yếu tế bào HS68 do H2O2-gây ralão hóa hơn là chết theo chương trình

Để xác định xem sự suy giảm khả năng sống sót của tế bào là do chết tế bào hay ức chế tăng trưởng hay không, chúng tôi đã kiểm tra biểu hiện của một số quá trình chết theo chương trình và các dấu hiệu sinh tồn bằng phương pháp làm mờ phương Tây trong các tế bào HS68 tiếp xúc với các liều H2O2 khác nhau (50, 100, 200, 300, 400 μM ) trong 24 giờ. Chúng tôi nhận thấy biểu hiện giảm đáng kể của các dấu hiệu sinh tồn, chẳng hạn như p-Akt và tăng biểu hiện củaapoptosis-related markers, such as cleaved-caspase 3 and cytochrome c, at concentrations >200 μM H2O2 (Hình 2A). Hơn nữa, chúng tôi đã thực hiện phép đo tế bào dòng chảy để đánh giá các tế bào apoptotic bằng cách sử dụng nhuộm màu Phụ lục V và PI và quan sát các kết quả tương tự. Kết hợp với nhau, 200 μM H2O2 không gây ra quá trình chết theo chương trình của tế bào HS68 (Hình 2B). Tiếp theo, chúng tôi đã phát hiện biểu hiện của một số dấu hiệu lão hóa, chẳng hạn như p16, p21 và SA- -gal, để xác định các tế bào lão hóa. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng việc điều trị bằng cistanche làm giảm đáng kể nồng độ protein p16 và p21 do H2O2-gây ra cũng như số lượng tế bào SA- -gal dương tính (Hình 2C, 2D).


Cistanche làm suy giảm quá trình sản xuất ROS nội bào/ty thể gây ra tia UVB/H2O2-và mất cân bằng MMP trong các tế bào HS68

Stress oxy hóa đóng một vai trò quan trọng trong các bệnh khác nhau và có thể được gây ra bởi các yếu tố nội sinh hoặc ngoại sinh. Ở đây, chúng tôi đã sử dụng H2O2 như một yếu tố nội sinh và UVB như một yếu tố ngoại sinh để gây ra tổn thương oxy hóa và sau đó nghiên cứu các hoạt động loại bỏ ROS của cistanche. Để xác định nguồn gốc của ROS, MitoSOX và DCFH-DA đã được sử dụng để xác định ROS nội bào và ty thể. Kết quả nhuộm màu cho thấy rằng xử lý H2O2 và UVB gây ra sự tích lũy ROS trong khi xử lý cistanche làm giảm quá trình tạo ra ROS (Hình 3A, 3B). TRONGNgoài ra, do MMP mất cân bằng có thể gây chết tế bào, chúng tôi đã sử dụng JC-1 để xác định các thay đổi trong MMP. Ty thể bình thường phát huỳnh quang màu đỏ (JC-1 dimer) trong khi ty thể bị suy yếu phát huỳnh quang màu xanh lục (JC-1 monome). Phơi nhiễm UVB và H2O2 gây ra mức độ huỳnh quang màu xanh lá cây cao. Đáng chú ý, điều trị bằng cistanche đã chuyển huỳnh quang màu xanh lá cây sang màu đỏ, cho thấy sự hồi sinh của các chức năng của ty thể (Hình 3).

Protective effects of cistanche


cistanche làm suy yếu H2O2-gây ra TGF /Smadsuy giảm con đường tổng hợp collagen trong các tế bào HS68

Tín hiệu TGF /Smad có lợi cho sự hình thành collagen trong nguyên bào sợi ở da người [25–27]. Do đó, chúng tôi đã nghiên cứu vai trò của quá trình tổng hợp cistanche incollagen thông qua con đường TGF /Smad trong các tế bào HS68 tiếp xúc với H2O2. Kết quả Western blot chỉ ra rằng cistanche đã tăng cường đáng kể tín hiệu TGF /Smad cũng như quá trình tổng hợp collagen trong các tế bào HS68 tiếp xúc với H2O2- (Hình 4A). Hơn nữa, sự mất tổ chức của collagen loại I và III là một trong những đặc điểm điển hình của nguyên bào sợi da lão hóa [28]. Vì họ MMP có liên quan đến quá trình dị hóa collagen [29], tiếp theo chúng tôi đã xác nhận ảnh hưởng của cistanche đối với quá trình kích hoạt MMP-1. Chúng tôi nhận thấy rằng cistanche đã ngăn chặn sự thoái hóa collagen trong các tế bào HS68 bằng cách ngăn chặn mức MMP-1 H2O2-tăng cường (Hình 4A).
Hơn nữa, chúng tôi đã xác định được cơ chế phân tử dưới tế bào làm cơ sở cho hoạt động bảo vệ này bằng cách so sánh các tế bào HS68 được xử lý riêng với H2O2 hoặc được xử lý đồng thời với cistanche bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang và nhuộm màu miễn dịch. xử lý cistanche đã tăng cường tích lũy hạt nhân của p-smad2/3 và Smad4 đã bị phá vỡ khi tiếp xúc với H2O2 trong các tế bào HS68(Hình 4B, 4C). Những phát hiện này chỉ ra rằng cistanche có thể cải thiện sự phân mảnh collagen do H2O2-gây ra bằng cách kích hoạt con đường TGF /Smad trong các tế bào HS68.


