Sạm da là kết quả của quá trình tích tụ sắc tố da melanin. Để chống lại điều này, rất nhiều chất làm sáng da có bán trên thị trường, hầu hết đều ức chế tổng hợp melanin. Khử màu sắc tố melanin là một phương pháp làm sáng da thay thế. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ ra rằng lignin peroxidase (LiP), một loại enzyme ngoại bào được tinh chế từ Phanerochaete chrysosporium NK-1 được phân lập từ đất rừng có thể phân hủy và khử màu melanin một cách hiệu quả trong ống nghiệm. Các điều kiện khử màu bao gồm pH, nhiệt độ, thời gian ủ, nồng độ enzyme và bổ sung chất trung gian đã được nghiên cứu để tối ưu hóa các điều kiện phản ứng. Kết quả chỉ ra rằng độ pH 3, 40 độ , 15 IU/ml và thời gian ủ 10 giờ là điều kiện tối ưu cho quá trình khử màu của hắc tố. Việc sử dụng chất trung gian, rượu veratryl cũng được phát hiện là có hiệu quả để tăng cường hiệu quả của quá trình khử sắc tố melanin, với khả năng khử màu lên tới 92%. Kết quả kính hiển vi điện tử quét cho thấy các khoảng trống trên các hạt melanin được xử lý so với mẫu không được xử lý, cho thấy sự phân hủy của melanin. Những thay đổi trong vùng vân tay của hắc tố đã được quan sát. Ví dụ, giữa các số sóng 1500–500 cm−1, sự hiện diện của các đỉnh mới trong hắc tố được xử lý ở 1513, 1464 và 1139 cm−1 uốn cong CH2, CH3 và kéo dài C–O–C thể hiện các thay đổi về cấu trúc. Một đỉnh mới ở 2144 cm−1 (độ kéo dài alkynyl C≡C) cũng được phát hiện trong hắc tố đã khử màu. Nghiên cứu về độc tính tế bào đã chỉ ra rằng melanin và LiP được xử lý có tác dụng gây độc tế bào thấp; tuy nhiên, chất trung gian của rượu veratryl có thể dẫn đến tỷ lệ tử vong cao, điều này cho thấy rằng việc sử dụng nó cần được kiểm tra tỉ mỉ trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe và chăm sóc da. Các phát hiện của nghiên cứu cho thấy rằng LiP được sản xuất bởi Phanerochaete chrysosporium có tiềm năng được sử dụng trong ngành công nghiệp y tế và mỹ phẩm, đặc biệt là để phát triển các chất làm trắng mỹ phẩm dựa trên sinh học.

Theo các nghiên cứu có liên quan, cistanche là một loại thảo mộc phổ biến được mệnh danh là "thần dược kéo dài tuổi thọ". Thành phần chính của nó là cistanoside, có nhiều tác dụng như chống oxy hóa, chống viêm và tăng cường chức năng miễn dịch. Cơ chế giữa cistanche và làm trắng da nằm ở tác dụng chống oxy hóa của glycoside cistanche. Melanin trong da người được tạo ra bởi quá trình oxy hóa tyrosine được xúc tác bởi tyrosinase, và phản ứng oxy hóa cần có sự tham gia của oxy, vì vậy các gốc tự do oxy trong cơ thể trở thành một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sản xuất melanin. Cistanche chứa cistanoside, một chất chống oxy hóa và có thể làm giảm sự hình thành các gốc tự do trong cơ thể, do đó ức chế sản xuất melanin.

Bấm vào Cistanches Herba để làm trắng

Để biết thêm thông tin:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Melanin là một nhóm các sắc tố da cao phân tử sinh học đa vòng phức tạp, khó phân hủy và phổ biến được sản xuất bởi các tế bào da chuyên biệt gọi là tế bào biểu bì tạo hắc tố 1,2. Chức năng chính của nó là bảo vệ da chống lại bức xạ tia cực tím có hại của ánh sáng mặt trời bằng cách hình thành các mũ siêu nhân xung quanh DNA của tế bào da 3. Bên cạnh đó, nó chịu trách nhiệm tạo ra các màu da khác nhau bằng cách hấp thụ các gốc tự do khác nhau trong tế bào chất. Hầu hết các chất làm sáng da thu được từ các nguồn tài nguyên thiên nhiên này đều ức chế sản xuất melanin trong tế bào da bằng cách ức chế enzym tyrosinase, ức chế sinh tổng hợp sắc tố và thông qua một số con đường thay thế. Các hợp chất khác nhau như hydroquinone, ete mono-benzyl của hydroquinone, thủy ngân, corticosteroid và arbutin đang được sử dụng trong công thức thương mại cho mỹ phẩm làm trắng da, tuy nhiên, ứng dụng của chúng có liên quan đến các tác dụng phụ nghiêm trọng. Ví dụ, thủy ngân được cho là gây hại cho thận và chì được cho là gây lo lắng, trầm cảm và rối loạn tâm thần 4,5. Sử dụng corticoid có thể gây hội chứng Cushing, đái tháo đường, tăng huyết áp, suy tuyến thượng thận, ức chế miễn dịch, mỏng da, trứng cá, viêm da, rậm lông 6. Tain et al. (2009) đã báo cáo rằng việc sử dụng arbutin trong mỹ phẩm làm trắng da có hiệu quả với nồng độ lên tới 3% nhưng sự gia tăng hơn nữa nồng độ sẽ gây ra tác dụng gây độc tế bào. Xem xét những hạn chế này, các ứng dụng của các chất ức chế này trong mỹ phẩm làm trắng da đã bị chỉ trích rộng rãi bởi các cơ quan an toàn và sức khỏe. Người ta đã đề xuất rằng mỹ phẩm làm trắng da có thể đạt tới 155,44 tỷ USD vào năm 2021 với tốc độ tăng trưởng hàng năm là 4,9%. Do nhu cầu ngày càng tăng đối với các chất làm trắng da tự nhiên và an toàn trên toàn thế giới, quá trình khử màu melanin bằng enzyme đã nhận được sự quan tâm đáng kể từ 7-9.

