Rối loạn điều hòa RNA yếu tố có thể thay thế trong các nhân vật siêu anh hùng ung thư phổi 3D KRAS (G12C) đột biến
Oct 27, 2023
TRỪU TƯỢNG
KRAS đột biến điều chỉnh sự biểu hiện RNA của yếu tố chuyển vị (TE) và gen được kích thích bằng interferon (ISG), nhưng vẫn chưa rõ liệu các đột biến khác nhau trong KRAS có ảnh hưởng đến các RNA TE khác nhau trong toàn bộ bộ gen hay không. Chúng tôi đã phân tích bản phiên mã của các nhân vật anh hùng ung thư phổi 3D ở người chứa đột biến KRAS (G12C) để xác định bối cảnh của các RNA TE được điều chỉnh bởi KRAS (G12C đột biến). Chúng tôi thấy rằng tín hiệu KRAS (G12C) là cần thiết để biểu hiện các RNA TE có nguồn gốc LINE và LTR khác với các RNA TE trước đây được chứng minh là được điều chỉnh bởi KRAS (G12D) hoặc KRAS (G12V đột biến). Hơn nữa, sự ức chế KRAS (G12C) đặc biệt điều chỉnh tăng các RNA TE có nguồn gốc SINE từ phân họ Alu trẻ nhất AluY. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng sự rối loạn điều hòa TE RNA trong các tế bào ung thư phổi do KRAS điều khiển phụ thuộc vào đột biến, đồng thời nêu bật một tập hợp con TE RNA trẻ có nguồn gốc từ Alu được kích hoạt phối hợp với các gen miễn dịch bẩm sinh khi ức chế KRAS (G12C).
Lợi ích của cistanche tubulosa-Chống ung thư
GIỚI THIỆU
Các RNA của yếu tố có thể thay thế (TE) thường bị rối loạn điều hòa trong bối cảnh ung thư 1. Trong các tế bào ung thư phổi KRAS đột biến, các gen ngón tay kẽm KRAB (KZNF) bị điều hòa quá mức, dẫn đến sự điều hòa tăng lên bất thường của các RNA TE có nguồn gốc từ LINE, SINE và Phần tử LTR 2,3. Ngoài TE RNA, các RNA không mã hóa dài (lncRNA) cũng được điều hòa phối hợp với các gen báo hiệu RAS 4 và kiểu biểu hiện của chúng cũng bị thay đổi tương tự ở nhiều bệnh ung thư 5-8. Đối với TE RNA, sự điều hòa của chúng trong bệnh ung thư gây ra trạng thái bắt chước virus, dẫn đến sự kích hoạt nội tại của các gen miễn dịch bẩm sinh như các gen được kích thích bằng interferon (ISG) 3,9,10. Đặc biệt, họ SINE của Alu là nguồn cung cấp TE RNA miễn dịch chiếm ưu thế 11, được gây ra bởi những thay đổi biểu sinh gây ra bởi các chất ức chế DNA methyltransferase (DNMTi) hoặc ức chế KZNF qua trung gian KRAS đột biến 3,9,10.
Để tìm hiểu xem một đột biến phổ biến ở KRAS ảnh hưởng như thế nào đến bối cảnh TE RNA trong các tế bào ung thư phổi, chúng tôi đã mô tả bản phiên mã của các nhân vật anh hùng ung thư phổi 3D chứa đột biến KRAS (G12C) khi có hoặc không có chất ức chế KRAS (G12C) đột biến 12. Chúng tôi trình bày rằng tín hiệu KRAS(G12C) là cần thiết để biểu hiện các RNA TE có nguồn gốc từ LINE và LTR, trong khi sự ức chế KRAS (G12C) điều chỉnh đặc biệt cả RNA TE có nguồn gốc từ SINE và một tập hợp con các gen liên quan đến interferon (IFN). Phát hiện của chúng tôi cho thấy sự tương tác phức tạp giữa tín hiệu KRAS đột biến và rối loạn điều hòa TE trong tế bào ung thư phổi, trong đó một tập hợp các yếu tố AluY trẻ xác định được điều hòa theo cách phụ thuộc vào đột biến.