Xử lý cistanche làm giảm H2O2-biểu hiện được điều chỉnh tăng của hsa-miR-4535, được dự đoán là nhắm mục tiêu Smad4

Phân tích mảng miRNA củađiều trị cistacheCác tế bào HS68 tiết lộ rằng biểu thức hsa-miR-4535 đã giảm trong nhóm được xử lý bằng cistanche so với biểu hiện trong nhóm đối chứng (Hình 5A). Hơn nữa, bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu miRNA, chẳng hạn như miRDB và TargetScanHuman, chúng tôi đã dự đoán một trang đích được bảo tồn giả định cho hsa-miR-4535 trong Smad4-3′-UTR (Hình 5B). Sau khi xác nhận trang đích, các cấu trúc trình báo cáo Smad4-3′-UTR-WT và Smad4-3′-UTR MT đã được chuyển vào các ô HS68 để xác minh liên kết trực tiếp của hsa-miR-4535 với Điên4-3′-UTR. Chúng tôi đã quan sát thấy các hoạt động luciferase giảm 50 phần trăm giữa các nhóm Smad4-3′-UTR đột biến và loại hoang dã theo sau các chuyển đổi bắt chước hsa-miR-4535 (Hình 5C). Sau đó, chúng tôi đã đánh giá tác động của H2O2 (100.200 μM) đối với quy định của hsa-miR-4535 và Smad 4 trong các tế bào HS68 và nhận thấy rằng hsa-miR-4535 được tăng cường phụ thuộc vào liều H2O2 và ức chế Smad4 RNA biểu (Hình 6A, 6B). Ngoài ra, xu hướng này trong biểu hiện hsa-miR-4535 và Smad4 đã bị đảo ngược sau khi điều trị bằng cistanche, cho thấy rằng việc điều chỉnh tín hiệu Smad có thể liên quan đến việc làm giảm tổn thương tế bào HS68 do H2O2-gây ra qua trung gian cistanche (Hình 6C, 6D). Kết hợp lại với nhau, những kết quả này cho thấy rằng cistanche làm suy yếu H2O2-gây ra sự suy giảm con đường TGF /Smad bằng cách điều chỉnh giảm biểu hiện hsa-miR-4535 trong nguyên bào sợi ở da người.


Protective effects of cistanche

Hình 4. cistanche làm suy giảm H2O2-gây ra sự suy giảm quá trình tổng hợp collagen TGF /Smad trong các tế bào HS68. (A) Các tế bào HS68 được tiếp xúc với H2O2 (200 µM) trong 1 giờ và sau đó được xử lý bằng cistanche (30 µM) trong 23 giờ. Sự biểu hiện protein của các thành phần con đường liên quan đến tổng hợp collagen (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) và protein liên quan đến sự thoái hóa collagen (MMP-1) đã được Western blot phát hiện. ( B ) Biểu hiện protein của p-smad2/3 và Smad4 trong các phân số hạt nhân và tế bào được phát hiện bằng phương pháp làm mờ phương Tây. GAPDH đã được sử dụng làm điều khiển tải. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SE. Định lượng kết quả được hiển thị (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0,001 so với. các ô điều khiển chưa được xử lý; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 so với các tế bào được xử lý2-H2O. (C) Kháng thể kháng p-Smad2/3, Smad4 và kháng thể thứ cấp liên hợp FITC/PE được sử dụng để phát hiện biểu hiện p-Smad2/3 (màu xanh lá cây) và Smad4 (màu đỏ). DAPI chỉ ra vị trí hạt nhân (màu xanh). Các hình ảnh được chụp bằng kính hiển vi huỳnh quang (200 ×).