Các enzym ngoại bào của vi sinh vật như laccase, mangan peroxidase và lignin peroxidase (LiP) trước đây đã được thử nghiệm để khử màu melanin và được coi là một giải pháp thay thế thân thiện với môi trường tiềm năng cho các hóa chất độc hại 1. Trong số này, LiP được cho là rất hiệu quả trong việc khử màu melanin vì khả năng oxy hóa khử cao của nó để oxy hóa rượu veratryl (VA) hơn các enzym liên quan khác. Mặc dù khả năng oxy hóa cao và xúc tác hiệu quả của melanin, nhưng việc sản xuất số lượng lớn và khó tinh chế là những hạn chế chính đối với các ứng dụng thương mại của LiP trong các chất làm trắng da. Ngoài ra, LiP mất hoạt tính enzyme đối với quá trình khử sắc tố melanin dưới tác dụng của hydrogen peroxide dư thừa, được coi là rất quan trọng đối với quá trình oxy hóa melanin. Bên cạnh vai trò quan trọng của nó, H2O2 làm bất hoạt LiP do đó làm giảm hiệu suất xúc tác của enzyme.

Kết quả

Khử màu hắc tố bởi Phanerochaete chrysosporium NK‑1.Các chủng nấm đã được thử nghiệm để khử màu melanin. Nấm được cấy tại chỗ trên môi trường đặc có chứa melanin và VA là chất cảm ứng LiP. Sau bảy ngày ủ, Phanerochaete chrysosporium NK-1 cho thấy khả năng khử màu sắc tố melanin, như thể hiện trong Hình 1.

Điều kiện để khử màu melanin tối ưu.độ pH. Enzyme tinh khiết được sử dụng để khử màu của melanin tổng hợp trong ống nghiệm. Đã quan sát thấy ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau đối với quá trình khử màu của hắc tố 10. Ảnh hưởng của độ pH đối với quá trình khử màu melanin bằng LiP đã được kiểm tra trước tiên. Đối với điều này, quá trình khử màu melanin được thực hiện ở các điều kiện pH khác nhau, dao động từ 2.0 đến 6,0 ở nhiệt độ 30 độ cả khi có và không có VA trong thời gian ủ là 6 giờ. Kết quả ở Hình 2 cho thấy nhìn chung, quá trình khử màu của hắc tố khi có VA cao hơn trong mọi điều kiện pH. Đặc biệt, nó nổi bật hơn trong điều kiện pH cao hơn. VA có thể hỗ trợ hình thành các gốc cation 11. Các gốc này có khả năng oxi hóa khử cao hơn nhiều để tấn công các liên kết C–C không đặc hiệu trong hắc tố và dẫn đến hiện tượng khử màu 12. Với sự hiện diện của VA, khả năng khử màu của hắc tố cao nhất là 88% đã đạt được ở pH 3, tiếp theo là 71% ở pH 2, trong khi đó mức khử màu melanin thấp nhất là 39% được quan sát thấy ở pH 6. Khi không có VA, mức khử màu melanin cao nhất 86 phần trăm được quan sát thấy ở pH 3 trong khi mức thấp nhất sự khử màu của hắc tố lần lượt là 35% và 36% được quan sát thấy ở độ pH 5 và 6. Quá trình khử màu hắc tố bằng LiP trong nghiên cứu này đạt hiệu quả cao ở điều kiện pH thấp hơn, tức là 2 và 3 (Hình 2), mặc dù các nghiên cứu khác cho thấy điều kiện pH tối ưu ở 4 1.