Lợi ích của cistanche tubulosa-Chống ung thư
KẾT QUẢ
Sự ức chế KRAS (G12C) làm thay đổi bản phiên mã mã hóa và không mã hóa
Để xác định cách tín hiệu KRAS (G12C) gây ung thư điều chỉnh bản phiên mã mã hóa và không mã hóa, chúng tôi đã thực hiện giải trình tự RNA (RNA-seq) trên các nhân vật siêu anh hùng ung thư phổi KRAS (G12C) đột biến 3D. Đối với RNA-seq, chúng tôi đã sử dụng giao thức có độ dài đầy đủ với số nhận dạng phân tử duy nhất (UMI) 5' để cho phép đếm RNA chính xác đồng thời giảm thiểu sai lệch khuếch đại PCR 13 (Hình 1A). Chúng tôi đã so sánh bản phiên mã của các nhân vật anh hùng ung thư phổi H358 được điều trị bằng chất ức chế KRAS (G12C) ARS{11}} (ARS) để kiểm soát các nhân vật chính (được điều trị bằng DMSO) (Hình S1A) và thấy rằng việc điều trị ARS làm giảm đáng kể mức độ ERK bị phosphoryl hóa (p-ERK) (Hình S1B), chỉ ra rằng việc xử lý ARS đang ức chế tín hiệu KRAS (G12C) xuôi dòng. Việc ngăn chặn tín hiệu KRAS (G12C) bằng cách xử lý ARS cũng được chứng minh bằng việc giảm kích thước hình cầu và khả năng sống của tế bào (Hình S1C và S1D).
Ở cấp độ RNA, chúng tôi đã đánh giá mức độ phong phú tương đối của các kiểu gen và siêu họ TE khác nhau trong các nhân vật siêu anh hùng ung thư phổi 3D được điều trị bằng ARS- hoặc DMSO, cho thấy những thay đổi năng động trong thành phần TE RNA khi ức chế KRAS (G12C) (Hình 1B). Mặc dù chúng tôi chỉ phát hiện được 32% gen mã hóa protein có chú thích GENCODE và 15% gen lncRNA, nhưng 92-96% siêu họ TE (92% LTR, 95% SINE, 96% LINE) được thể hiện trong thẻ UMI của chúng tôi Dữ liệu RNA-seq, cho thấy sự rối loạn điều hòa rộng rãi của TE RNA trong bản phiên mã định hướng KRAS (G12C). Lên đến một phần tư tổng số phân tử RNA được phát hiện trong các nhân vật siêu anh hùng ung thư phổi được điều trị bằng ARS đều có nguồn gốc từ TE, cho thấy rằng TE RNA đại diện cho một phần khá lớn trong sản lượng phiên mã của các tế bào ung thư phổi KRAS (G12C) đột biến.
lợi ích cistanche cho nam giới - tăng cường hệ thống miễn dịch
Nhấn vào đây để xem các sản phẩm Tăng cường miễn dịch Cistanche
【Hỏi thêm] Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Tiếp theo, chúng tôi đã xác định các gen biểu hiện khác biệt đáng kể giữa các nhân vật siêu anh hùng ung thư phổi 3D được điều trị bằng ARS và DMSO để xác định các quá trình sinh học được điều chỉnh bởi tín hiệu KRAS (G12C) gây ung thư. Các nhân vật anh hùng ung thư phổi với tín hiệu KRAS (G12C) còn nguyên vẹn đã được làm phong phú đáng kể cho các gen liên quan đến điểm kiểm tra G2M, mục tiêu E2F, mục tiêu MYC và trục chính phân bào (Hình 1C). Tuy nhiên, khi ức chế KRAS (G12C), các nhân vật anh hùng ung thư phổi biểu hiện mức độ cao hơn đáng kể của các gen liên quan đến quá trình phosphoryl hóa oxy hóa, bổ sung và phản ứng IFN alpha và gamma (Hình 1C), cung cấp thêm bằng chứng hỗ trợ cho sự liên quan của tín hiệu KRAS trong quy định của các gen liên quan đến IFN 2,3.
Sự ức chế KRAS(G12C) phối hợp tạo ra ISG và các yếu tố AluY trẻ
Để làm sáng tỏ hơn quá trình điều hòa nội tại của ISG khi ức chế KRAS (G12C), chúng tôi đã xác định gen và TE nào được biểu hiện khác biệt đáng kể trong từng bộ gen và siêu họ TE tương ứng. Trên cả hai gen phản ứng gamma IFN alpha và IFN, gen gây ra sự ức chế KRAS (G12C) mạnh nhất trong các nhân vật anh hùng ung thư phổi là RTP4 (Hình 2A), một protein vận chuyển thụ thể điều chỉnh tiêu cực tín hiệu TBK1 14. Ngoài ra, phức hợp MHC lớp I gen beta-2-microglobulin (B2M), bị bất hoạt tái phát trong bệnh ung thư phổi 15, cũng được điều chỉnh tăng đáng kể ở cả hai bộ gen liên quan đến IFN trong các nhân vật siêu anh hùng ung thư phổi được điều trị bằng ARS (Hình 2A).