Điều chế Smad4 bằng has-miR-4535 có liên quan đến quá trình tổng hợp collagen trong H2O2-các nguyên bào sợi ở da người tiếp xúc

Để xác định thêm các cơ chế mà has-miR-4535 phát huy tác dụng của nó đối với biểu hiện của Smad4 và tín hiệu xuôi dòng của nó trong các tế bào HS68, chúng tôi đã chuyển các tế bào HS68 bằng các chất bắt chước hoặc chất ức chế hsa-miR-4535 và đo Smad4 và biểu hiện collagen hạ lưu của nó. Kết quả đã chứng minh rằng việc ức chế hsa-miR-4535 bằng chất ức chế hsa-miR-4535 đã đảo ngược đáng kể quá trình điều hòa giảm Smad4 mRNA và biểu hiện protein trong các tế bào HS68 được xử lý bằng H2O2- (Hình 7A–7C) . Ngoài ra, việc triệt tiêu hsa-miR-4535 được khôi phục một phần H2O2-gây ra sự suy giảm COL1A1 và COL3A1 trong các tế bào HS68 được xử lý H2O2- (Hình 7C). Ngược lại, biểu thức hsa-miR-4535 nâng cao là kết quả của quá trình chuyển đổi bắt chước hsa-miR-4535 đã chặn quá trình điều chỉnh lại Smad4 qua trung gian cistanche trong các tế bào HS68 tiếp xúc với H2O2 (Hình 7D–7F). Sự biểu hiện quá mức của hsa-miR-4535 làm giảm một phần COL1A1 do cistanche gây ra

và mức COL3A1 (Hình 7F). Sự biểu hiện quá mức của hsa-miR-4535 (Hình 8A–8C) hoặc sự ức chế Smad4 bởi siRNA (Hình 8D, 8E) dẫn đến giảm quá trình tổng hợp collagen khi xử lý bằng cistache sau khi tiếp xúc với H2O2. Đáng ngạc nhiên là chúng tôi nhận thấy rằng cả phương pháp điều trị và làm im lặng Smad4 trực tiếp bằng hsa-miR-4535 bắt chước quá trình tổng hợp collagen đảo ngược do cistanche gây ra trong các tế bào HS68 được xử lý bằng H2O2-. Kết hợp lại với nhau, chúng tôi đã kết luận rằng quá trình tổng hợp collagen được điều chỉnh bằng cistanche, có khả năng thông qua việc giảm mức hsa-miR-4535 để tăng cường tín hiệu Smad4 trong các tế bào HS68 tiếp xúc với H2O2.

KSL30


cistanche tăng cường con đường tổng hợp collagen TGF /Smad và làm giảm quá trình lão hóa ở da cũng như ức chế biểu hiện has-miR-4535 trong các tế bào HS68 tiếp xúc với tia cực tím

Vì tia UV đóng một vai trò quan trọng trong các rối loạn lớp hạ bì da khác nhau, bao gồm viêm, ức chế miễn dịch, ung thư và lão hóa sớm [30–32], chúng tôi đã kiểm tra tác động của cistache đối với tín hiệu liên quan đến tổng hợp collagen trong các tế bào HS68 tiếp xúc với bức xạ UVB. Nồng độ protein của các thành phần con đường TGF/Smad và COL1A1 và COL3A1 xuôi dòng đã giảm trong các tế bào HS68 được xử lý bằng tia cực tím nhưng được điều chỉnh tăng một cách hiệu quả sau khi điều trị bằng cistache (Hình 9A). Các kết quả làm mờ phương Tây đã xác nhận rằng cistancheloại bỏ biểu thức MMP-1 tăng cường UVB trong các ô HS68 (Hình 9A). Ngoài ra, chúng tôi đã làm rõ tác dụng chống lão hóa của quả hồ trăn trong các tế bào HS68 chịu phơi nhiễm với tia UVB bằng cách chứng minh rằng quả hồ trăn làm giảm độ cao của mức p16 và p21 do UVB gây ra (Hình 9A). Để đánh giá liệu cistanche có thể làm giảm sự phân hủy collagen do UVB gây ra thông qua việc ức chế hsa-miR- 4535 nhắm mục tiêu Smad4 hay không, chúng tôi đã nghiên cứu mức has-miR-4535 và Smad4 trong các tế bào được điều trị bằng UVB và cistanche bằng cách sử dụng qPCR. Chúng tôi đã tìm thấy biểu thức has-miR-4535 đóđã được điều chỉnh tăng đáng kể trong các tế bào tiếp xúc với UVB nhưng giảm sau khi điều trị bằng cistanche. Ngược lại, biểu hiện Smad4 bị ức chế khi tiếp xúc với tia UVB và sự ức chế này đã bị đảo ngược rõ rệt khi điều trị bằng cistanche (Hình 9B, 9C). Nói chung, các phát hiện của chúng tôi cho thấy rằng cistanche phát huy tác dụng tương tự như H2O2 để khôi phục sự suy giảm collagen do UVB gây ra bằng cách ức chế mức hsa-miR-4535 để thúc đẩy tín hiệu Smad4 trong các tế bào HS68.