Nhiệt độ. Quá trình khử màu melanin bằng LiP đã được nghiên cứu ở các nhiệt độ khác nhau, từ 20–60 độ cả khi có và không có VA trong thời gian ủ là 6 giờ. Khi không có VA, tỷ lệ phần trăm tương tự (19 phần trăm) quá trình khử màu của hắc tố được quan sát thấy ở nhiệt độ 20 và 30 độ (Hình 3). Sự khử màu melanin cao nhất và thấp nhất khi không có VA được quan sát tương ứng ở 40 và 50 độ. Tuy nhiên, với VA trong dung dịch, độ khử màu của melanin tăng từ 20 đến 40 độ và giảm đến 60 độ. Với sự hiện diện của VA, sự khử màu sắc tố melanin cao nhất là khoảng 60 phần trăm ở 40 độ. Sự khử màu nói chung thấp hơn vì thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện pH nhẹ hơn.

nồng độ LiP. Quá trình khử màu của hắc tố cũng được kiểm tra với sự thay đổi về nồng độ enzym. Năm nồng độ khác nhau, tức là 5, 10, 15, 20 và 25 IU/mL của LiP đã được kiểm tra về sự khử màu của hắc tố khi có và không có VA, như thể hiện trong Hình 4. Đáng ngạc nhiên là nồng độ enzyme hiệu quả nhất là 15 IU/ml cho cả dung dịch có và không có VA. Sau thời gian ủ 6 giờ, sự khử màu sắc tố melanin cao nhất là 92% khi có mặt VA và 70% khi không có chất trung gian sử dụng nồng độ enzyme là 15 IU/mL, trong khi sự khử màu sắc tố melanin thấp nhất là 23% được quan sát thấy ở sự vắng mặt của VA khi sử dụng 5 IU/mL LiP. Không rõ là quá trình khử màu kém hiệu quả hơn với nồng độ enzyme cao, tức là 20 và 25 IU/ml (Hình 4).

Thời gian ủ bệnh. Các thí nghiệm khử màu được thực hiện ở 2, 4, 6, 8 và 10 giờ ủ. Những phản ứng này cũng được thực hiện khi có và không có VA. Kết quả cho thấy hiệu quả khử màu tương quan thuận với thời gian ủ, như mong đợi (Hình 5). Sự gia tăng mức độ định vị rõ ràng hơn trong quá trình ủ ban đầu. Sự mất màu sắc tố melanin cao nhất (68 phần trăm ) được quan sát thấy sau thời gian ủ 10 giờ với sự có mặt của VA và 59 phần trăm khi không có VA. Sự khử màu của melanin thấp tới 15% sau 2 giờ ủ mà không có VA. Do đó, dựa trên kết quả thử nghiệm, chúng tôi đã kết luận rằng các điều kiện tối ưu là pH 3, 40 độ , 15 IU/ml và ủ 10 giờ.

Phân tích SEM (Kính hiển vi điện tử quét) và FTIR (quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier).Những thay đổi về hình thái và cấu trúc của melanin được đặc trưng bởi SEM và FTIR, tương ứng. Melanin đã khử màu được phân tích bằng SEM để quan sát bất kỳ thay đổi bề mặt nào về mặt hình thái. Melanin tổng hợp mà không cần xử lý bằng enzyme đã được sử dụng làm đối chứng. Như thể hiện trong Hình 6, có khoảng trống trên các hạt melanin được xử lý so với mẫu không được xử lý, cho thấy các hạt melanin đã bị enzyme tấn công.

Melanin đã khử màu cũng được phân tích bằng FTIR với hắc tố không được xử lý làm đối chứng (Hình 7). Các dấu hiệu phân tử của cả hắc tố đã khử màu và chưa được xử lý đã được thu thập và so sánh để xác nhận bất kỳ thay đổi cấu trúc nào trong hắc tố đã xử lý 13. Phổ FTIR của hắc tố (C18H10N2O4) cho thấy phổ hấp thụ rộng ở 3272 cm−1 có thể được quy cho đặc tính O Dao động kéo dài –H hoặc kéo dài N–H của axit cacboxylic và nhóm phenolic. Những thay đổi trong phổ FTIR của hắc tố được điều trị là đáng chú ý. Băng thông rộng ở số sóng 3000–3500 cm−1 cho thấy sự hiện diện của các nhóm -NH và -OH trong cả mẫu đối chứng và mẫu được xử lý. Tuy nhiên, cường độ của mẫu được xử lý cao hơn đáng kể so với mẫu đối chứng, cho thấy việc xử lý đã bổ sung các nhóm chức này vào cấu trúc bằng cách tấn công enzyme. Các pic ở 2884,4 cm−1 và 2822 cm−1 cho thấy sự hiện diện của các nhóm alkyl trong đối chứng trong khi ở melanin bị khử màu, không có pic ở số sóng 2884,4 cm−1. Đỉnh ở 2822 cm−1 bị lệch sang bước sóng 2835,92 cm−1, điều này cũng thể hiện sự thay đổi cấu trúc của hắc tố được xử lý ở vùng này. Đỉnh ở số sóng 1710 cm−1 trong đối chứng được cho là do sự có mặt của axit cacboxylic. Đỉnh này cũng không có hoặc giảm ở mức độ lớn trong hắc tố bị khử màu, một lần nữa khẳng định sự thay đổi cấu trúc của hắc tố được điều trị. Cũng có một số thay đổi trong vùng vân tay. Ví dụ, giữa các số sóng 1500–500 cm−1, sự hiện diện của các đỉnh mới trong hắc tố được xử lý ở 1513, 1464 và 1139 cm−1 thể hiện các thay đổi về cấu trúc. Một đỉnh mới ở 2144 cm-1 cũng được phát hiện trong hắc tố đã khử màu.