Với vai trò trực tiếp đối với việc truyền tín hiệu KRAS gây ung thư trong quy định TE RNA 3, chúng tôi đã nghiên cứu các phân họ nào của TE RNA phụ thuộc vào KRAS (G12C) đột biến. Trong các nhân vật anh hùng ung thư phổi có tín hiệu KRAS (G12C) còn nguyên vẹn, chúng tôi thấy rằng các phân họ LINE L1M6B và L1PA12 được biểu hiện cao và phụ thuộc vào KRAS (G12C), bằng chứng là sự điều hòa giảm của chúng trong các nhân vật anh hùng ung thư phổi được điều trị bằng ARS (Hình 2B). Ngoài ra, trong khi chỉ có một phân họ DNA duy nhất MER44D phụ thuộc vào tín hiệu KRAS(G12C), thì hơn một chục phân họ LTR được điều chỉnh bởi KRAS(G12C đột biến), bao gồm MLT1A0-int, LTR51, MER50B và LTR1B0 (Hình 2B). Ngược lại, các phân họ SINE đều được điều chỉnh tăng đáng kể nhờ ức chế KRAS (G12C) và được tạo ra phối hợp với các gen ISG cụ thể (Hình 2A) trong các nhân vật siêu anh hùng ung thư phổi. Các RNA SINE TE này đều có nguồn gốc từ phân họ AluY (Hình 2B), cho thấy rằng sự ức chế KRAS (G12C) làm rối loạn điều hòa một tập hợp con cụ thể của các yếu tố AluY trẻ.
Sự ức chế KRAS (G12C) điều hòa các RNA không mã hóa dài
Để làm rõ hơn về tác động của việc ức chế KRAS (G12C) trên bản phiên mã, chúng tôi đã kiểm tra tất cả các lncRNA được biểu hiện khác biệt đáng kể trong các nhân vật anh hùng ung thư phổi được điều trị bằng kiểm soát ARS hoặc DMSO. Chúng tôi thấy rằng một số lượng lớn lncRNA phụ thuộc vào tín hiệu KRAS (G12C) để biểu hiện chúng, vì nhiều lncRNA trong số này được điều hòa giảm đáng kể do ức chế KRAS (G12C) (Hình 3A). Ba trong số các lncRNA được điều hòa giảm này, AC114546.3, NCMAP-DT và AC073575.2, không có chức năng nào được biết đến nhưng trùng lặp theo hướng antisense với các gen mã hóa lần lượt là ZNF770, RCAN3 và ERP29. Là một loại RNA không mã hóa, chúng tôi đã quan sát thấy sự điều hòa giảm trên diện rộng của lncRNA khi điều trị ARS ở các nhân vật anh hùng ung thư phổi (Hình 3B), cho thấy rằng nhiều lncRNA phụ thuộc vào tín hiệu KRAS (G12C) để biểu hiện chúng.
lợi ích cistanche cho nam giới - tăng cường hệ thống miễn dịch
CUỘC THẢO LUẬN
Ở đây chúng tôi chỉ ra rằng tín hiệu KRAS (G12C) gây ung thư là cần thiết để biểu hiện các siêu họ TE cụ thể, cụ thể là các phần tử LINE và LTR, cũng như một tập hợp con của lncRNA, chứng minh thêm cách tín hiệu RAS điều chỉnh bản phiên mã không mã hóa 2-4. Chúng tôi cũng đã sử dụng mô hình hình cầu ung thư phổi 3D cho các thí nghiệm về chất ức chế KRAS (G12C) của mình vì các mô hình 3D đã được chứng minh là mô tả lại phản ứng thuốc in vivo một cách trung thực hơn khi so sánh với các mô hình nuôi cấy 2D16. Hơn nữa, ứng dụng của chúng tôi về mô hình đầy đủ dựa trên UMI Kỹ thuật RNA-seq dài 13 cho phép chúng tôi nắm bắt chính xác hơn thành phần và động lực của TE RNA trong các nhân vật siêu nhân ung thư phổi bằng cách loại bỏ các bản sao PCR trong dữ liệu RNA-seq của chúng tôi.