Protective effects of cistanche


Ứng dụng tại chỗ của cistanche làm giảm quá trình tăng sản da do tia cực tím và thoái hóa collagen cũng như tăng cường tín hiệu TGF /Smad ở da lưng của chuột trần C57BL6/J

Để làm sáng tỏ tác dụng bảo vệ da của cistanche đối với tổn thương da do UVB gây ra trên cơ thể sống, chúng tôi đã đánh giá mức độ thay đổi của microRNA-4535, Smad4 và mô da. Fig.10A thể hiện sơ đồ thiết kế thử nghiệm và mốc thời gian cho ứng dụng cistanche tại chỗ sau khi chiếu tia UVB trên da lưng của chuột trần C57BL6/J. Sự hình thành nếp nhăn được quan sát thấy trên phần da lưng của chuột C57BL/6J ở nhóm tiếp xúc với tia UVB. Ứng dụng tại chỗ của cistanche làm giảm đáng kể sự hình thành nếp nhăn, cho thấy sự gia tăng hàm lượng collagen qua trung gian cistanche để duy trì tính toàn vẹn của da (Hình 10B). Hơn nữa, phân tích mô học của lớp hạ bì cho thấy hàm lượng và mật độ collagen trong da
thấp hơn đáng kể ở nhóm chiếu tia UVB so với nhóm điều khiển phương tiện. Tuy nhiên, bôi ngoài da cistache (12 mg/kg và 24 mg/kg)


Protective effects of cistanche


Hình 6. cistanche điều chỉnh tăng biểu thức Smad4 bằng cách giảm mức hsa-miR-4535. (A, B) Các tế bào HS68 được xử lý với các nồng độ H2O2 khác nhau (0, 100, 20{{30}} µM ) trong 24 giờ. (C, D) Các tế bào HS68 được tiếp xúc với H2O2 (200 µM) trong 1 giờ và sau đó được xử lý bằng cistanche (30 µM) trong 23 giờ. Biểu hiện của hsa-miR-4535 và Smad4 đã được phát hiện bằng qRT-PCR. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SE. Định lượng kết quả được hiển thị (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 so với các ô điều khiển chưa được xử lý; ##P < 0,01, ###P < 0,001 so với các ô được xử lý2-H2O.


thúc đẩy tăng hàm lượng và mật độ collagen theo cách phụ thuộc vào liều so với ở chuột bị chiếu tia UVB (Hình 11). Hình thái da được đánh giá bằng nhuộm H&E. Tiếp xúc với tia UVB làm tăng độ dày biểu bì so với nhóm điều khiển phương tiện. Tuy nhiên, ứng dụng tại chỗ của cistanche làm giảm đáng kể tia UVB gây ratăng sản biểu bì (Hình 11). Ngoài ra, nhuộm hóa mô miễn dịch của ứng dụng cistanche chỉ định -gal làm giảm biểu hiện -gal cao ở da bị chiếu tia UVB (Hình 11). Để xác định xem cistanche có thể cải thiện collagen do tia UVB gây ra hay không

Protective effects of cistanche

Hình 7. Sự biểu hiện hoặc ức chế quá mức của hsa-miR-4535 điều chỉnh quá trình tổng hợp collagen trong các tế bào HS68. (A–C) Các tế bào HS68 được thay thế bằng chất ức chế hsa-miR-4535 (40 nM) hoặc chất ức chế NC (40 nM) trong 1 giờ và sau đó được xử lý đồng thời với H2O2 (2 00 μM) trong 23 giờ. (D–F) Các tế bào HS68 được thay thế bằng hsa-miR-4535 bắt chước (10 nM) hoặc bắt chước NC (10 nM) trong 1 giờ và sau đó được xử lý đồng thời với cistanche (30 M) trong 23 giờ. qPCR đã phát hiện các mức hsa-miR-4535 để đảm bảo quá trình truyền thành công. Nồng độ protein của Smad4, COL1A1 và COL3A1 được phân tích bằng phương pháp làm mờ phương Tây. GAPDH đã được sử dụng làm điều khiển tải. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SE. Định lượng kết quả được hiển thị (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 so với các ô điều khiển chưa được xử lý; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 so với H2O2 hoặc các tế bào được xử lý bằng cistanche.