Tác dụng gây độc tế bào.Độc tính gây độc tế bào của melanin và LiP bị thoái hóa đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng phương pháp gây độc tế bào tôm ngâm nước muối 14,15. Trong nghiên cứu hiện tại, tác dụng gây độc tế bào của melanin và LiP được xử lý là thấp với tỷ lệ sống sót của ấu trùng tôm là Lớn hơn hoặc bằng 90 phần trăm (Bảng 1). Sự gia tăng nồng độ LiP không ảnh hưởng đến khả năng sống sót của ấu trùng tôm lên đến 80 ul/mL (~80 IU/ml), cho thấy hoạt tính gây độc tế bào thấp của nó. Trong các biện pháp kiểm soát tích cực với VA, tỷ lệ tử vong là 100 phần trăm, cho thấy rằng nên thận trọng trong quá trình áp dụng LiP với sự hiện diện của VA như một chất trung gian trong lĩnh vực y tế và thẩm mỹ.

Cuộc thảo luận

Trong trường hợp nhiệt độ, sự phát triển của nấm và sản xuất enzyme cao nhất đạt được ở 40 độ, tương ứng với môi trường sống tự nhiên của P. chrysosporium. Khả năng phân hủy hắc tố của LiP dựa trên sự tương đồng về cấu trúc giữa melanin và lignin 18. Hiệu quả của quá trình phân hủy hắc tố bằng LiP trong ống nghiệm cũng tương quan với một số yếu tố như pH, nhiệt độ, nồng độ enzyme và thời gian ủ. như sự tồn tại của VA. LiP có thể oxy hóa VA thành các gốc cation của nó (VA∙ cộng ) và đóng vai trò là chất trung gian oxy hóa khử làm mất màu sắc tố melanin hơn nữa, như thể hiện trong Hình 8.

H2O2 là chất nền thiết yếu đóng vai trò là chất nhận điện tử cuối cùng trong quá trình khử màu melanin. LiP dễ dàng bị bất hoạt ở nồng độ vượt quá của chúng, điều này gây ra sự phá vỡ cấu trúc heme hoặc hình thành hợp chất III không hoạt động. Người ta báo cáo rằng tác dụng ức chế này có thể bị khuất phục bởi quá trình oxy hóa VA thành gốc cation VA 1 . LiP oxy hóa các gốc cation VA thành VA, hoạt động như một chất trung gian oxy hóa khử để khử màu sắc tố melanin. VA là hợp chất tự nhiên được sản xuất từ ​​nấm mục trắng được cho là ít tác dụng phụ. Tuy nhiên, sự hiện diện của chất trung gian VA đã dẫn đến tỷ lệ tử vong cao của các sinh vật được thử nghiệm, so với tác dụng gây độc tế bào thấp của melanin và LiP được xử lý. Nó nên được thử nghiệm cẩn thận trong công thức của các sản phẩm chăm sóc sức khỏe và chăm sóc da.

Nguyên liệu và phương pháp

Phân lập và định danh chủng vi nấm.Việc phân lập nấm được thực hiện từ một địa điểm bị ô nhiễm được sử dụng làm bãi chứa nguyên liệu gỗ trong một thời gian dài. Mẫu được lấy trong chai vô trùng và chuyển đến phòng thí nghiệm để tinh chế. Quá trình tinh sạch được thực hiện trên môi trường thạch đường dextrose trên biển. Bốn khuẩn lạc nấm khác nhau đã được phân lập và tinh chế từ mẫu. Sàng lọc chủng tốt nhất được thực hiện dựa trên quá trình khử màu melanin và sản xuất sinh khối với sự có mặt của melanin là nguồn carbon duy nhất trong môi trường muối khoáng (MSM). Dựa trên quá trình sàng lọc, sinh vật được chọn đã được xác định bằng cách giải trình tự DNA của 5,8S rRNA và 18S rRNA bằng cách sử dụng đoạn mồi phổ quát ITS-1 và ITS-4 10. DNA bộ gen của chúng được chiết xuất theo phương pháp của Anderson et al. 19. Sau khi tinh sạch, tiến hành giải trình tự các sản phẩm PCR. Các trình tự được căn chỉnh bằng công cụ BLAST tại NCBI và các điểm tương đồng được phân tích về phát sinh loài bằng Phân tích di truyền tiến hóa phân tử (MEGA). Dựa trên khả năng tối đa, một cây liên kết với hàng xóm đã được xây dựng để xác định chủng nấm đã phân lập. Các trình tự đã được gửi tới NCBI GenBank với số gia nhập là KX064682.1. Phân tích phát sinh loài cho thấy rằng phân lập KX064682.1 là một chủng Phanerochaete chrysosporium NK-1.