Những phát hiện của chúng tôi phù hợp với các nghiên cứu trước đây về ức chế KRAS (G12C), trong đó các gen phản ứng IFN alpha và gamma được điều hòa trong các tế bào ung thư phổi H358 được điều trị bằng ARS17. Dựa trên các đặc tính miễn dịch đã biết của RNA có nguồn gốc từ Alu, kết quả của chúng tôi cho thấy rằng sự điều hòa cụ thể của các yếu tố AluY trẻ do ức chế KRAS (G12C) ít nhất một phần chịu trách nhiệm cho sự điều hòa mạnh mẽ của ISG trong các nhân vật siêu anh hùng ung thư phổi được điều trị bằng ARS. Đáng chú ý, việc làm phong phú đáng kể các gen liên quan đến IFN để đáp ứng với điều trị bằng chất ức chế KRAS(G12C) không bao gồm việc điều chỉnh thêm các ISG cảm biến RNA như MDA-5, RIG-I hoặc PKR, ban đầu được điều chỉnh lại trong tế bào phổi phản ứng với tín hiệu KRAS gây ung thư 2,3.
Trước đây chúng tôi đã chỉ ra rằng chỉ riêng tín hiệu KRAS đột biến là đủ để tạo ra sự điều hòa tăng TE RNA trong tế bào phổi người đã được biến đổi in vitro 2,3 và kết quả của chúng tôi được mô tả ở đây đã mở rộng những quan sát này đến các tế bào ung thư phổi có đột biến KRAS kích hoạt khác. Các đột biến KRAS(G12D) hoặc KRAS(G12V) đều gây ra sự điều hòa tăng đáng kể của phân họ LTR12C trong các tế bào phổi đã biến đổi 3, nhưng chúng tôi không thấy sự phong phú đáng kể của các RNA TE có nguồn gốc LTR12C trong các nhân vật siêu anh hùng ung thư phổi KRAS (G12C) của chúng tôi. Thay vào đó, chúng tôi nhận thấy sự điều chỉnh tăng của LTR51, LTR1B0, LTR14B và LTR28B, cho thấy rằng các đột biến tăng cường chức năng đa dạng trong KRAS điều chỉnh các khía cạnh khác nhau của bản phiên mã TE RNA.
Công việc của chúng tôi cung cấp một đánh giá toàn diện về cách thức phiên mã RNA không mã hóa/TE RNA phản ứng linh hoạt với sự ức chế KRAS (G12C). Các nghiên cứu trong tương lai có thể cung cấp những hiểu biết mới về vai trò tiềm năng của RNA không mã hóa/TE trong cơ chế kháng thuốc ức chế KRAS (G12C). Hơn nữa, TE RNA được tiết ra từ tế bào ung thư do ức chế KRAS có thể đóng vai trò là dấu ấn sinh học RNA ngoại bào 2,3,5,18,19 phản ứng và/hoặc đề kháng với các liệu pháp ức chế KRAS 20.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Dòng tế bào
Các dòng tế bào ung thư phổi H358 chứa đột biến KRAS(G12C) được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 (Invitrogen) bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (Sigma) ở 37 độ, 5% CO2 trong tủ ấm tạo ẩm. Tất cả các dòng tế bào được xét nghiệm đều âm tính với mycoplasma. Các dòng tế bào được mua từ Bộ sưu tập văn hóa kiểu Mỹ (ATCC).
Xét nghiệm khả năng sống của tế bào
Đối với các thử nghiệm khả năng sống của hình cầu, 10,000 tế bào/giếng được gieo vào các đĩa giếng 96-có đáy tròn có độ bám dính thấp và được ủ ở 37 độ, 5% CO2 trong 24 giờ. Sau đó, ARS{7}} hoặc DMSO được pha loãng huyết thanh được thêm vào các tế bào và các đĩa được ủ trong điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn trong 72 giờ, với môi trường ARS và DMSO mới được thay thế hàng ngày. Khả năng sống của tế bào được đo bằng bộ xét nghiệm khả năng sống của tế bào phát quang Cell Titer-Glo® (Promega) theo quy trình của nhà sản xuất. Tín hiệu phát quang của các mẫu được xử lý ARS đã được chuẩn hóa thành điều khiển DMSO. Độ phát quang được đo trên thiết bị phân tử SpectraMax iD3.
Phân lập RNA
Tổng số RNA lớn được phân lập từ khoảng 100 nhân vật chính H358 (mỗi điều kiện) bằng cách sử dụng bộ Quick-RNA Mini-Prep (Zymogen) theo giao thức của nhà sản xuất. RNA được định lượng bằng Máy đo quang phổ NanoDrop-8000.