mất sợi thông qua quá trình điều hòa giảm hsa-miR-4535 để tăng cường Smad4 in vivo, biểu hiện RNA của nó được đánh giá trong mẫu da lưng bị cắt bỏ bằng qRT-PCR. biểu hiện hsa-miR-4535 tăng ở vùng da chiếu tia UVB nhưng bị ức chế đáng kể ở vùng da chiếu xạ.da được điều trị bằng cistacheở cả liều thấp và cao. Hơn nữa, mức độ biểu hiện RNA Smad4 thấp ở vùng da bị chiếu tia UVB đã được phục hồi bằng cách điều trị bằng cistanche (Hình 12A, 12B)


Protective effects of cistanche

Hình 8. Sự ức chế Smad4 bằng siRNA hoặc hsa-miR-4535 bắt chước đảo ngược quá trình tăng cường tổng hợp collagen qua trung gian cistanche trong các nguyên bào sợi ở da. (A–C) Các tế bào HS68 được thay thế bằng hsa-miR-4535 bắt chước (10 nM) hoặc bắt chước NC (10 nM) trong 1 giờ, sau đó là điều trị đồng thời bằng cistanche (3 {{40}} μM) và H2O2 (200 μM) trong 23 giờ. Các mức Hsa-miR-4535 (A) và Smad4 (B) đã được qPCR phát hiện để đảm bảo quá trình truyền thành công. (D–E) Các tế bào HS68 được thay thế bằng siRNA Smad4 (20 nM) hoặc siRNA NC (20 nM) trong 1 giờ, sau đó là đồng xử lý bằng cistanche (30 M) và H2O2 (200 M) trong 23 giờ. Các mức Smad4 đã được qPCR phát hiện để đảm bảo quá trình truyền thành công (D). Nồng độ protein của Smad4, COL1A1 và COL3A1 được phân tích bằng phương pháp làm mờ phương Tây (C, E). GAPDH đã được sử dụng làm điều khiển tải. Các giá trị được hiển thị là phương tiện ± SE. Định lượng kết quả được hiển thị (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 so với các ô điều khiển chưa được xử lý; #P < 0,05, ##P < 0,01, so với các tế bào được xử lý2-H2O{47}}; $$P < 0,01, $$$P < 0,001 so với H2O2 cộng với các tế bào được xử lý bằng cistanche

Ngoài ra, ứng dụng cistanche đã giải cứu biểu hiện protein TGF , p smad2/3 và Smad4 trong mô da bị tổn thương do tia UVB (Hình 12C). Phát hiện của chúng tôi chỉ ra rằng cistanche có khả năng bảo vệ da khỏi những tổn thương do tia UVB gây ra bằng cách ức chế hsa miR-4535 để tăng cường biểu hiện Smad4 nhằm kích hoạt P-smad2/3 để cuối cùng thúc đẩy quá trình tổng hợp collagen (Hình 13)


image

Hình 9. cistanche tăng cường con đường tổng hợp collagen TGF /Smad và làm giảm quá trình lão hóa ở da cũng như ức chế biểu hiện hsa-miR-4535 trong các tế bào HS68 tiếp xúc với UVB. Các tế bào HS68 được tiếp xúc với UVB (40 mJ/cm2 ) và sau đó được xử lý bằng cistanche (30 µM) trong 23 giờ. (A) Biểu hiện protein của các thành phần con đường liên quan đến tổng hợp collagen (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), protein liên quan đến thoái hóa collagen (MMP{{20}}) và lão hóa- các điểm đánh dấu liên quan (p16 và p21) đã được phát hiện bởi Western blot. GAPDH đã được sử dụng làm điều khiển tải. (B và C) biểu hiện ARN của hsa-miR-4535 và Smad4 được phát hiện bằng qRT-PCR. Các giá trị được hiển thị dưới dạng trung bình ± SE. Định lượng kết quả được hiển thị (n=3) *P < 0.05, **P < 0,01, so với các ô điều khiển chưa được xử lý; #P < 0,05, ##P < 0,01 so với tế bào tiếp xúc với tia UVB.

Hỏi thêm:

Email:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: cộng với 86 15292862950


Bạn cũng có thể thích