Xét nghiệm mảng để khử màu melanin.Nấm thối trắng, Phanerochaete chrysosporium NK-1, được sử dụng để khử màu sắc tố melanin. Phanerochaete chrysosporium được biết là sản xuất LiP. Melanin tổng hợp (B049-97–6) đã được sử dụng làm melanin mẫu trong tất cả các thí nghiệm khử màu melanin. Môi trường biến tính với VA 2 làm chất cảm ứng LiP được sử dụng để kiểm tra khả năng khử màu melanin của nấm. Đĩa Petri được sử dụng để nuôi cấy Phanerochaete chrysosporium NK-1. Môi trường được chuẩn bị bằng cách hòa tan 10 g glucose, 2 g chiết xuất mạch nha, 4 g MgSO4·7H2O, 1 g KH2PO4, 0.01 g FeSO4, 0,005 g ZnSO4, 0,2 g melanin tổng hợp và 15 g thạch trong 1-L nước cất. Các đĩa Petri đã cấy được ủ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Mức độ mà melanin bị đổi màu bên dưới và xung quanh thuộc địa của nấm đã được quan sát. Người ta phát hiện ra rằng loại nấm này có khả năng khử màu sắc tố melanin và tiếp tục được sử dụng để điều chế các dung dịch enzym.

Điều chế enzyme khử màu melanin.Môi trường nuôi cấy lỏng chứa 10 g glucose, 0.2 g chiết xuất men, 0.07 g VA, 3.{{13 }} g axit tartaric, 1 g tween 80, 0.2 g KH2PO4, 0.146 g CaCl2·2H2O, 0.157 g của K2HPO4, 0.05 g MgSO4·7H2O, 42,5 mg ZnSO4·7H2O, 7.0 mg CoCl2·6H2O, 7.0 mg CuCl2·2H2O, 0,54 mg FeCl3, 0,9 mg NaCl và 0,2 mg melanin tổng hợp trên mỗi lít nước cất 20. Độ pH của môi trường được điều chỉnh về 4,0 bằng dung dịch NaOH và HCl. Các bình 250 ml chứa các phần của môi trường nuôi cấy 100 ml được hấp khử trùng và cấy với 5 ml chất cấy. Các bình sau đó được ủ trên máy lắc quay ở 30 độ trong 15 ngày. Các mẫu trùng lặp được thu thập cho các thử nghiệm hoạt động LiP trong khoảng thời gian 24 giờ.

xét nghiệm enzym.Thuốc thử cho xét nghiệm LiP bao gồm dung dịch đệm natri tartrat 250 mM pH 5,5, 10 mM VA và 4 mM H2O2 (30 phần trăm ). Thử nghiệm enzyme được thực hiện trong cuvette silica và độ hấp thụ được đo ở bước sóng 310nm bằng máy quang phổ UV-có thể nhìn thấy (Shimadzu, Kyoto, Nhật Bản). Độ hấp thụ được theo dõi tại các thời điểm 0–30 giây trong điều kiện môi trường xung quanh. Hoạt tính của enzyme được tính toán theo Định luật Beer, Eq. (1)21.

Trong đó c, là nồng độ của các loài suy giảm; A là độ hấp thụ quang học; ε là hệ số suy giảm mol; d là chiều dài của đường quang. Đo lường hoạt động của enzyme liên quan đến việc xác định sự thay đổi nồng độ theo thời gian, Eq. (2).