Chuẩn bị thư viện RNA-seq
Giao thức Smart-seq3 được điều chỉnh 13 đã được sử dụng để tạo các thư viện RNA-seq từ tổng số RNA để đếm và đánh giá các phân tử RNA có chiều dài đầy đủ. Tóm lại, 1{12}}ng RNA tổng số được phiên mã ngược bằng cách sử dụng mồi oligoDT có mã vạch (125nM), sau đó chuyển đổi mẫu bằng oligo chuyển mẫu có mã vạch (125nM). Các trình tự oligo này đóng vai trò là mồi cho quá trình khuếch đại PCR. Bộ Nextera HT (Illumina) đã được sử dụng để chuyển đổi các thư viện cDNA thành các thư viện giải trình tự bằng cách bổ sung đoạn mồi dành riêng cho UMI để khuếch đại các đầu cDNA chứa mã vạch phân tử như được mô tả trong giao thức Smart-seq3. cDNA và chất lượng thư viện được đánh giá bằng cách sử dụng chip có độ nhạy cao DNA của máy phân tích sinh học Agilent và định lượng bằng xét nghiệm DNA có độ nhạy cao trên Qubit 3.0.
phong cách phương Tây
Khoảng 100 nhân vật chính H358 (mỗi điều kiện) đã được phân lập sau khi xử lý ARS hoặc DMSO. Các nhân vật anh hùng sau đó được ủ trên băng trong dung dịch đệm RIPA có bổ sung chất ức chế protease trong 15 phút. Lysate sau đó được quay ở tốc độ 10,000 RCF trong 10 phút. Sau đó, chất nổi phía trên được chuyển sang ống mới để chuẩn bị mẫu SDS-PAGE tiếp theo trong dung dịch đệm Laemmli, đun sôi trong 5 phút ở 95 C cho nồng độ cuối cùng là 1mg/ml. TRANG SDS được thực hiện để tách protein theo kích thước, sau đó chuyển sang màng PVDF. Màng được ủ với kháng thể p-ERK (CST) và HSP90 (CST) chính qua đêm ở 4 C. Sau đó, kháng thể thứ cấp (Abcam) được ủ trên màng rửa TBST 3 lần trong đệm chặn để chụp ảnh tiếp theo.
lợi ích cistanche cho nam giới - tăng cường hệ thống miễn dịch
Chống trùng lặp UMI
Các lần đọc Illumina cuối được ghép nối đã được cắt bớt bộ điều hợp bằng FastP 21 với cài đặt mặc định. UMI được trích xuất từ phần đọc và chuyển sang tên đọc bằng cách sử dụng umi_công cụ_giải nén từ gói công cụ UMI 22 với mẫu mã vạch được đặt thành "NNNNNNNN". Các lần đọc bị xóa UMI được căn chỉnh theo HG38 bằng cách sử dụng bộ căn chỉnh STAR với bộ chú thích GENCODE v38. Các lần đọc đã căn chỉnh được loại bỏ trùng lặp bằng cách sử dụng "sao chép công cụ UMI" với cài đặt mặc định.
Phân tích trình tự RNA
Tất cả các tệp fastq đã được cắt bớt bằng Trimmomatic 2 (0.38) 23 và kết quả là các tệp bị cắt bớt được đánh giá bằng FastQC 24, sau đó được xử lý bằng quy trình phân tích sau: Salmon (1.3.0): sắp xếp giả của RNA -seq đọc được thực hiện với Salmon 25 bằng cách sử dụng các đối số sau: {{1{{20}}}}validateMappings –gcBias --seqBias --recoverOrphans --rangeFactorizationBins 4 sử dụng một chỉ mục được tạo từ tệp fasta phiên âm GENCODE phiên bản 35 bằng cách sử dụng các chuỗi mồi nhử để cho phép căn chỉnh có chọn lọc. Một chỉ mục bổ sung, nhận biết TE đã được tạo theo cách tương tự nhưng được bổ sung các chuỗi được tạo từ bản nhạc UCSC Repeat Masker. DESeq2 (1.32.0): Đầu ra cá hồi được nhập vào đối tượng DESeq bằng tximport 26 và phân tích biểu thức vi phân được thực hiện với các đối số tiêu chuẩn 27. Tất cả kết quả đều được lọc để có padj < 0,05. Khi sử dụng dữ liệu đếm, nó được chuẩn hóa trên các mẫu bằng DESeq.
Phân tích làm giàu bộ gen
Các gen biểu hiện khác nhau được xếp hạng theo giá trị log2FoldChange được thu nhỏ do DESeq2 tạo ra. Các bộ gen được thu thập bằng gói R msigdbr (7.4.1) và được lọc để chỉ chứa các bộ gen có trạng thái 'Dấu ấn'. Gói R fgsea (1.18.0) đã được sử dụng để tạo các ước tính Làm giàu bộ gen được lọc để đưa ra kết quả với các giá trị p được điều chỉnh < 0.05.
NGƯỜI GIỚI THIỆU
1. Bỏng, KH (2017). Các yếu tố có thể thay thế trong bệnh ung thư. Nat Rev Cancer 17, 415-424. 10.1038/nrc.2017.35.
2. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L., Kim, E., Malik, S., Fernandes, J., et al. (2020). Lập trình lại biểu sinh của các RNA không mã hóa lặp đi lặp lại và các gen được kích thích bằng IFN bởi KRAS đột biến. bioRxiv, 2020.2011.2004.367771. 10.1101/2020.11.04.367771.
3. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Hrabeta-Robinson, E., Behera, A., Peddu, V., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L ., et al. (2022). KRAS đột biến điều chỉnh RNA yếu tố có thể thay thế và khả năng miễn dịch bẩm sinh thông qua gen ngón tay kẽm KRAB. Báo cáo di động 40. 10.1016/j.celrep.2022.111104.
4. Kim, DH, Marinov, GK, Pepke, S., Singer, ZS, He, P., Williams, B., Schroth, GP, Elowitz, MB, và Wold, BJ (2015). Phân tích phiên mã đơn bào cho thấy những thay đổi động trong biểu hiện lncRNA trong quá trình tái lập trình. Tế bào gốc Tế bào 16, 88-101. 10.1016/j.stem.2014.11.005.
5. Reggiardo, RE, Maroli, SV và Kim, DH (2022). Dấu ấn sinh học LncRNA của viêm và ung thư. Adv Exp Med Biol 1363, 121-145. 10.1007/978-3-030-92034-0_7.
6. Schmitt, AM và Chang, HY (2016). RNA không mã hóa dài trong con đường ung thư. Tế bào Ung thư 29, 452-463. 10.1016/j.ccell.2016.03.010.
7. Rinn, JL và Chang, HY (2020). Các RNA không mã hóa dài: Các phương thức phân tử đối với các chức năng của sinh vật. Annu Rev Biochem 89, 283-308. 10.1146/annurev-biochem- 062917-012708.
8. Slack, FJ và Chinnaiyan, AM (2019). Vai trò của RNA không mã hóa trong ung thư. Ô 179, 1033-1055. 10.1016/j.cell.2019.10.017.
9. Chiappinelli, Katherine B., Strissel, Pamela L., Desrichard, A., Li, H., Henke, C., Akman, B., Hein, A., Rote, Neal S., Cope, Leslie M. , Snyder, A., và cộng sự. (2015). Ức chế quá trình methyl hóa DNA gây ra phản ứng Interferon trong bệnh ung thư thông qua DSRNA, bao gồm cả Retrovirus nội sinh. Ô 162, 974-986. 10.1016/j.cell.2015.07.011.
10. Roulois, D., Loo Yau, H., Singhania, R., Wang, Y., Danesh, A., Shen, Shu Y., Han, H., Liang, G., Jones, Peter A., Pugh, Trevor J., và những người khác. (2015). Các tác nhân khử methyl DNA nhắm vào các tế bào ung thư đại trực tràng bằng cách tạo ra sự bắt chước virus bằng các bản phiên mã nội sinh. Ô 162, 961-973. 10.1016/j.cell.2015.07.056.
11. Mehdipour, P., Marhon, SA, Ettayebi, I., Chakravarthy, A., Hosseini, A., Wang, Y., de Castro, FA, Loo Yau, H., Ishak, C., Abelson, S ., et al. (2020). Liệu pháp biểu sinh gây ra sự phiên mã của SINE đảo ngược và sự phụ thuộc ADAR1. Thiên nhiên 588, 169-173. 10,1038/giây41586-020-2844-1.
12. Ostrem, JM, Peters, U., Sos, ML, Wells, JA và Shokat, KM (2013). Các chất ức chế K-Ras (G12C) kiểm soát đồng đều các mối tương tác giữa ái lực và tác nhân GTP. Thiên nhiên 503, 548- 551. 10.1038/thiên nhiên12796.
13. Hagemann-Jensen, M., Ziegenhain, C., Chen, P., Ramskold, D., Hendriks, GJ, Larsson, AJM, Faridani, OR và Sandberg, R. (2020). Đếm RNA đơn bào ở độ phân giải alen và isoform bằng Smart-seq3. Công nghệ sinh học Nat 38, 708-714. 10,1038/giây{10}}.
14. He, X., Ashbrook, AW, Du, Y., Wu, J., Hoffmann, HH, Zhang, C., Xia, L., Peng, YC, Tumas, KC, Singh, BK, et al. (2020). RTP4 ức chế phản ứng IFN-I và tăng cường bệnh sốt rét não và bệnh lý thần kinh thực nghiệm. Proc Natl Acad Sci USA 117, 19465- 19474. 10.1073/pnas.2006492117.