Tối ưu hóa để tăng cường sản xuất LiP và khử màu sắc tố melanin trong ống nghiệm.Việc tối ưu hóa để tăng cường sản xuất LiP từ Phanerochaete chrysosporium NK-1 sử dụng melanin làm chất nền được thực hiện bằng cách sử dụng thiết kế Placket Burman. Một Placket có độ dài đầy đủ dựa trên thực tế là nó làm suy yếu các hiệu ứng tương tác giữa các biến khác nhau trong khi nó chỉ xem xét các xu hướng tuyến tính, Eq. (3)22.

trong đó Y đại diện cho câu trả lời và các ký hiệu cho biết hệ số hồi quy và k là số yếu tố được nghiên cứu. Tổng cộng có 9 yếu tố đã được nghiên cứu để đạt được nồng độ LiP cao nhất từ ​​Phanerochaete chrysosporium NK-1 để khử màu sắc tố melanin có trong môi trường. Thiết kế của Placket–Miến Điện được xây dựng với tổng số 12 lần chạy thử nghiệm, như thể hiện trong Bảng 2. Các thử nghiệm được tiến hành trong tổng cộng 35 ngày và đo lường phản ứng (hoạt độ LiP IU/mL). Dữ liệu thử nghiệm được phân tích bằng phần mềm thống kê 'Design Expert 9'. Môi trường được tối ưu hóa đã được sử dụng để tăng cường sản xuất LiP và được tinh chế bằng kết tủa amoni.

Tối ưu hóa quá trình sản xuất và tinh chế enzyme.Một môi trường ngập nước đã được sử dụng để xác định thời gian ủ tối ưu về các hoạt động LiP. Như thể hiện trong Hình bổ sung 1, dung dịch nuôi cấy có hoạt tính enzym tối đa vào ngày thứ 8, là 140 IU/ml. Do đó, thời gian ủ 8 ngày được sử dụng để sản xuất dung dịch enzyme.

Tổng số 12 lần chạy thử nghiệm đã được thực hiện để xác định các yếu tố (9) có tác động đến hoạt động LiP. Trong số các thử nghiệm, các giá trị phản hồi của hoạt động LiP nằm trong khoảng từ 171 IU/ml đến 576 IU/ml, như thể hiện trong Hình 2 được bổ sung. Các lần chạy có hoạt động LiP cao nhất là lần chạy 3 (576 IU/ml), sau đó là lần chạy 10 (547 IU/ml). Theo phân tích hồi quy, nhiệt độ, thời gian, nồng độ glucose, nồng độ cơ chất và chất trung gian có tác động tích cực đến hoạt động của LiP. Hiệu quả của chiết xuất nấm men đã được tìm thấy là không đáng kể. Các yếu tố khác có tác động tiêu cực. Điều kiện tối ưu để sản xuất LiP là thời gian: 35 ngày, nhiệt độ: 40 độ, glucose (mỗi lít): 20 g, fructose: 10 g, chiết xuất nấm men: 2 g, peptone: 2 g, chất cấy: 10 ml, chất trung gian cơ chất: 0,1ml. Những điều kiện này sau đó được sử dụng để tăng cường sản xuất LiP được tinh chế bằng phương pháp kết tủa amoni và sắc ký gel (Sephadex G-75).

Quá trình chiết xuất enzyme ở pH, nhiệt độ và thời gian ủ tối ưu đã được tiến hành. Cột lọc gel Sephadex G75 được sử dụng để tách một phần hàm lượng protein khỏi dịch ly giải tế bào liên quan đến gradien mật độ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sự phong phú của protein trong dịch chiết thô cũng được biểu thị thông qua số lượng dải xuất hiện trên phân tích gel natri dodecyl polyacrylamide (SDS-PAGE). Trọng lượng phân tử của enzyme đã tinh chế là 46.0 kDa như được tính toán từ phân tích SDS-PAGE (Hình 3 được bổ sung). Hoạt tính enzym sau khi kết tủa amoni và tinh chế bằng sắc ký gel lần lượt là 684.0 và 957,6 IU/ml.

Enzyme tinh khiết được sử dụng để khử màu melanin ở các điều kiện hóa lý khác nhau, bao gồm pH, nhiệt độ, thời gian ủ và nồng độ enzyme. Hắc tố tổng hợp (B049-97-6) đã được sử dụng làm hắc tố mô hình trong tất cả các thí nghiệm khử màu hắc tố theo 23.

Thí nghiệm khử màu.Ảnh hưởng của pH đến quá trình khử màu của melanin. Để quan sát ảnh hưởng của độ pH đối với quá trình khử màu của hắc tố bằng LiP, các phản ứng khử màu của hắc tố được thực hiện ở độ pH kéo dài từ 2.0–6.0. Hỗn hợp phản ứng chứa 10 µl enzyme thô được hòa tan trong dung dịch đệm TE và 1990 µl 0,02 phần trăm w/v melanin. Những phản ứng này được thực hiện cả khi có và không có VA. Các hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ 30 độ trong 6 giờ. Các thí nghiệm đối chứng được tiến hành song song bằng cách thay thế LiP hoạt tính bằng enzym biến tính được đun sôi ở 95 độ . Các hỗn hợp phản ứng được theo dõi để khử màu melanin bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 540 nm trước và sau khi ủ. Hiệu quả khử màu của enzyme được biểu thị bằng phần trăm (%). Sự khử màu của melanin được tính bằng phương trình. (4) 11.

Ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình khử màu của melanin. Để tối ưu hóa thời gian ủ, các phản ứng khử màu melanin được thực hiện ở thời gian ủ kéo dài từ 2–10 giờ. Hỗn hợp phản ứng chứa 10 µl enzyme thô được hòa tan trong dung dịch đệm và 1990 µl 0,02% w/v melanin ở pH 4 khi có và không có VA. Các hỗn hợp phản ứng sau đó được ủ ở nhiệt độ 30 độ và thu được phần trăm sự khử màu của melanin.

Phân tích SEM của melanin bị thoái hóa. Những thay đổi về hình thái bề mặt của hắc tố được phân tích bằng kính hiển vi điện tử quét (JEOL JSM-5910, Peabody, MA, USA) 24. Hắc tố chưa xử lý được sử dụng làm đối chứng. Các mẫu được sấy khô và cố định trên cuống đồng (10×10mm2 ) bằng băng keo carbon hai mặt (dính cả hai mặt). Các cuống được rửa bằng chất tẩy rửa và sấy khô bằng máy sấy súng nhiệt (KADA 85U/SMD) ở 200 độ trong 2 phút trước khi cố định mẫu. Dẫn truyền dán bạc (SPI-CHEM, West Chester, PA, USA) đã được sử dụng để đảm bảo dẫn truyền chùm tia điện tử. Vàng được lắng đọng trên mẫu bằng plasma được tạo ra với điện áp cao (dòng điện 25 mA trong 50 giây) và điều kiện chân không (10−2 ATM). Hình thái bề mặt của các mẫu được kiểm tra ở độ phóng đại 3000.

Phân tích FTIR của melanin bị khử màu.Các phản ứng hoặc mẫu cho thấy sự khử màu sắc tố melanin cao nhất trong thí nghiệm tối ưu hóa được phân tích kỹ hơn bằng quang phổ FTIR (Model No 56, Merlin, Germany). Các mẫu được ly tâm (10,000 vòng/phút trong 1 phút) và sấy khô trong không khí như một bước chuẩn bị cho phân tích FTIR 20. Phân tích định tính các mẫu melanin được thực hiện bằng máy quang phổ cận hồng ngoại (NIR) UV–Vis Dụng cụ Lambda 900/Perkin Elmer. Phổ được ghi lại trong khoảng 1000 đến 3500 cm−1. Các mẫu được chuẩn bị ở dạng viên KBr với sự phân tán bột. Melanin tổng hợp chưa được xử lý đã được sử dụng làm đối chứng trong phân tích này.

Độc tính tế bào của melanin và LiP bị thoái hóa.Thử nghiệm khả năng gây chết tôm ngâm nước muối đã được tiến hành để kiểm tra khả năng gây độc tế bào của hắc tố melanin 14,15 bị thoái hóa. Trứng tôm ngâm nước muối được ấp trong đĩa hình chữ nhật có nước biển nhân tạo. Đĩa có một ngăn nhựa có lỗ nhỏ và chia đĩa thành hai ngăn không bằng nhau. Những quả trứng được đặt trong ngăn lớn hơn và được che phủ để tránh ánh sáng lọt vào, trong khi ngăn nhỏ hơn được chiếu sáng bằng đèn phía trên. Ấu trùng nở ra bị ánh sáng thu hút về phía ngăn nhỏ. Sau 48 giờ ủ, nauplii trưởng thành được thu thập từ ngăn sáng bằng cách sử dụng pipet đã thanh trùng.

Phân tích thống kê.Dữ liệu thử nghiệm được phân tích bằng phần mềm thống kê 'Design Expert 9'. Hình ảnh đồ họa được vẽ bằng cách sử dụng ba thử nghiệm thử nghiệm với độ lệch chuẩn được tính toán. Ý nghĩa thống kê của lần chạy thử nghiệm được tính toán bằng ANOVA.

Dữ liệu sẵn có

Người giới thiệu

4. Clarkson, TW, Magos, L. & Myers, GJ Te độc ​​tính của thủy ngân—sự phơi nhiễm hiện tại và các biểu hiện lâm sàng. N. Anh. J. Med. 349, 1731–1737 (2003).

5. Lynde, C., Kraf, J. & Lynde, C. Phương pháp điều trị tại chỗ cho nám và tăng sắc tố sau viêm. Lett trị liệu da. 11, 1–6 (2006).

6. Hughes, J. & Rustin, M. Corticosteroid. lâm sàng. da liễu. 15, 715–721 (1997).

7. Płonka, P. & Grabacka, M. Tổng hợp hắc tố trong vi sinh vật: khía cạnh công nghệ sinh học và y tế. Acta Biochim. Pol. 53, 423–443 (2006).