15. Pereira, C., Gimenez-Xavier, P., Pros, E., Pajares, MJ, Moro, M., Gomez, A., Navarro, A., Condom, E., Moran, S., Gomez- López, G., và cộng sự. (2017). Hồ sơ bộ gen của xenograft có nguồn gốc từ bệnh nhân để điều trị ung thư phổi xác định tình trạng bất hoạt B2M làm suy giảm khả năng nhận thức miễn dịch. Phòng khám Ung thư Res 23, 3203-3213. 10.1158/1078-0432.CCR-16-1946.
16. Sen, C., Freund, D. và Gomperts, BN (2022). Mô hình ba chiều của phổi: quá khứ, hiện tại và tương lai: một đánh giá nhỏ. Biochem Sóc Trans 50, 1045-1056. 10.1042/BST20190569. 17. Mugarza, E., van Maldegem, F., Boumelha, J., Moore, C., Rana, S., Llorian Sopena, M., East, P., Ambler, R., Anastasiou, P., Romero -Clavijo, P., và cộng sự. (2022). Ức chế KRAS (G12C) trị liệu thúc đẩy khả năng miễn dịch chống ung thư qua trung gian interferon hiệu quả trong bệnh ung thư phổi miễn dịch. Khoa học Adv 8, eabm8780. 10.1126/sciadv.abm8780.
18. Khojah, R., Reggiardo, RE, Ozen, M., Maroli, SV, Carrillo, D., Demirci, U., và Kim, DH (2022). Chữ ký RNA ngoại bào của tế bào ung thư biểu mô tuyến phổi KRAS (G12C) đột biến. bioRxiv, 2022.2002.2023.481574. 10.1101/2022.02.23.481574.
19. Wang, J., Ma, P., Kim, DH, Liu, BF, và Demirci, U. (2021). Hướng tới việc phân lập và phát hiện exosome dựa trên vi lỏng để điều trị khối u. Nano Hôm nay 37. 10.1016/j.nantod.2020.101066.
20. Moore, AR, Rosenberg, SC, McCormick, F. và Malek, S. (2021). Liệu pháp nhắm mục tiêu RAS Nat Rev Thuốc Discov. 10,1038/giây41573-021-00220-6.
21. Chen, S., Chu, Y., Chen, Y. và Gu, J. (2018). fastp: bộ tiền xử lý FASTQ tất cả trong một cực nhanh. Tin sinh học 34, i{6}}i890. 10.1093/tin sinh học/bty560.
22. Smith, T., Heger, A. và Sudbery, I. (2017). Công cụ UMI: mô hình hóa các lỗi trình tự trong Mã định danh phân tử duy nhất để cải thiện độ chính xác của định lượng. Bộ gen Res 27, 491- 499. 10.1101/gr.209601.116.
23. Bolger, AM, Lohse, M. và Usadel, B. (2014). Trimmomatic: một công cụ cắt linh hoạt cho dữ liệu chuỗi Illumina. Tin sinh học 30, 2114-2120. 10.1093/tin sinh học/btu170.
24. Brown, J., Pirrung, M. và McCue, LA (2017). Bảng điều khiển FQC: tích hợp các kết quả FastQC vào một công cụ kiểm soát chất lượng FASTQ dựa trên web, tương tác và có thể mở rộng. Tin sinh học. 10.1093/tin sinh học/btx373.
25. Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA và Kingsford, C. (2017). Salmon cung cấp định lượng nhanh chóng và nhận biết sai lệch về biểu thức bảng điểm. Phương pháp Nat 14, 417-419. 10.1038/nmeth.4197.
26. Soneson, C., Love, MI, và Robinson, MD (2015). Các phân tích khác biệt đối với RNA-seq: ước tính ở cấp độ phiên mã cải thiện các suy luận ở cấp độ gen. F1000Res 4, 1521. 10.12688/f1000research.7563.2.
27. Love, MI, Huber, W., và Anders, S. (2014). Ước tính được kiểm duyệt về sự thay đổi và phân tán nếp gấp đối với dữ liệu RNA-seq với DESeq2. Bộ gen Biol 15, 550. 10.1186/s13059-014- 0550-8.
SỰ NHÌN NHẬN
Chúng tôi cảm ơn các thành viên của Kim Lab vì những cuộc thảo luận hữu ích. Công việc này được hỗ trợ bởi nguồn vốn từ Trường Kỹ thuật Baskin (cho DHK). DC được hỗ trợ bởi Giải thưởng Học bổng Tiền tiến sĩ từ Chương trình Nghiên cứu Bệnh liên quan đến Thuốc lá (T30DT0997), RER được hỗ trợ bởi Giải thưởng Chuyển tiếp Nghiên cứu sinh Tiền tiến sĩ sang Sau Tiến sĩ của F99/K00 NIDDK KUH từ Viện Y tế Quốc gia (1F99DK{ {7}}) và VP đã được hỗ trợ bởi Giải thưởng Học bổng Tiền Tiến sĩ từ Chương trình Nghiên cứu Bệnh liên quan đến Thuốc lá (T32DT4904).
SỰ ĐÓNG GÓP CỦA TÁC GIẢ
DHK lên ý tưởng nghiên cứu, DC và DHK thiết kế nghiên cứu, DC, JL và GM thực hiện các thí nghiệm, RER và VP phân tích dữ liệu, còn DC và DHK viết bài báo với ý kiến đóng góp của các tác giả.
SỐ LIỆU
Hình 1. Sự ức chế KRAS(G12C) làm thay đổi bản phiên mã mã hóa và không mã hóa A. Sơ đồ thí nghiệm. B. Phân phối số lượng được gán cho các siêu họ mã hóa GENCODE, lncRNA và TE/lặp lại trong các thư viện RNA-seq hình cầu ung thư phổi được xử lý bằng ARS (ars) hoặc được xử lý bằng DMSO (dmso), trong đó mỗi cột đại diện cho một bản sao sinh học. C. Các kết quả Phân tích làm giàu bộ gen đáng kể được quan sát thấy trong các nhân vật siêu nhân ung thư phổi được điều trị bằng DMSO (phải, NES dương tính) hoặc được điều trị bằng ARS (trái, NES âm tính) bằng cách sử dụng các gen biểu hiện khác nhau được xếp hạng theo điểm làm giàu chuẩn hóa (NES).
Hình 2. Sự ức chế KRAS(G12C) phối hợp tạo ra ISG và các phần tử AluY trẻ
A. Sơ đồ núi lửa mô tả biểu hiện khác biệt đáng kể được quan sát thấy trong các bộ gen quan trọng giữa các nhân vật chính ung thư phổi được xử lý DMSO (phải, thay đổi nếp gấp dương) hoặc được xử lý ARS (thay đổi nếp gấp âm). B. Sơ đồ núi lửa mô tả biểu hiện khác biệt đáng kể được quan sát thấy trong các siêu họ TE giữa các nhân vật siêu anh hùng ung thư phổi được điều trị bằng DMSO (phải, thay đổi nếp gấp dương) hoặc được điều trị bằng ARS (trái, thay đổi nếp gấp âm).
Hình 3. Sự ức chế KRAS(G12C) điều hòa các RNA không mã hóa dài
A. Sơ đồ núi lửa biểu hiện sự khác biệt đáng kể của các RNA và lncRNA mã hóa protein GENCODE giữa các nhân vật siêu anh hùng ung thư phổi được xử lý DMSO (phải, thay đổi nếp gấp dương) hoặc được xử lý ARS (trái, thay đổi nếp gấp âm). B. Biểu đồ hình hộp biểu hiện sự khác biệt đáng kể của các RNA mã hóa protein GENCODE và lncRNA giữa các nhân vật anh hùng ung thư phổi được xử lý DMSO (thay đổi nếp gấp dương) hoặc được xử lý ARS (thay đổi nếp gấp âm) (Wilcoxon).
HÌNH BỔ SUNG
Hình S1.
A. Nhân vật chính ung thư phổi H358 3D được điều trị bằng ARS hoặc DMSO. B. Western blot cho p-ERK và HSP90 bằng cách sử dụng các nhân vật siêu nhân ung thư phổi H358 3D được điều trị bằng ARS hoặc DMSO. C. Đo đường kính (tính bằng micromet) (sơ đồ bên trái) và khả năng sống sót của tế bào (khả năng sống sót của tế bào phát quang Cell Titer-Glo® trong đơn vị huỳnh quang tương đối) (sơ đồ bên phải) của các nhân vật siêu nhân ung thư phổi H358 3D được điều trị bằng ARS hoặc DMSO sau 3 hoặc 5 ngày điều trị (500 nM ARS-1620 hoặc DMSO). D. Đo đường kính (tính bằng micromet) của nhân vật siêu nhân ung thư phổi H358 3D được điều trị bằng các nồng độ ARS-1620 (nM) khác nhau trong 7 ngày.