8. Lim, Y.-J. et al. Tác dụng ức chế của arbutin đối với quá trình sinh tổng hợp melanin của quá trình tăng sắc tố do hormone kích thích -melanocyte gây ra trong các mô da lợn guinea màu nâu được nuôi cấy. Vòm. Res dược phẩm. 32, 367–373 (2009).

9. Petit, L. & Pierard, G. Xem xét lại các sản phẩm làm sáng da. quốc tế J. Mỹ phẩm. Khoa học. 25, 169–181 (2003).

10. Rättö, M., Chatani, M., Ritschkof, A.-C. & Viikari, L. Sàng lọc các vi sinh vật để khử màu sắc tố melanin do nấm nhuộm xanh tạo ra. ứng dụng vi sinh vật. công nghệ sinh học. 55, 210–213 (2001).

11. Nagasaki, K. và cộng sự. Tinh chế, đặc tính hóa và nhân bản gen của Ceriporiopsis sp. chủng MD-1 peroxidase làm mất màu sắc tố tóc của con người. ứng dụng môi trường. vi sinh vật. 74, 5106–5112 (2008).

12. Ruiz-Dueñas, FJ & Martínez, Á. T. Sự phân hủy lignin do vi sinh vật: làm thế nào một polyme cứng đầu cồng kềnh được tái chế một cách hiệu quả trong tự nhiên và làm thế nào chúng ta có thể tận dụng điều này. Vi khuẩn. công nghệ sinh học. 2, 164–177 (2009).

13. Holmes, EW & Tompson, KD (Bằng sáng chế của Google, 2014).

14. Baravalia, Y., Vaghasiya, Y. & Chanda, S. Độc tính tế bào tôm ngâm nước muối, đặc tính chống viêm và giảm đau của Woodfordia fruticosa Kurz fowers. Iran. J.Pharm. Res.: IJPR 11, 851 (2012).

15. Milhem, MM, Al-Hiyasat, AS & Darmani, H. Thử nghiệm độc tính của vật liệu nha khoa phục hồi sử dụng ấu trùng tôm ngâm nước muối (Artemia salina). J. Ứng dụng. Khoa học miệng.

16, 297–301 (2008). 16. Falade, AO et al. Các chức năng của lignin peroxidase và các ứng dụng trong tương lai. Vi sinh mở 6, e00394.

17. Sung, HJ Khử màu hắc tố bằng lignin peroxidase với H2O2 được tạo ra tại chỗ cho ứng dụng mỹ phẩm làm trắng (2020).

18. Pérez, J., Munoz-Dorado, J., De la Rubia, T. & Martinez, J. Phân hủy sinh học và xử lý sinh học cellulose, hemiaellulose và lignin: tổng quan. quốc tế vi sinh vật. 5, 53–63 (2002).

19. Anderson, MJ, Gull, K. & Denning, DW Định dạng phân tử bằng cách khuếch đại ngẫu nhiên DNA đa hình và phép lai phía nam M13 của các chủng Aspergillus fumigatus bắt cặp có liên quan. J. Lâm sàng. vi sinh vật. 34, 87–93 (1996).

20. Sabar, MA và cộng sự. Sự xuống cấp của than cấp thấp bởi Rhizopus oryzae được phân lập từ một mỏ than ở Pakistan và sự giải phóng các chất hữu cơ tăng cường của nó. Nhiên liệu 253, 257–265 (2019).

21. Yadav, M., Singh, S. & Yadava, S. Tinh chế, đặc tính hóa và hoạt động khử trùng hợp than của lignin peroxidase từ Lenzitus betulina MTCC-1183. ứng dụng hóa sinh. vi sinh vật. 48, 583–589 (2012).

22. Mohan, S., Viruthagiri, T. & Arunkumar, C. Ứng dụng thiết kế Plackett–Burman để sàng lọc các thành phần môi trường để sản xuất tannase từ vỏ trấu bằng cách sử dụng quá trình lên men chìm. quốc tế J.Pharm. độ phân giải Rev. 2, 24–29 (2013).

23. Woo, SH, Cho, JS, Lee, BS & Kim, EK Sự khử màu của hắc tố bởi lignin peroxidase từ Phanerochaete chrysosporium. công nghệ sinh học. quá trình sinh học. Tiếng Anh 9, 256 (2004).

24. Karp, JM và cộng sự. Nuôi cấy tế bào gốc phôi người mà không có bước cơ thể phôi giúp tăng cường quá trình tạo xương trong ống nghiệm. Tế bào gốc 24, 835–843 (2006).

Nhìn nhận

Sự đóng góp của tác giả

Lợi ích cạnh tranh

nhà xuất bảnghi chúSpringer Nature vẫn giữ thái độ trung lập về các tuyên bố về quyền tài phán trong các bản đồ đã xuất bản và các tổ chức liên kết.

Để biết thêm thông tin: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501